朱振元，薛 婧，劉曉翠，孟 夢(mèng)，唐亞麗，張 軍，郭 蓉

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

葛根素及葛根異黃酮對(duì)小鼠急性醉酒預(yù)防和解酒效果的研究

朱振元，薛 婧，劉曉翠，孟 夢(mèng)，唐亞麗，張 軍，郭 蓉

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

目的：研究葛根素及葛根異黃酮對(duì)小鼠急性防醉解酒的效果。方法：將小鼠隨機(jī)分成5 組，標(biāo)記為對(duì)照組、葛根粗提物組、葛根異黃酮組、60%葛根素組、99%葛根素組。禁食（不禁水）1 2 h后，每組灌胃等劑量的對(duì)應(yīng)物50%丙二醇水溶液（對(duì)照組灌胃50%丙二醇水溶液），30 min后灌胃等劑量56°紅星二鍋頭，觀察其醉酒時(shí)間與醒酒時(shí)間以研究不同含量葛根素對(duì)小鼠急性防醉解酒的效果，并在給酒后持續(xù)檢測(cè)小鼠血液中的乙醇含量，以表征不同時(shí)段小鼠的醉酒程度。將另一批小鼠隨機(jī)分為4 組，禁食（不禁水）12 h后，分別按100、200、300、400 mg/kg（以體質(zhì)量計(jì)，葛根異黃酮中葛根素含量約為22.13%）劑量灌胃，醉酒時(shí)間與醒酒時(shí)間以研究葛根素防醉解酒的最佳給藥量。結(jié)果：隨著所給藥物中葛根素含量的增高，小鼠急性醉酒的醉酒時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，醒酒時(shí)間逐漸縮短。隨著葛根素含量的增高，藥品解酒防醉的效果越好，但在300 mg/kg（以 體質(zhì)量計(jì)）之后，變化趨于緩和。結(jié)論：葛根素對(duì)小鼠急性防 醉解酒有較好的預(yù)防效果，葛根中其他異黃酮類物質(zhì)與葛根素有相似的防醉解酒功效。

葛根素；葛根異黃酮；小鼠；急性解酒防醉；醉酒時(shí)間；醒酒時(shí)間

葛根始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代本草均有記載，今為常用生藥，被國家衛(wèi)生部列入“既是食品又是藥品”名錄。葛根含有多種有效成分，主要為異黃酮類化合物：大豆苷元（daidzein）、大豆苷（daidzin）、4,7-二葡萄糖大豆苷、3’-甲氧基葛根素、7-木糖一葛根素、4’,6’-二乙酞基一葛根素等[1]，但以葛根素的含量最高。《中國藥典2010》中記載，葛根味甘辛，性涼，入脾、胃、肺經(jīng)，有解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽止瀉，通絡(luò)活絡(luò)，解酒毒之功能[2]。葛根作為中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中最具代表性的解酒藥物之一，具有解酒防醉、改善心腦血管循環(huán)、降低心肌耗氧量，降低血糖，防止高血壓及動(dòng)脈硬化，抗肝臟毒，抗炎，祛痰，解熱，提高機(jī)體免疫力，抗菌，抗病毒等多種藥理作用[3],可有效提高肝臟乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）與乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）的活性，其解酒作用與增強(qiáng)乙醇的生物轉(zhuǎn)化有關(guān)，從乙醇的吸收、代謝、排泄3 個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮解酒作用，對(duì)急、慢性酒精中毒均能發(fā)揮解酒作用。

目前為止，有關(guān)葛根解酒多偏向于急、慢性酒精中毒模型下葛根的保肝護(hù)肝及其他功效[4]，但是對(duì)于急性解酒防醉方面的研究卻鮮有成效。此外，有關(guān)葛根解酒防醉的功效成分的研究也很少，而市場(chǎng)對(duì)于功效明確、成分清楚的急性防醉解酒產(chǎn)品的需求卻與日俱增?；诖朔N現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)研究了葛根對(duì)小鼠急性防醉解酒的效果及其功效成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根 毫州市永剛飲片有限公司；廣西粉葛，批號(hào)：120715；酒（56°紅星二鍋頭） 北京紅星股份有限公司；60%葛根素（批號(hào)：121010，HPLC測(cè)試含量為60.73%）、99%葛根素（批號(hào)：120905，HPLC測(cè)試含量為99.08%） 陜西中鑫生物技術(shù)有限公司。

JR-2集熱式磁力加熱攪拌器 天津歐諾儀器儀表有限公司；ESJ205-4電子天平 沈陽龍騰電子稱量?jī)x器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LC-10ATVP高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 動(dòng)物

昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量25～30 g，天津市西青區(qū)博為生物制品經(jīng)營部提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK津2012- 0001。

