金 雷，陳 瑜，嚴(yán)忠雍，郭遠(yuǎn)明，祝 銀，龍 舉，顧蓓喬,*

（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316100；2.浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316100）

鄰苯二甲酸二丁酯高效降解菌H-2的分離鑒定及其降解特性

金 雷1,2，陳 瑜1，嚴(yán)忠雍1，郭遠(yuǎn)明1，祝 銀1，龍 舉1，顧蓓喬1,*

（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316100；2.浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316100）

為了獲得高效廣譜的鄰苯二甲酸二丁酯（di-n-butyl phthalate，DBP）降解菌，本研究從長期受食品塑料垃圾污染的土壤中通過富集培養(yǎng)和分離純化，獲得一株DBP高效降解菌，命名為H-2。根據(jù)菌株的形態(tài)、生理生化特征和16S rRNA序列分析，將其鑒定為類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）。運(yùn)用高效液相色譜法分析了菌株H-2對DBP的降解特性及對鄰苯二甲酸酯類化合物的廣譜性降解情況。結(jié)果表明：菌株H-2降解DBP的最適溫度為30 ℃，最適pH值為7.0；在此最適條件下，菌株H-2在3 d內(nèi)對100 mg/L DBP的降解率高達(dá)87.6%。菌株H-2能高效降解短鏈鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯和DBP，而對長鏈鄰苯二甲酸二辛酯的降解效果較差。

鄰苯二甲酸二丁酯；類芽孢桿菌屬；降解特性；降解譜

鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）是一類被廣泛使用的有機(jī)化合物，在食品領(lǐng)域常用于食品塑料包裝袋、塑料保鮮膜、盛裝食物的塑膠容器等的合成[1]。塑料是食品包裝的主要材料，常常與食品直接接觸，由于PAEs在加工、加熱、包裝、盛裝的過程中很容易溶出而滲入食物中，嚴(yán)重威脅著食品安全[2-3]。已有研究表明，PAEs即使在較低的濃度下，對人的內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)也會造成較大的影響[4]。另有研究表明，PAEs對植物也有毒害作用[5]。因此，美國環(huán)保局、中國環(huán)監(jiān)站以及歐盟都將鄰苯二甲酸酯類化合物列為優(yōu)先控制污染物[6-7]。鄰苯二甲酸二丁酯（di-n-butyl phthalate，DBP）是PAEs中重要的一種。研究表明，DBP的降解主要有生物降解和非生物降解兩種，而微生物降解是其降解的主要途徑[8-9]。目前國內(nèi)外有關(guān)DBP降解的微生物菌株包括：Delfia sp.[3]、Sphingomonsa sp.[10]、Arthrobacter sp.[11-12]、Gordonia sp.[13]、Rhodococcus sp.[14]、Acinetobacter calcoaceticus[15]和Pseudomonas aeruginosa[15]等。但已報(bào)道的菌株能高效降解DBP且能降解多種鄰苯二甲酸酯類化合物的還較少，因此篩選高效廣譜的DBP降解菌非常必要。

本實(shí)驗(yàn)從長期受食品塑料垃圾污染的土壤中分離到1 株DBP高效降解菌株H-2，經(jīng)鑒定為類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）。目前，國內(nèi)外鮮有見類芽孢桿菌降解DBP的報(bào)道。該菌株能高效降解DBP，3 d內(nèi)對質(zhì)量濃度為100 mg/L DBP的降解率高達(dá)87.6%。本實(shí)驗(yàn)還對菌株的降解特性和廣譜性進(jìn)行了初步研究，以期為進(jìn)一步探明DBP的降解機(jī)理及將其應(yīng)用于消除食品塑料垃圾的PAEs殘留污染提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

浙江省舟山市普陀區(qū)某長期堆放食品塑料垃圾的污染土壤。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基（g/L）：KH2PO43.0、K2HPO4·3H2O 1.5、NH4NO32.0、MgSO4·7H2O 0.1、CaCl20.01、乙二胺四乙酸二鈉0.01，pH 7.5，121 ℃滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉5.0、蛋白胨10.0、NaCl 10.0，pH 7.0，固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂，121 ℃滅菌30 min。

