張建平，趙 瑩，梁力曼，周世蛟，任艷軍，侯文龍，趙永光

(河北科技師范學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，河北秦皇島，066600)

介質(zhì)是其液相色譜核心技術(shù)之一，介質(zhì)的研究水平一直制約著液相色譜技術(shù)的發(fā)展［1］。在以生物大分子為目標(biāo)產(chǎn)物的分離中，由于生物大分子自身的特殊性，使得對分離介質(zhì)的要求也比較嚴(yán)格。早期應(yīng)用最多的材料是多糖基質(zhì)，但由于只能在較低流速下操作，限制了其應(yīng)用［2］。對于硅膠介質(zhì)，能夠承受較高的壓力，但是只能在較低的pH下穩(wěn)定操作［3］。之后發(fā)展的剛性有機(jī)樹脂介質(zhì)有很好的性能，但表面積小、柱容量不高，且裝柱難度大，一般來說宜用于分析而不利于制備分離［4］。因此，Afeyan等［5］引入了一個(gè)新的色譜概念:灌注色譜。這種色譜介質(zhì)的基質(zhì)是高分子材料，它帶有兩類孔，一類是穿透孔，流體以對流形式通過;另一類是擴(kuò)散孔，跟一般介質(zhì)具有的孔一樣，流體以擴(kuò)散的形式通過。穿透孔與擴(kuò)散孔相連，保證了介質(zhì)的大比表面積和溶質(zhì)吸附容量，同時(shí)大大降低了利用傳統(tǒng)介質(zhì)進(jìn)行色譜分離的擴(kuò)散傳質(zhì)阻力(圖1)。而這類介質(zhì)主要為微米級(jí)聚合物微球，作為功能高分子材料，微米級(jí)聚合物微球在分析化學(xué)，生物化學(xué)，免疫醫(yī)學(xué)及某些高新技術(shù)領(lǐng)域中有著廣泛應(yīng)用前景。而商品化的流通色譜介質(zhì)存在著成本高、制備工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)。因此，新型灌注色譜介質(zhì)微球的制備一直是研究的熱點(diǎn)。

聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)微球是一種富含環(huán)氧基的功能高分子材料，既具備特定的物理結(jié)構(gòu)，又有良好的化學(xué)反應(yīng)性能［6］，以此類微球?yàn)榻橘|(zhì)的液相色譜適用于生物大分子，尤其是蛋白質(zhì)的分離純化。筆者利用分散聚合法制備粒徑可控的微米級(jí)PGMA單分散種子微球，以期優(yōu)化合成工藝，對該微球進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，確定該介質(zhì)的靜態(tài)吸附容量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-25C，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn))，水浴振蕩器，光學(xué)顯微鏡(Motic Digital Microscope Motic B5，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn))，掃描電鏡(SEM，KYKY-2800，北京中科科儀有限公司生產(chǎn))，真空干燥箱(ZD79-A，天津中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司生產(chǎn))，紫外可見分光光度計(jì)(752N，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA，質(zhì)量分?jǐn)?shù) ＞0.99)，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞0.98)，牛血清白蛋白(BSA)，上海晶純生化科技股份有限公司生產(chǎn);偶氮二異丁腈(AIBN)，天津大沽化工股份有限公司生產(chǎn);聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn);聚乙烯醇(PVA 1788)，十二烷基苯磺酸鈉(SDS)，正辛醇，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn);甲苯，天津市化學(xué)試劑三廠生產(chǎn)。以上均為分析純。

2 單分散多孔微球的制備

2.1 單分散微球的制備

按比例在100 mL茄形瓶中加入單體(GMA)、引發(fā)劑(AIBN)、分散劑(PVP)，無水乙醇和水，超聲10 min充分溶解成均相溶液。通入N2排O2。于70℃恒溫水浴中旋轉(zhuǎn)加熱，一定時(shí)間后，產(chǎn)物靜置沉降，傾去上層清液。沉降物以無水乙醇洗滌、沉降3次。再用2次水洗滌、沉降3次，得到微球，改變配比重復(fù)上述操作以優(yōu)化反應(yīng)條件。

2.2 多孔微球的制備

步驟a:將上述制備所得微球儲(chǔ)存于PVA的溶液中，分散成100.0 g·L－1勻漿液。取20mL勻漿液分散于100 mL，PVA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01，SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01的水溶液中，得到種子分散液。