1.3 方法

1.3.1 葛根素的提取

葛根粗提物：將葛根飲片粉碎過篩，加8 倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇加熱80 ℃回流并磁力攪拌，提取3 次，每次2 h，過濾，合并濾液，濃縮干燥，制得葛根粗提物。

葛根異黃酮：將制得的粗提物溶解后，過AB-8型大孔吸附樹脂柱：正確裝柱且用蒸餾水沖洗至平衡后上樣，吸附 0.5 h，然后用蒸餾水沖洗1 h，再用乙醇梯度洗脫，收集目標(biāo)洗脫液，濃縮干燥，制得葛根異黃酮粉末[5]。

1.3.2 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定葛根素含量

參考GB/T22251—2008《保健食品中葛根素的測(cè)定》，采用HPLC法測(cè)定葛根粗提物、葛根異黃酮、60%葛根素、99%葛根素中葛根素的含量。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)處理

選用天津市西青區(qū)博為生物制品經(jīng)營部提供的25～30 g雄性昆明鼠60 只，隨機(jī)分組。醉酒狀態(tài)判定：給酒后將小鼠背部朝下，四肢朝上觀察其翻正反射是否消失，消失且持續(xù)30 s即可判定為醉酒狀態(tài)。醒酒狀態(tài)判定：進(jìn)入醉酒狀態(tài)后，觀察其翻正反射是否恢復(fù)，翻身時(shí)間短于30 s即可判定為醒酒狀態(tài)。

1.3.3.1 給酒量選擇實(shí)驗(yàn)

禁食（不禁水）12 h后，分別按10、12.5、15、20 mL/kg劑量灌胃，觀察記錄未醉只數(shù)、死亡只數(shù)、醉酒時(shí)間與醒酒時(shí)間（醉酒時(shí)間：灌胃到翻正反射消失的時(shí)間，醒酒時(shí)間：翻正反射消失到恢復(fù)的時(shí)間。下同）。選擇未醉率與死亡率都較低，醉酒時(shí)間與醒酒時(shí)間適中的給酒量進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.2 葛根素梯度灌胃實(shí)驗(yàn)

禁食（不禁水）12 h后[6]，分別用葛根粗提物、葛根異黃酮、60%葛根素、99%葛根素配制30 mg/mL的50%丙二醇水溶液，按給藥量為200 mg/kg灌胃（以體質(zhì)量計(jì)，下同）[7]，30 min后灌胃12.5 mL/kg酒，觀察記錄醉酒時(shí)間與醒酒時(shí)間。

1.3.3.3 急性酒精中毒小鼠血液乙醇含量的測(cè)定

采用乙醇脫氫酶法[8]測(cè)定小鼠血液中乙醇的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：將正常小鼠摘眼球取血，加肝素抗凝后，按全血與生理鹽水體積比1∶3混勻，得到稀釋血液。以上述血稀釋液配制乙醇質(zhì)量濃度分別為500、1 000、1 500、2 000、2 500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL，加4%高氯酸4.0 mL，混勻，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，吸取上清液各0.1 mL，各加乙醇脫氫酶-氧化型煙酞胺腺嚓吟二核昔酸（alcohol dehydrogenase-nicotinamide adenine dinucleotide，ADH-NAD）液4.9 mL，36 ℃水浴1 h，按紫外分光光度法在340 nm波長(zhǎng)處，以蒸餾水為空白對(duì)照，測(cè)定各管吸光度。以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，相應(yīng)乙醇質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.009 9x-0.036 7（R2=0.999 5）。

樣品測(cè)定：將小鼠按1.3.3.2節(jié)葛根素梯度灌胃實(shí)驗(yàn)中的方法予以分組、灌胃（對(duì)照組灌胃等計(jì)量生理鹽水）。給酒后30、60、90、120、180、240、300、360 min對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶取血。加肝素后，取抗凝血0.25 mL，加生理鹽水0.75 mL，4%高氯酸4.0 mL后立即測(cè)定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得每一吸光度所對(duì)應(yīng)的的乙醇質(zhì)量濃度再乘以稀釋倍數(shù)即可得到樣品血液中的乙醇含量。

1.3.3.4 葛根素用藥量選擇實(shí)驗(yàn)

禁食（不禁水）12 h后，分別用葛根異黃酮?jiǎng)┝繛?00、200、300、400 mg/kg灌胃[9]，30 min后灌胃12.5 mL/kg酒，觀察記錄醉酒時(shí)間與醒酒時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC法測(cè)定各灌胃藥品中葛根素含量

圖1 高效液相圖譜結(jié)果Fig.1 Results of HPLC

在HPLC法[10]測(cè)定的葛根素在各灌胃藥品中含量不一，葛根粗提物為1.895%，葛根異黃酮為11.012%，60%的葛根素為66.722%，99%的葛根素為98.552%，依次增高，梯度明顯。圖1為葛根素和葛根異黃酮的HPLC圖譜。

