孫延慧 王鳳超

蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，安徽省蚌埠市 233004

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（Neutrophil gelatinas assoeiated lipoealin，NGAL）作為新型腎損傷標志物成為最近研究的熱點。NGAL是25KD的新型小分子蛋白質，1993年Kjeldsen［1］在研究中性粒細胞中MMP－9時發(fā)現的。NGAL具有多種生物功能，參與人體內重要的生理、生化過程：疏水性小分子的運輸作用、細胞內鐵離子的轉運、腫瘤細胞轉移等。近年來發(fā)現NGAL在缺血性腎損傷及腎毒性因素所致腎損傷中高表達，動物試驗發(fā)現其可能具有治療作用，因此成為腎臟疾病相關分子研究的熱點，本文就其研究進展情況進行綜述。

1 NGAL的結構特點

NGAL是由NGAL基因編碼的一種蛋白質，編碼基因的全長為5 869bp，其中包括1 695bp的5’端非轉錄區(qū)，178bp的3’端非轉錄區(qū)，其原初轉錄區(qū)（Primery transcribed region）是由七個外顯子和六個內含子構成的3 696bp基因段［2］。配對的cDNA全序列由63bp的5’端非翻譯區(qū)和591bp的編碼區(qū)組成，含有可以編碼197個氨基酸殘基肽鏈的密碼子。NGAL不但可以以單體形式存在，而且還可以以多聚體的形式共存，例如在中性粒細胞的一些特殊顆粒中，NGAL可與金屬蛋白酶（MMP－9）共價結合，形成1 351KD的異二聚體，在中性粒細胞的另一些特殊顆粒中NGAL與金屬蛋白酶無關而單獨存在。

2 NGAL的組織分布及功能

近年研究顯示NGAL不但組織分布廣泛，而且可能參與多種重要的生理、生物化學過程：細胞的分化及凋亡、胚胎的發(fā)育、細胞炎癥反應及機體免疫應答、脂質代謝、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。生理狀態(tài)下，NGAL主要存在于中性粒細胞中過氧化物酶陰性顆粒中，小腸潘氏細胞、腎近曲小管細胞、肝膽管細胞、胃壁細胞等也有少量表達，但在腦及周圍神經、心臟等組織細胞中卻呈陰性表達。NGAL以25KDa的單體、45KDa同二聚體及135KDa異二聚體三種不同的分子形式存在于中性粒細胞、血漿及尿液。腎臟上皮細胞主要以單體形式分泌NGAL［3，4］，在 腎 臟 中 性 粒 細 胞 的NGAL則 以 二 聚體的形式釋放［5，6］。鑒于目前NGAL的功能尚未完全明了，根據目前研究推測其有重要的防御及免疫功能：（1）先天性宿主防御功能，NGAL存在于一些與防御微生物有關的細胞如小腸的潘氏細胞等，已有研究表明潘氏細胞中NGAL可以抑制微生物的生長，通過與小腸微生物競爭對鐵的吸收作用。它也可以干擾細菌能量代謝，通過結合細菌分泌的一種鐵離子配合物（扣留鐵離子），這種結合具有高度的親和力，主要以氫鍵和范德華力維系，形成牢固的NGAL·Fe·Ent三元復合物［7］，因此NGAL是免疫系統(tǒng)中參與干擾細菌代謝的一個抗菌蛋白；（2）NGAL與T細胞的成熟密切相關，NGAL在胸腺由上皮細胞構成的Hassall’s小體亦高表達，其免疫學研究價值不可忽略［8］。另有研究發(fā)現NGAL與泌尿道感染有關，在沒有急性腎損傷（Acute kidney injury，AKI）及泌尿道感染患者的尿液中也發(fā)現了NGAL水平的升高［9，10］，其意義尚不明確。

3 NGAL在診斷早期腎損傷的應用

3.1 NGAL與急性腎損傷 腎臟發(fā)育基本特征是間質細胞向上皮細胞轉化，這種細胞類型的轉變受分泌因子調節(jié)［11］，NGAL與腎小管發(fā)育及修復最為緊密，在生理情況下，它可以促進腎臟祖細胞轉化為腎小管上皮細胞，使腎臟生長發(fā)育、基本結構得以形成和維持的重要分子，在腎缺血或急性腎毒性損害的病理情況下，高表達于受損的腎小管，NGAL蛋白可以誘導腎小管上皮細胞修復再生，使腎臟功能得以恢復。對兒童和成人的心臟術后前瞻性研究發(fā)現，在術后2～6h，其血液和尿液中就能檢測到NGAL，其濃度是正常值的10倍以上［12］，尿NGAL上升是心臟手術后急性腎損傷的早期跡象［13］。Haase等［14］對NGAL預測AKI的敏感性、特異性進行了薈萃分析，其準確性為75%～95%。Brunner與Hinze分別對325例有免疫性或感染性腎病的患者、4 000多例有AKI可能的患者進行了NGAL檢測［15］，發(fā)現有損傷患者的NGAL要高于沒有腎損傷患者，根據NGAL的水平可提前1～3d預測AKI，提前12周預測慢性活動性腎病，可提前3個月診斷系統(tǒng)性狼瘡腎病，且NGAL的水平與腎損傷的程度具有相關性。2011年M.Haase等［16］又利用ROC曲線對NGAL預測AKI進行了探討，其中曲線下的面積為0.78，敏感性76%，特異性80%，不聯合肌酐檢測，NGAL獨立可以預測亞臨床的AKI。2012年Ampatzidou F［17］等研究發(fā)現NGAL是搭橋手術后預測急性腎損傷的“急性分子”。2013年最新研究發(fā)現NGAL同白介素－18（interleukin－18，IL－18）、微球蛋白（microalbumin，MA）、N－acetyl－β－D－glucosaminidase（NAG）、α1－微球蛋白（α1－microglobulin，α1－MG）及肌酐（creatinine，UCr）相比，是預測搭橋后急性腎損傷的最佳分子［18］。

