馬新喆，張娟娟，呂 洋(綜述)，王海萍(審校)

(河北北方學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北 張家口 075000)

近些年來，心血管疾病越來越引起人們的重視，隨著生活節(jié)奏的加快，死于心血管疾病的人數(shù)日益增加，心肌梗死、心力衰竭等成為常見病。心肌細胞是終末分化細胞[1-2]?，F(xiàn)有的醫(yī)療水平和治療方法無法從根本上修復(fù)壞死的心肌細胞，如何改善心肌功能，提高心肌效率，從細胞水平上預(yù)防和治療疾病，成為一項重要的課題。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有向心肌分化的潛能，使得BMSCs成為細胞移植治療心肌損傷最有前途的細胞來源之一[3-4]。誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌細胞成為國內(nèi)外該領(lǐng)域的研究熱點。目前已發(fā)現(xiàn)多種誘導(dǎo)劑能作用于BMSCs使其分化為心肌樣細胞[5-6]。本文對研究BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細胞的檢測指標(biāo)進行綜述。

1 結(jié)蛋白與α肌動蛋白

結(jié)蛋白與α肌動蛋白作為心肌細胞分化的早期標(biāo)志已經(jīng)得到了公認，是目前用來特異性檢測心肌細胞應(yīng)用次數(shù)最多也是最普遍的指標(biāo)。結(jié)蛋白是最早表達于未分化的肌母細胞中的肌源性蛋白，在肌源性細胞發(fā)育、成熟的過程中起重要作用，能夠維持肌纖維形態(tài)，連接細胞核與細胞膜，從而使肌小節(jié)之間發(fā)生信號聯(lián)系。α肌動蛋白是肌動蛋白的一種亞型，是骨骼肌和心肌中具有特異性收縮功能的細胞骨架蛋白，為胎兒或新生兒心室肌的主要成分。指導(dǎo)α肌動蛋白組織特異性表達的是α肌動蛋白啟動子。α肌動蛋白啟動子是心肌細胞高表達的強啟動子，在心肌細胞或心肌組織中高效表達，在其啟動子區(qū)域有轉(zhuǎn)錄因子的特定結(jié)合序列，表達受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。Klug等[7]采用人類α肌動蛋白啟動子來篩選純化人類胚胎干細胞分化的心肌細胞，得到了99%純的心肌細胞。

結(jié)蛋白和α肌動蛋白的表達陽性說明BMSCs發(fā)生了肌源性分化。華聲瑜等[8]通過研究丹酚酸B對大鼠BMSCs分化過程中結(jié)蛋白、α肌動蛋白信使RNA表達的影響的結(jié)果顯示，5-氮胞苷組和5-氮胞苷+丹酚酸B組各樣本中均出現(xiàn)明確的心肌早期分化基因；與5-氮胞苷組相比，5-氮胞苷+丹酚酸B組的結(jié)蛋白和α肌動蛋白信使RNA的表達顯著增加，中藥單體丹酚酸B對BMSCs向心肌細胞的分化具有一定的誘導(dǎo)或促進作用。

2 肌鈣蛋白

肌鈣蛋白是一種調(diào)節(jié)蛋白，分子呈球形，包括三個亞單位：肌鈣蛋白I是抑制亞單位，可抑制肌球蛋白與肌動蛋白結(jié)合，阻止肌肉收縮；肌鈣蛋白C是鈣離子受體，與Ca2+結(jié)合，活化細肌絲，相對分子質(zhì)量為18×103；肌鈣蛋白T能將肌鈣蛋白附著在原肌球蛋白上，使原肌球蛋白與肌鈣蛋白結(jié)合成原肌球蛋白-肌鈣蛋白復(fù)合物，并附著在肌動蛋白雙股螺旋狀的縱溝內(nèi)[9]。肌肉的調(diào)節(jié)由Ca2+介導(dǎo)，影響到肌動蛋白、甲胎蛋白酶的活性與肌球蛋白結(jié)合的效果。

肌鈣蛋白I為單一多肽鏈，其相對分子質(zhì)量隨各亞型不同而異。肌鈣蛋白I有三種亞型，由不同的基因編碼，分別定位于骨骼肌快肌、慢肌以及心肌中。心肌肌鈣蛋白I(cardiac-specific troponin I，cTnI)以兩種形式存在于心肌細胞內(nèi)：小部分(約3%)游離于胞質(zhì)中，為可溶性；大部分以結(jié)構(gòu)蛋白的形式固定于肌原纖維上，為不可溶性。正常人血液中cTnI的水平一般<0.3 μg/L，當(dāng)肌細胞受到損傷時，游離的cTnI先釋放入血，隨著損傷加重，結(jié)合部分的cTnI被降解從而不斷釋放入血，導(dǎo)致血中cTnI持續(xù)升高。研究表明，成人的骨骼肌組織在任何階段中都不表達cTnI，也不因任何病理刺激表達肌鈣蛋白[10]。所以，cTnI有較高的心肌特異性，是檢測心肌損傷和鑒定心肌源性細胞的特異性生化標(biāo)志物，其表達陽性可以說明BMSCs發(fā)生心肌轉(zhuǎn)化。張宇等[11]研究發(fā)現(xiàn)，通過免疫組織化學(xué)染色的方法檢測到實驗組胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒狀復(fù)合物，呈陽性表達，而對照組呈弱陽性或陰性，從而確定5-氮胞苷能夠誘導(dǎo)BMSCs向心肌細胞轉(zhuǎn)化。