二氯甲烷（分析純）、甲醇溶液（色譜純）、無水硫酸鈉 上海試劑總廠；鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP，分析純）、鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP，分析純）、鄰苯二甲酸二丁酯（di-nbutyl phthalate，DBP，分析純）、鄰苯二甲酸二辛酯（dioctyl phthalate，DOP，分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；Waters e2695/Waters 2489 UV型高效液相色譜 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 降解菌株的分離篩選與純化

稱取土樣5 g，置于裝有100 mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（含DBP 20 mg/L）的250 mL三角瓶中，160 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)7 d。之后以10%的接種量每隔7 d轉(zhuǎn)接1 次，并逐漸提高培養(yǎng)基中DBP的質(zhì)量濃度至100 mg/L。連續(xù)轉(zhuǎn)接3 次后驗(yàn)證降解效果，取0.2 mL具有降解能力的富集液涂布在固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基（含DBP 100 mg/L）平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)。將平板上生長出的單菌落轉(zhuǎn)接至無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（含DBP 100 mg/L）試管中，160 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)，驗(yàn)證單菌的降解效果。

1.3.2 菌株的生理生化鑒定

菌株形態(tài)及生理生化特性鑒定參見東秀珠等[16]的方法。

1.3.3 16S rRNA基因序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及測序

首先提取H-2的基因組DNA作為為模板，然后在PCR儀上進(jìn)行16S rRNA基因的擴(kuò)增[17]，所用引物、擴(kuò)增體系及PCR的反應(yīng)條件參照倪俊等[18]方法。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增片段的大?。?.5 kb左右），采用PCR回收試劑盒回收16S rRNA的基因片段，T/A克隆后進(jìn)行測序[19]。測序工作由上海英濰捷基公司完成，將擴(kuò)得的長度為1 424 bp的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

1.3.4 溶液中DBP的檢測

采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，將待測溶液加入等體積的二氯甲烷，劇烈振蕩后放入搖床，160 r/min振蕩30 min。室溫下靜置分層后棄上層水相，有機(jī)相過無水硫酸鈉柱，取1.0 mL置于離心管中，氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL甲醇（色譜純）溶解，再用孔徑為0.22 μm的有機(jī)相過濾器過濾，利用HPLC測定液體中DBP的含量。

HPLC條件：色譜柱：Thermo syncronis-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（90：10，V/V）；檢測器波長：230 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.5 菌株降解特性的研究

1.3.5.1 種子液的制備

將LB固體培養(yǎng)基上的單菌落轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基試管中，160 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)2 d后離心收集菌體，用無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基重懸，并調(diào)整菌液濃度約為OD600nm=1.0，即為種子液。

1.3.5.2 菌株對DBP的生長與降解曲線

以2%的接種量將上述種子液接種到100 mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（含DBP 100 mg/L）中，以接種滅活的菌株H-2為對照，160 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)。每12 h定時(shí)取樣測定OD600nm值，并用高效液相色譜法檢測溶液中DBP的含量。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行分析處理。降解率的計(jì)算見下式。

式中：ρ1為降解菌處理后DBP質(zhì)量濃度/（mg/L）；ρ0為對照處理后DBP質(zhì)量濃度/（mg/L）。

1.3.5.3 不同因子對菌株降解DBP的影響

按上述研究方法，設(shè)定不同的培養(yǎng)溫度和初始pH值，3 d定時(shí)取樣測定菌株的生長量及DBP的降解情況，以此考察其對菌株H-2生長及降解能力的影響。

1.3.5.4 菌株對不同鄰苯二甲酸酯的降解情況

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別添加100 mg/L的DMP、DEP、DBP和DOP為唯一碳源，按上述研究方法測定菌株對不同鄰苯二甲酸酯的降解情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株H-2的分離、形態(tài)學(xué)及生理生化特征

通過富集馴化，分離純化獲得一株能以鄰苯二甲酸二丁酯為唯一碳源生長的DBP高效降解菌株，將其命名為H-2，該菌株革蘭氏染色顯陽性，菌落形態(tài)和電鏡照片如圖1所示。菌株H-2在LB固體平板上生長36 h后，菌落呈淺黃色，大小為2～3 mm，圓形，表面光滑，邊緣整齊，不透明；電子顯微鏡下觀察，菌株呈桿狀，大小為（3.2～3.3） μm×（0.7～0.8） μm，兩端端生鞭毛，無莢膜，產(chǎn)芽孢。