3.2 NGAL與慢性腎損傷 NGAL在腎間質纖維化早期發(fā)揮負向調節(jié)作用，對調節(jié)MMP－9／TIMP－1的平衡亦發(fā)揮重要作用［19］。M.Haase［20］等對慢性進展腎病患者（主要是免疫相關的：狼瘡腎病、LgA腎病、NACa動脈炎等）、感染性損傷（腹瀉溶血性尿毒綜合征）及其他原因造成的腎損傷患者（敗血癥、嚴重的臨床疾病、心臟手術、腎移植及腎毒性藥物）進行了研究，研究發(fā)現，在AKI的患者中NGAL的表達明顯上調，認為NGAL是很具有預測潛力的分子，并且NGAL上調的幅度與損傷的炎癥程度及持續(xù)時間相關。

3.3 NGAL免疫相關腎病 王素梅等［21］對99例T2DM（2型糖尿?。┗颊?，根據尿白蛋白排泄率（Urinary albumin excretion rates，UAER）分組檢測NGAL等指標，發(fā)現在UARE＜20μg／min時，患者的血清中NGAL水平大幅升高，且隨著病情的加重NGAL水平亦逐漸增加?；颊哐錘GAL水平可反映腎損害的嚴重程度，是反應早期腎損害的敏感指標之一。Nielsen SE［22］發(fā)現在T1DM（1型糖尿?。┗颊咧?，尿NGAL水平隨尿白蛋白量增加而增加，且這種變化出現于T1DM腎病的早期，提示在T1DM中尿NGAL可作為早期DN（糖尿病腎?。┠I小管損傷的診斷依據。

4 NGAL的檢測

在不同實驗研究中NGAL預測AKI的能力波動很大，隨著研究的深入，發(fā)現不同形式NGAL具有不同的代謝機制，尿液中NGAL的單體和二聚體的來源可能由不同的機制參與，腎小管上皮細胞NGAL主要以單體形式釋放，因此檢測方法根據標本來源及組織不同有不同檢測方法，檢測技術不斷提高。

4.1 免疫組織化學染色 基于免疫學的基本原理——抗原、抗體特異性結合反應，通過顯色劑標記特異性抗體，化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定細胞、亞細胞水平的抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定量的研究，能準確的定位NGAL在腎臟的表達。

4.2 酶聯免疫吸附法（ELISA） 將已知濃度的NGAL標準品、未知濃度的樣品分別加入微孔酶標板內進行檢測。NGAL和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP酶標志物。再一次溫育、洗滌，去除游離酶結合物，然后加入底物顯色，樣品中NGAL的濃度與顏色的深淺呈正比例關系。

4.3 化學發(fā)光微粒子免疫檢測法（CMIA） 采用兩步法免疫檢測原理，用包被了單克隆抗體的微粒子與樣本中的NGNL結合，反應洗滌后再加入吖啶酯標記的NGNL抗體復合物來定量檢測患者樣本中的NGNL，該方法操作簡便，可于全自動分析儀上，僅需微量的血漿或者尿液，在短時間（30min）內得到NGAL的定量結果，因此用于臨床NGAL的快速定量檢測，為臨床提供早期診斷具有較大價值。

5 展望

NGAL具有防御、免疫及調節(jié)等多種功能，作為早期腎損傷的標記物，可以較血肌酐、白介素－18等經典的腎臟損傷標記物更早的發(fā)現腎臟損傷，為臨床及時治療早期腎臟損傷提供參考價值；動物試驗顯示可能其具有一定的治療功能，可能為腎臟疾病的治療提供新的途徑。由于檢測NGAL影響因素較多，各種方法之間的可比性的研究尚未深入，實驗室質量控制尚未開展等問題的存在，廣泛應用于臨床尚需要進一步的研究。

［1］ Mishra J，Mor IK，Ma Q，et al.Amelioration of ischemic acute renal injury by neutrophi l gelatinase－associated lipocalin〔J〕.Am Soc Nephrol，2004，15：30732－30821.