3 間隙連接蛋白43

心肌細胞的縫隙連接是心臟電生理一致性的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。間隙連接蛋白43(connexin-43，Cx43)主要存在于心房和心室肌細胞連接處，在正常心臟組織細胞中表達。Cx43參與細胞間縫隙連接，是分化細胞與宿主細胞形成興奮收縮耦聯(lián)同步的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)。Cx43基因DNA長約2768 bp，其中開放讀碼框為1146 bp，編碼378個氨基酸的單肽，因其相對分子質(zhì)量約為43×103，故命名為Cx43。Cx43是心肌細胞縫隙連接的特征性蛋白，其表達陽性說明心肌間閏盤的形成[12]。Cx43對于細胞間化學(xué)信息的交流和電沖動的傳導(dǎo)，維持電活動和機械收縮、舒張功能的同步性，以及心肌功能的保持非常重要，是目前檢測心肌閏盤的常用指標(biāo)。賈敏等[13]在研究BMSCs分離培養(yǎng)及向心肌細胞轉(zhuǎn)化的過程中，通過免疫細胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)cTnT和Cx43表達陽性，說明分化的細胞具有心肌細胞特性。

4 肌細胞增強子2

肌細胞增強子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MADS-Box家族，是一種特定的轉(zhuǎn)錄因子。在脊椎動物中，MEF2家族的轉(zhuǎn)錄因子有四個成員，分別是MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D。MEF2蛋白的結(jié)構(gòu)分為N端和C端，其N端在不同物種中幾乎相同，都含有一個MADS-Box結(jié)構(gòu)域和一個直接與其相鄰的MEF2結(jié)構(gòu)域。MADS-Box是由57個氨基酸組成的DNA結(jié)構(gòu)域，不同脊椎動物中具有高度保守性。MEF2結(jié)構(gòu)域由MADS-Box附近的29個氨基酸組成，是MEF2因子所特有的結(jié)構(gòu)域[14]。MEF2C在心臟發(fā)育中表達，并且作為心臟特異性的轉(zhuǎn)錄因子參與心臟發(fā)育的各個過程，調(diào)節(jié)心臟特異性基因的表達。MEF2C與其他成員相比，其表達組織特異性比較顯著。

5 心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白4

GATA是一種組織特異性表達的轉(zhuǎn)錄因子家族。脊椎動物有6個GATA轉(zhuǎn)錄因子，其中心肌轉(zhuǎn)錄因子GATA-4在心臟發(fā)育最早期表達，是調(diào)控心肌基因表達的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與了心臟正常發(fā)育、功能基因表達和心肌肥大的病理過程，是心肌前體細胞最早的標(biāo)志之一。人類GATA-4基因是一類含有鋅指結(jié)構(gòu)的組織特異性表達的轉(zhuǎn)錄因子，能結(jié)合共同序列(A/T)GATA(A/G)。GATA-4位于人類染色體8p23.1～p22，總長度為55 757 bp，有7個外顯子，cDNA全長3372 bp，編碼序列全長1329 bp。文通等[15]研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs轉(zhuǎn)染microRNA-1后，心肌重要轉(zhuǎn)錄因子GATA-4和MEF2C表達逐漸上調(diào)，轉(zhuǎn)染后6 d，心肌特異性蛋白cTnI表達呈陽性，結(jié)果表明，microRNA-1能誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細胞分化。

6 心肌早期轉(zhuǎn)錄因子Csx/Nkx2.5

Csx/Nkx2.5是背側(cè)中胚層形成所必需的，它在心肌開始分化前即開始表達，是所有脊椎動物心臟發(fā)生中最早表達的轉(zhuǎn)錄因子，即心臟前體細胞最早的標(biāo)志物。隨著對心臟發(fā)育機制和相關(guān)信號通路研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)MEF2C、Csx/Nkx2.5和GATA-4等轉(zhuǎn)錄因子可以作為心臟細胞分化過程中特異性的標(biāo)志[16]。Vincentz等[17]的研究證實，Nkx2.5是心肌發(fā)育過程中起決定性作用的基因，MEF2C與Nkx2.5之間的相互作用對心臟(尤其是心室)發(fā)育至關(guān)重要。