步驟b:在燒瓶中，準(zhǔn)確加入一定比例的GMA，EDMA，甲苯，正辛醇，AIBN，超聲使完全溶解，加入PVA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20和SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05水溶液100 mL。反復(fù)超聲乳化，使油相完全乳化，液面上層無油滴，獲得O/W型乳液。

步驟c:將步驟b中的O/W型乳液以2 mL·min－1的速率滴加到含步驟a所得種子分散液的500 mL圓底燒瓶中，在20℃下溶脹12 h后，通N220 min后，N2保護(hù)下70℃恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)，聚合24 h，得到聚甲基丙烯酸縮水甘油酯/二甲基丙烯酸乙二醇雙酯交聯(lián)微球［7］。

將聚合物微球轉(zhuǎn)入網(wǎng)孔尺寸為0.037 mm的尼龍袋中，在索氏提取器中利用乙醇抽提24 h，以除去聚合物中殘存的有機(jī)致孔劑和其它可溶性組分，真空干燥后備用。采用文獻(xiàn)［8］所述方法，用二乙胺對雙孔微球進(jìn)行表面修飾。

2.3 微球的形貌表征

在室溫下，真空干燥計(jì)算產(chǎn)率。用光學(xué)顯微鏡(Motic Digital Microscope Motic B5)和Motic Image Advanced 3.0系統(tǒng)觀察微球的形貌，測量粒徑及粒徑分布。以掃描電鏡觀察雙孔微球的表面形貌。

3 結(jié)果與分析

3.1 單分散微球制備過程的優(yōu)化

設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，調(diào)節(jié)4個(gè)變量GMA，AIBN，PVP，醇水比中的某一變量，控制其他3個(gè)變量不變，合成微球。綜合考慮產(chǎn)率、粒徑大小及分布因素，討論影響微球制備的因素。

3.1.1 醇水比對微球合成的影響 控制GMA，AIBN，PVP的量不變，調(diào)節(jié)醇水比，合成微球。結(jié)果表明，隨著乙醇中水的比例的增加，合成的PGMA微球產(chǎn)率略微下降，微球粒徑是一直增加，但是單分散性也隨之變差(圖2)。當(dāng)V(無水乙醇)∶V(水)=46∶4時(shí)，得到PGMA微球粒徑分散指數(shù)達(dá)2.267，＞1.05，不再是單分散微球。根據(jù)溶液理論，溶解度參數(shù)越接近則溶解性越好。在反應(yīng)體系中，分散劑PVP溶度參數(shù)與乙醇相近，所以乙醇含量高時(shí)PVP分子更為舒展，從而對聚合物微球具有很好的保護(hù)能力。反之，當(dāng)無水乙醇含量減少時(shí)PVP溶解性變差，對微球保護(hù)能力下降，聚合物微球發(fā)生粘結(jié)、聚并，導(dǎo)致分散變寬直至不能成球。由此可知，分散介質(zhì)中醇與水的比例對微球的形成以及粒徑分布非常重要，V(無水乙醇)∶V(水)≥47∶3都可以形成單分散微球。

3.1.2 單體用量對微球合成的影響 控制AIBN，PVP，醇水比的量不變，調(diào)節(jié)單體GMA的量，合成微球。結(jié)果表明，隨著單體在體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，PGMA微球產(chǎn)率先升后降，在單體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10時(shí)達(dá)到最大(圖3)。隨著單體在體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，微球粒徑是增加的，單體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.12及以后時(shí)粒徑增加不明顯。而在所實(shí)驗(yàn)的單體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.06～0.14范圍內(nèi)，微球粒徑均符合單分散性要求。綜合考慮上述數(shù)據(jù)，選擇單體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08～0.10的比例時(shí)最合適。

圖2 醇水比對微球合成的影響

圖3 單體用量對微球合成的影響

3.1.3 引發(fā)劑用量對微球合成的影響 控制GMA，PVP，醇水比的量不變，調(diào)節(jié)引發(fā)劑AIBN質(zhì)量占投入單體質(zhì)量的比例，合成微球。結(jié)果表明，PGMA微球產(chǎn)率隨引發(fā)劑用量的增加呈先升后降的變化趨勢，在引發(fā)劑用量為投入單體質(zhì)量的0.025倍時(shí)達(dá)到最大(圖4)。隨引發(fā)劑用量的增加，平均粒徑呈先降低后增加的變化趨勢。隨引發(fā)劑用量的增加，微球粒徑分布呈先變窄而后又略微變寬的變化趨勢，引發(fā)劑用量為投入單體質(zhì)量的0.017～0.025倍范圍內(nèi)合成的微球符合單分散要求。綜合考慮，引發(fā)劑的用量為單體質(zhì)量的0.021～0.025倍時(shí)結(jié)果比較好，微球粒徑可控，粒徑分布較窄。這與一般分散聚合規(guī)律類似。