CBL組學(xué)員主要以病例講解為主，以小組形式開展討論式教學(xué)，由帶教教師課前將EUS下膽道胰腺正常解剖結(jié)構(gòu)、典型圖例和經(jīng)典EUS下病例圖像、患者病史及信息進(jìn)行整理，在授課中采用先播放患者信息、病史、體格檢查等一般資料，然后將典型EUS下圖像逐一展示，鼓勵(lì)學(xué)員分組討論，擬定初步診斷結(jié)果以及列舉診斷依據(jù)，討論之后向?qū)W員講解診斷結(jié)果，并指出誤診原因以及診斷流程和診斷圖像特征。

2.2 給酒量選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 不同給酒量對(duì)小鼠的影響Table 1 Effect of different amounts of Erguotou liquor on mice

由表1可知，20 mL/kg組有死亡現(xiàn)象，10 mL/kg有未醉現(xiàn)象，均不適合作為實(shí)驗(yàn)的給酒劑量。12.5 mL/kg組與15 mL/kg組比較，12.5 mL/kg組的醉酒時(shí)間和醒酒時(shí)間的長(zhǎng)度均比較適合，故選擇12.5 mL/k g為下述實(shí)驗(yàn)的給酒量。

2.3 葛根素梯度灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 等劑量不同灌胃藥物對(duì)小鼠的影響Table 2 Effect of different drugs orally administered at the same dosage on mice

由表2可知，隨著葛根素含量的升高，醉酒時(shí)間逐漸延長(zhǎng)、醒酒時(shí)間逐漸縮短，即可說明葛根素有明顯的解酒防醉功效。與此同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)葛根異黃酮組與60%葛根素組的數(shù)據(jù)差距甚小，分析其原因，可能是葛根中有除葛根素以外的異黃酮類物質(zhì)，與葛根素有相似的功效。由圖1d可知，除了在3.831 min處有明顯的葛根素吸收峰外，其周圍還有一些小而零散的異黃酮吸收峰，這些物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上與葛根素高度相似，由此可推斷它們與葛根素有相似的功效。

2.4 急性酒精中毒小鼠血液乙醇含量的測(cè)定結(jié)果

圖2 不同含量葛根素對(duì)急性酒精中毒小鼠血液乙醇含量的影響Fig.2 Effects of different contents of puerarin on the concentrationof ethanol in blood of mice

2.5 葛根素用藥量的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 不同含量葛根異黃酮對(duì)小鼠的影響Table 3 Effect of different doses of pueraria on mice

由表3可知，隨著葛根素用藥量的增加，醉酒時(shí)間逐漸延長(zhǎng)、醒酒時(shí)間逐漸縮短，之后則變化趨于緩和。因此，選擇葛根異黃酮300 mg/kg為最優(yōu)用藥量，折合葛根素33.039 mg/kg。

3 討 論

酒精進(jìn)入人體后，主要通過以下4 個(gè)途徑進(jìn)行代謝[11]：1）部分乙醇在胃黏膜氧化脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）作用下首過代謝（firstpassmetabolism，F(xiàn)PM），從而減少了進(jìn)入機(jī)體的乙醇總量。2）肝細(xì)胞內(nèi)的乙醇脫氫酶氧化途徑，可產(chǎn)生自由基，引起氧化應(yīng)激。3）肝微粒體內(nèi)的乙醇氧化酶系（microsomal ethanol oxidizing system，MEOS）系統(tǒng)。4）肝過氧化酶體內(nèi)的觸酶（過氧化物酶）。