圖1 菌株H-2的菌落形態(tài)（a）和電鏡照片（b）（標(biāo)尺為1 μm）Fig.1 Colony morphology (a) and electronic micrograph (b) (Bar, 1 μmm) of strain H-2

生理生化實(shí)驗(yàn)研究表明，菌株H-2對接觸酶、氧化酶、淀粉水解、V-P反應(yīng)和硝酸鹽還原為陽性；酪氨酸水解、脲酶、硫化氫反應(yīng)、吲哚反應(yīng)、檸檬酸鹽利用為陰性；對四環(huán)素、鏈霉素及卡那霉素抗性。

2.2 菌株16S rRNA的相似性分析

圖2 菌株H-2的16S rRNA電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis pattern of 16S rRNA from strain H-2

提取H-2的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。產(chǎn)物經(jīng)回收、T/A克隆后送至上海英濰捷基公司進(jìn)行測序，測得16S rRNA基因片段的長度為1 424 bp，將此序列在GenBank上登錄（登錄號為KF495601）。同時(shí)在美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站（National Center of Biotechnology Information，NCBI）上進(jìn)行基因同源性比對，結(jié)果顯示H-2菌株與Paenibacillus chibensis JCM 9905T（NO.AB073194）的16S rRNA基因序列的相似性為100%。通過個(gè)體形態(tài)學(xué)、生理生化，再結(jié)合菌株H-2的16S rRNA基因的同源性分析，最終將H-2鑒定為類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.），圖3為菌株H-2的系統(tǒng)發(fā)育樹。）

圖3 菌株H-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain H-2

2.3 菌株H-2降解特性的研究

2.3.1 菌株H-2的生長與對DBP降解曲線

圖4 菌株H-2利用鄰苯二甲酸二丁酯的生長和降解曲線Fig.4 The growth curve and DBP degradation curves of strain H-2

將菌株H-2的種子液以2%的接種量接種到無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（含DBP 100 mg/L）中，每12 h定時(shí)取樣一次測定OD600nm值和DBP的殘留量，連續(xù)取樣3 d，設(shè)接種滅活的H-2為對照。由圖4可知，菌株H-2能利用DBP為唯一碳源生長，菌株的降解能力與生長量呈一定的正相關(guān)，在培養(yǎng)初期降解較緩慢，但在12 h以后隨著菌體濃度的增大DBP開始快速降解，3 d內(nèi)對質(zhì)量濃度為100 mg/L DBP的降解率高達(dá)87.6%。

2.3.2 培養(yǎng)溫度對菌株H-2降解DBP的影響

圖5 溫度對菌株H-2降解鄰苯二甲酸二丁酯的影響Fig.5 Effect of temperature on DBP degradation by strain H-2

以2%接種量將菌株H-2的種子液接種至pH 7.0的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（含DBP 100 mg/L）中，分別放置于溫度為10、20、30、37、40、50 ℃，160 r/min的搖床中培養(yǎng)，3 d后定時(shí)取樣測定OD600nm值和DBP的殘留量。由圖5可知，溫度在20～40 ℃時(shí)菌株H-2的生長和對DBP的降解效果較好，而10 ℃的低溫和50 ℃的高溫抑制了菌株的生長，進(jìn)而影響了菌株對DBP的降解，結(jié)果表明菌株H-2對DBP的最適降解溫度為30 ℃。

2.3.3 初始pH值對菌株H-2降解DBP的影響

圖6 pH值對菌株H-2降解鄰苯二甲酸二丁酯的影響Fig.6 Effect of pH on DBP degradation by strain H-2

菌株H-2的種子液以2%的接種量接種于無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（含DBP 100 mg/L）中，將培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，于160 r/min、30 ℃培養(yǎng)，3 d后定時(shí)取樣測定OD600nm值和DBP的殘留量。由圖6可知，菌株H-2在pH 6.0～8.0之間表現(xiàn)出良好的生長和降解效果，而在較低pH值（4.0、5.0）和較高pH值（9.0、10.0）條件下其生長和對DBP的降解受到抑制，研究結(jié)果表明菌株對DBP的最適降解pH值為7.0。