伍長學(xué)等[18]的研究結(jié)果驗證了電學(xué)因素在心臟發(fā)育過程中具有重要意義的理論假設(shè),該實驗結(jié)果顯示，在各時間點5-氮胞苷誘導(dǎo)+電刺激組GATA-4、NKx2.5 和MEF2C基因表達量顯著高于單純5-氮胞苷誘導(dǎo)組，且兩組的表達規(guī)律相似；通過蛋白定量分析發(fā)現(xiàn)，在各個時間點前組肌鈣蛋白I、結(jié)蛋白、Cx43顯著高于后組，通過這種對應(yīng)關(guān)系，推測GTAT-4、NKx2.5和MEF2C基因參與調(diào)控心肌細胞的形成過程，而電刺激通過上調(diào)GATA-4、NKx2.5和MEF2C基因的表達，進而促進肌鈣蛋白I、結(jié)蛋白和Cx43蛋白的表達和心肌細胞的形成。

7 超極化激活的核酸環(huán)化酶門控的離子通道

心肌組織的節(jié)律性活動(如心跳、呼吸等)均依賴于其中所含的一種能產(chǎn)生起搏電流的起搏細胞，這種電流最初由Di Francesco在20世紀(jì)80年代初研究兔竇房結(jié)起搏活動時發(fā)現(xiàn)，并稱之為特種離子流。在此之前，Noma和Irisawa已經(jīng)在研究竇房結(jié)起搏活動時發(fā)現(xiàn)這一離子流并命名為過渡激活正離子流，現(xiàn)稱為超極化激活及環(huán)化核苷酸門控陽離子通道(hyperpolarization activated,cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)[19]。HCN所具有的超極化激活鈉鉀離子通道、細胞內(nèi)環(huán)腺苷酸的調(diào)節(jié)及微弱的單通道電導(dǎo)等被認為是起搏活動所必須的獨特特征，稱為起搏電流[19]。在脊椎動物，HCN家族中包含4個成員，即HCN1、HCN2、HCN3、HCN4。HCN4基因位于人染色體15q23～q24上，全長共5065 bp，含有8個外顯子，相對分子質(zhì)量為129.1×103[20]。HCN基因家族中不同亞型的基本序列60%大體一致。HCN3特征性地僅在中樞中表達。HCN4基因的編碼產(chǎn)物HCN4蛋白由1203個氨基酸組成，包含了6個跨膜部分(S1～S6)。HCN1、HCN2和HCN4在心臟中表達豐富，而根據(jù)原位雜交分析HCN的表達在竇房結(jié)中依次為HCN4>HCN2>HCN1。因此，可以通過檢測HCN4、HCN2和起搏電流判定BMSCs分化為心肌細胞。

8 肌球蛋白重鏈

已知哺乳動物的心臟表達兩種肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)，即α-MHC和β-MHC，這些基因表達產(chǎn)物在肌球蛋白分子中形成二聚體，存在3種分子異構(gòu)體，即Vl(A-A同二聚體)、V2(A-B異二聚體)、V3(B-B同二聚體)。MHC具有兩個生物學(xué)作用：一是具有腺苷三磷酸酶活性，裂解腺苷三磷酸，能夠有效地將高能磷酸化合物分解釋放的化學(xué)能轉(zhuǎn)變成動能；二是具有與肌動蛋白結(jié)合的能力[21]。α-MHC見于胚胎型心肌細胞，而β-MHC在成熟心肌細胞中表達。β-MHC蛋白水平能夠在一定程度上反映BMSCs向心肌細胞的分化情況，其基因表達水平是觀察BMSCs向成熟心肌樣細胞分化的重要指標(biāo)之一[22]。冼紹祥等[23]在研究三七總皂苷對BMSCs增殖和向心肌樣細胞分化的影響的實驗中，分別檢測正常大鼠心肌細胞和誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后4周細胞的α-MHC和β-MHC信使RNA的表達，發(fā)現(xiàn)經(jīng)三七總皂苷、5-氮胞苷誘導(dǎo)24 h后繼續(xù)培養(yǎng)，BMSCs能表達α-MHC 和β-MHC。

9 小 結(jié)

作為判定BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細胞的檢測指標(biāo)結(jié)蛋白，α肌動蛋白、肌鈣蛋白、Cx43、GATA-4等已經(jīng)得到普遍應(yīng)用，隨著這些檢測指標(biāo)的應(yīng)用，為BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細胞提供了理論支持。然而BMSCs分化為心肌樣細胞仍存在如何更好分離和純化BMSCs、最佳誘導(dǎo)劑的選擇、臨床應(yīng)用的安全性以及如何提高誘導(dǎo)分化率等問題。隨著更多誘導(dǎo)劑的發(fā)現(xiàn)以及更有效的心肌特異性檢測指標(biāo)的研究，BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細胞的前景會越來越廣闊，干細胞移植將會給更多心腦血管疾病的患者帶來福音。

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