由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著灌胃藥品中葛根素濃度的不斷升高，小鼠的醉酒時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，醒酒時(shí)間逐漸縮短，說明葛根素在機(jī)體急性防醉解酒方面有出色的功效。宋浩亮等[12]經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明了葛根素對(duì)飲酒后小鼠的異常行為的改變和肌體內(nèi)氧化反應(yīng)有明顯的拮抗作用，能起到保護(hù)機(jī)體細(xì)胞的作用。Zhang Rongrong等[13]經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明了葛根提取物有抑制乙醇導(dǎo)致的腸道通透性增加，改善乙醇所導(dǎo)致的腸屏障功能紊亂的功能。Lee等[14]認(rèn)為葛根水提物能通過促進(jìn)脂質(zhì)物質(zhì)代謝和提高肝中抗氧化酶的活性，從而降低乙醇及其代謝物的危害。日本福岡大學(xué)的金城順英和熊本大學(xué)原野稔私認(rèn)為葛根異黃酮可通過機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)發(fā)揮協(xié)調(diào)作用，改善酒精引起的新陳代謝異常[15]。中島嘉次郎[16]通過實(shí)驗(yàn)證明葛根異黃酮能保護(hù)胃黏膜以及激活消化管，促進(jìn)小鼠消化道的輸送功能。與此同時(shí)，雖然葛根異黃酮中的葛根素含量明顯低于60%葛根素，但這兩組的數(shù)據(jù)卻并無太大差異，說明葛根中的其他異黃酮類物質(zhì)與葛根素同有解酒防醉的功效，或者與葛根素有協(xié)同的作用。葛根中各種異黃酮的結(jié)構(gòu)本就大體類似，在葛根異黃酮的HPLC圖譜中，葛根素的特征吸收峰附近存在幾個(gè)其他異黃酮的吸收峰，雖然小卻與葛根素吸收峰的位置接近，這說明有些異黃酮的結(jié)構(gòu)與葛根素極為相似，因而才會(huì)具有相同或相似的功效。Yu Wenli等[17]采用了化學(xué)發(fā)光法比較葛根中總異黃酮和葛根素清除自由基的能力，結(jié)果表明兩者都有出色的抗氧化功能，但葛根總異黃酮要明顯優(yōu)于葛根素。周吉銀[18]、歐陽玉祝[19]等認(rèn)為葛根總黃酮是葛根提取物中的主要有效成分，葛根素則是葛根總黃酮中的一種活性單體成分，兩者均具有防醉酒、治醉酒和對(duì)抗酒精肝損傷等作用。湯曉等[20]報(bào)道了多黃酮混合物抗氧化活性的協(xié)同與拮抗作用。葛根作為一種安全有效的傳統(tǒng)解酒藥物在中國已經(jīng)有千年歷史，今后應(yīng)從分子的角度深入探討其作用機(jī)制，將葛根異黃酮中的有效成分制成快捷、廉價(jià)而又適用于臨床的新型防醉解酒產(chǎn)品。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)分析和評(píng)價(jià)了葛根中葛根異黃酮和葛根素的解酒防醉效果，通過醉酒時(shí)間、解酒時(shí)間以及小鼠給酒后血液乙醇含量等生理指標(biāo)結(jié)合灌胃藥品中葛根素 的含量得出以下結(jié)論：1）葛根素對(duì)小鼠急性防醉解酒有一定功 效，能有效降低血液中乙醇的含量，從而延長(zhǎng)小鼠醉酒時(shí)間，縮短小鼠醒酒時(shí)間。灌胃藥品中葛根素含量越高，防醉解酒的效果越明顯。2）葛根中除葛根素外，有其他的異黃酮類物質(zhì)與葛根素有相似的防醉解酒功效，機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Puerarin and Isof l avones from Kudzu Root (Pueraria lobata Ohwi) Prevent Acute Drunkenness and Relieve Alcoholism in Mice

ZHU Zhen-yuan, XUE Jing, LIU Xiao-cui, MENG Meng, TANG Ya-li, ZHANG Jun, GUO Rong
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Objective: The present study aimed to evaluate the effects of puerarin and isof l avones from kudzu root (Pueraria lobata Ohwi) on preventing acute drunkenness and relieving alcoholism in mice. Method: Firstly, mice were divided randomly into five groups: control, crude kudzu root extract, kudzu root isoflavone, 60% puerarin, and 99% puerarin. After 12 hours of fasting but with access to water, the mice in each group were orally administered with an equal dose of the corresponding materials in 50% aqueous propylene glycol solution (the solvent alone for the control group). After 30 minutes, the mice from each group were administered by gavage with an identical volume of 56° red star Erguotou liquor. The preventive effect of different contents of puerarin on acute drunkenness was investigated by observing the drunk time and sober-up time. At the sam e time, the ethanol concentration in blood samples of mice was continuously detected to characterize the degree of intoxication in mice at different time points. Secondly, another batch of mice were divided into four groups, which were administered with kudzu root isof l avone containing approximately 22.13% puerarin at doses of 100, 200, 300 and 400 mg/kg bw after 12 hours of fasting with access to water, respectively. The optimal dose for preventing acute drunkenness and relieving alcoholism was selected based on the drunk time and sober-up time. Results: With increasing amount of puerarin in the materials administered to mice, the drunk time was increased and sober-up time was shortened. Hence, the effect of puerarin is positively proportional to its content. However, no obvious change was observed when the puerarin content exceeded 300 mg/kg bw. Conclusion: Puerarin is effective at preventing acute drunkenness and relieving alcoholism. Other isof l avones from kudzu root have similar effect to that of puerarin.

puerarin; kudzu root isoflavones; mice; anti-drunk; drunk time; sober-up time

TS201.1

A

1002-6630（2014）15-0247-04

10.7506/spkx1002-6630-201415050

2013-07-14

天津科技大學(xué)科學(xué)研究基金項(xiàng)目（20120106）；農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2011GB2A100009）

朱振元（1969—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯镔Y源與功能食品。E-mail：zhyuanzhu@tust.edu.cn