2.3.4 菌株H-2的降解譜

圖7 菌株H-2對不同鄰苯二甲酸酯的降解Fig.7 Degradation rates of different PAEs by strain H-2

將洗滌的菌株H-2的種子液以2%的接種量接種到無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，分別以100 mg/L的DMP、DEP、DBP和DOP為唯一碳源，160 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)3 d，測定菌株H-2對這些鄰苯二甲酸酯的降解情況。由圖7可知，菌株H-2對短鏈鄰苯二甲酸酯（DMP、DEP和DBP）的降解效果較好，而對長鏈的DOP的降解效果較差。

3 結(jié)論與討論

類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）是由Ash等[21]在1993年從芽孢桿菌屬中分離出來建立的新屬。該類細(xì)菌具有生長快、營養(yǎng)簡單、能夠形成較強(qiáng)抗逆力芽孢、活菌數(shù)量高、性能穩(wěn)定等優(yōu)勢，而備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。近年來有不少類芽孢桿菌屬降解菌的報(bào)道：劉海燕等[22]分離到一株能降解微囊藻毒素的類芽孢桿菌；任明[23]和安霞[24]等分別獲得一株能高效降解氯氰菊酯的類芽孢桿菌。因此類芽孢桿菌在有機(jī)污染物的生物降解中占有重要的地位。本實(shí)驗(yàn)從長期受食品塑料垃圾污染的土壤中分離到一株DBP高效降解菌株H-2，通過個(gè)體形態(tài)學(xué)、生理生化，再結(jié)合菌株H-2的16S rRNA基因的同源性分析，將其鑒定為類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）。目前，有關(guān)類芽孢桿菌屬菌株降解DBP還鮮有報(bào)道。菌株H-2降解DBP的最適溫度為30 ℃，最適pH值為7.0；在最適條件下，H-2在3 d內(nèi)對質(zhì)量濃度為100 mg/L DBP的降解率高達(dá)87.6%。此外，H-2能高效降解DMP和DEP。研究表明，H-2是一株性能良好的DBP高效降解菌，在消除食品塑料垃圾的PAEs殘留污染方面具有獨(dú)特的應(yīng)用潛力。

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Isolation and Identification of a Di-n-butyl phthalate (DBP)-Degrading Strain H-2 and Its Degradation Characteristics

JIN Lei1,2, CHEN Yu1, YAN Zhong-yong1, GUO Yuan-ming1, ZHU Yin1, LONG Ju1, GU Bei-qiao1,*
(1. Marine Fishery Research Institute of Zhejiang Province, Zhoushan 316100, China; 2. Zhejiang Province Key Laboratory of Mariculture and Enhancement, Zhoushan 316100, China)

A broad-spectrum and efficient di-n-butyl phthalate (DBP)-degrading bacterial strain H-2 was isolated from plastic food packaging garbage-contaminated soil by enrichment culture and purification. Based on its morphological, physiobiochemical characteristicsand 16S rRNA gene sequence, strain H-2 was identified as Paenibacillus sp. By high performance liquid chromatography (HPLC), its DBP degrading characteristics and diversity of de gradable substrates were studied. The results showed that the optimal temperature and pH for DBP degradation by strain H-2 was 30 ℃ and 7.0, respectively. Under these conditions, H-2 degraded more than 87.6% of 100 mg/L DBP within 3 d. The diversity of degradable substrates showed that strain H-2 could degrade phthalate (DMP), DEP and DBP efficiently, while DOP was degraded difficultly by strain H-2. This research may provide the theoretical basis to decontaminate PAEs pollution of plastic food packaging garbage.

di-n-butyl phthalate; Paenibacillus sp.; degradation characteristics; degradation spectrum

Q939.96

A

1002-6630（2014）15-0202-05

10.7506/spkx1002-6630-201415041

2013-08-01

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012F20026）；2012年度浙江省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（2012C13005）

金雷（1987—），男，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称泛铜h(huán)境微生物。E-mail：jinlei2388@126.com

*通信作者：顧蓓喬（1963—），男，工程師，本科，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：gubeiqiao@zjou.edu.cn