3.1.4 分散劑PVP用量對微球合成的影響 控制其它因素(GMA，AIBN，醇水比)的量不變，調(diào)整分散劑PVP占分散介質(zhì)質(zhì)量的比例，合成微球。結(jié)果表明，隨著分散劑用量的增大，PGMA微球產(chǎn)率呈先升高后降低的變化趨勢，在分散劑用量為分散介質(zhì)質(zhì)量的1.7×10－3倍時(shí)達(dá)到最高(圖5)。隨著分散劑用量的增大，微球粒徑呈先降低后升高的變化趨勢，在分散劑用量為分散介質(zhì)質(zhì)量的1.7×10－3倍時(shí)最小。隨著分散劑用量的增大，合成的微球其分散指數(shù)開始變窄而后又呈現(xiàn)增寬趨勢，分散劑用量為分散介質(zhì)質(zhì)量的1.7×10－3～2.1×10－3倍范圍內(nèi)符合單分散要求。當(dāng)分散劑用量比較小時(shí)，對形成的微球穩(wěn)定效果差，微球容易發(fā)生聚并，得到平均粒徑較大的微球，微球的粒度分布變得較寬;當(dāng)穩(wěn)定劑用量較大時(shí)，對微球的穩(wěn)定效果比較好，微球之間的聚并少，得到的微球的平均粒徑較小，微球的粒度分布也比較窄;但當(dāng)穩(wěn)定劑用量過大時(shí)，聚合物成核后部分能吸附更多的分散劑形成更大的微球，同時(shí)聚合物在微核上的沉積不均勻造成微球粒徑大小不均一，粒徑變大，但是分布比較寬。上述現(xiàn)象與一般分散聚合規(guī)律類似［9，10］。

圖4 引發(fā)劑用量對微球合成的影響

圖5 分散劑用量對微球合成的影響

3.2 靜態(tài)吸附容量

利用標(biāo)準(zhǔn)間歇式吸附操作測定改性多孔微球?qū)SA的靜態(tài)吸附等溫線［11］。

其中，q為平衡吸附量(單位:mg·g－1)，qm為飽和吸附量(單位:mg·g－1)，c為水相中蛋白質(zhì)的平衡質(zhì)量濃度(單位:g·L－1)，Kd為吸附平衡解離常數(shù)(單位:g·L－1)。其飽和吸附容量為93.1 mg·g－1(圖6)，說明比表面積值較大。

圖6 雙孔微球靜態(tài)吸附等溫線

圖7 單分散微球的光學(xué)顯微鏡照片

3.3 形貌表征結(jié)果

圖7為光學(xué)顯微鏡下的種子微球表面形貌，粒徑5～6μm，而且分布均勻、單分散系數(shù)＜1.05，符合單分散要求。圖8為微球在掃描電鏡下的微球照片，粒徑均勻、表面光滑并無微孔。圖9為經(jīng)一步溶脹法合成的改性多孔微球，從電鏡照片中可以看出表面粗糙有許多微孔。

圖8 單分散微球掃描電鏡照片

圖9 改性微球掃描電鏡照片

4 結(jié) 論

以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體，在乙醇以及乙醇與水混合體系中用分散聚合法，制備了一系列的粒徑可控的單分散的1～8μm的PGMA微球，考量了制備工藝。其中分散體系V(無水乙醇)∶V(水)為 50∶0～47∶3，引發(fā)劑 AIBN 用量為單體質(zhì)量的0.021～0.025倍，分散劑 PVP用量為分散介質(zhì)質(zhì)量的 1.7 ×10－3～2.1 ×10－3倍，單體GMA在體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06～0.14時(shí)均能得到單分散的微球。經(jīng)改性得到的多孔微球其對BSA的靜態(tài)吸附量高達(dá)93.1 mg·g－1，在蛋白質(zhì)分離方面有很好的應(yīng)用前景。

致謝:感謝河北科技師范學(xué)院分析測試中心在樣品測試中的幫助和指導(dǎo)!

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