［2］ Kjeldsen L，Johnsen AH，Sengelov，et al.Isolation andprimary stucture of NGAL，a novel protein associated with neutrophil gelatinase〔J〕.Biol Chem，1993，268（14）：10425－10432.

［3］ Cai L，Rubin J，Han W，et al.The origin of multiple mole cular forms in urine of HNL／NGAL〔J〕.Clin J Am Soc Nephrol，2010，5：2229－2235.

［4］ Kjeldsen L，Johnsen AH，Sengelov H，et al.Isolation and primary structure of NGAL，a novel protein associated with neutrophil gelatinase〔J〕.Biol Chem，1993，268（14）：10425－10432.

［5］ Cai L，Borowiec J，Xu S，et al.Assays of urine levels of HNL／NGAL in patients undergoing cardiac surgery and the impact of antibody configuration on their clinical performances〔J〕.Clin Chim Acta，2009，403：121－125.

［6］ Awad AS，Rouse M，Huang L，et al.Compartmentalization of neutrophils in the kidney and lung following acute ischemic kidney injury〔J〕.Kidney Int，2009，75：689－698.

［7］ Friedl A，Stoesz SP，Buckley P，et al.Neutrophil gelatinaseassociated lipocalin in normal and neoplastic human tissues，cell type－specific pattern of espression〔J〕.Histochem J，1999，31（7）：433－441.

［8］ Prasad Devarajan.Neutrophil gelatinase－associated lipocalin：new paths for an old shuttle〔J〕.Cancer Ther，2007，5（B）：463－470.

［9］ Yilmaz A，Sevketoglu E，Gedikbasi A，et al.Early prediction of urinary tract infec－tion with urinary neutrophil gelatinase associated lipocalin〔J〕.Pediatr Nephrol，2009，24：2387－2392.

［10］ Decavele AS，Dhondt L，et al.Increased urinary neutrophil gelatinase associated lipocalin in urinary tract infections and leukocyturia〔J〕.Clin Chem Lab Med，2011，49：999－1003.

［11］ Barasch J，Yang J，Ware C，et al.Mesen chymal to epithelial conversion in rat metanephros is induced by LIF〔J〕.Cell，1999，99（4）：377－386.

［12］ Hirsch R，Dent C，Pfriem H，et al.NGAL is an early predictive biomarker of contrast－induced nephropathy in children〔J〕.Pediatr Nephrol，2007，22（12）：2089－2095.

［13］ Heise D，Rentsch K，et al.Comparison of urinary neutrophil glucosaminidase－associated Lipocalin，Cystatin C，and a1－microglobulin for early detection of acute renal injury after cardiac surgery〔J〕.Eur J Cardiothorac Surg，2011，39（1）：38.

［14］ Haase M，Bellomo R，Devarajan P，et al.Accuracy of Neutrophil Gelatinase－Associated Lipocalin（NGAL）in diagnosis and prognosis in acute kidney injury（AKI）：a systematic review and meta－analysis〔J〕.Am J Kidney Dis，2009，54：1012.

［15］ Hinze CH，Suzuki M，Klein－Gitelman M，et al.Neutrophil Gelatinase－Associated Lipocalin is a predictor of the course of global and renal childhood－onset systemic lupus erythematosus disease activity〔J〕.Arthritis Rheum，2009，60：2772.

［16］ Haase M，Haase－Fielitz A.NGAL－From discovery to a new era of“Acute Renal Disease”diagnosis？〔J〕.Clinical Biochemistry，2011，44：499－500.

［17］ Ampatzidou F，Koutsogiannidis CP，Ananiadou O，et al.Neutrophil gelatinase－associated lipocalin as emerging biomarker of acute renal failure in renal transplant patient after coronary artery bypass surgery〔J〕.J Cardiovasc Surg（Torino），2012，53（6）：805－808.

［18］ Zheng J，Xiao Y，Yao Y，et al.Comparison of urinary biomarkers for early detection of acute kidney injury after cardiopulmonary bypass surgery in infants and young children〔J〕.Pediatr Cardiol，2013，34（4）：880－886.

［19］ 于永剛，劉剛，梁毅文，等.NGAL、MMP－9及TIMP－1在單側輸尿管梗阻大鼠腎組織中的表達〔J〕.臨床泌尿外科雜志，2010，25（7）：542－549.

［20］ Haase M，Haase－Fielitz A.Acute kidney injury after cardiac surgery：early diagnosis with neutrophil gelatinase－associated lipocalin〔J〕.Med Klin（Munich），2011，106：474－479.

［21］ 王素梅，劉樹業(yè).2型糖尿病腎病患者血清中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白檢測及意義的觀察〔J〕.中國糖尿病雜志，2013，21（2）：133－135.

［22］ Nielsen SE，Hansen HP，Jensen BR，et al.Urinary neutrophil gelatinase－associated Lipocalin and progression of diabetic Nephropathy in type 1diadetic patient in a four－year follow－up study〔J〕.Nephron Clin Pract，2011，118：c130－c135.