黃遠(yuǎn)見，肖 娟，羅志強(qiáng)

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 耳鼻咽喉科，湖南 衡陽 421001)

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益氣解毒方上調(diào)miR-34a抑制鼻咽癌細(xì)胞生長增殖研究

黃遠(yuǎn)見，肖 娟，羅志強(qiáng)*

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 耳鼻咽喉科，湖南 衡陽 421001)

目的：研究益氣解毒方調(diào)控的miR-34a變化在抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮的作用。方法：采用qRT-PCR法，分別檢測鼻咽癌細(xì)胞株(益氣解毒方處理組和DMSO對照組)中miR-34a的表達(dá)水平；采用MTT法研究益氣解毒方調(diào)控的miR-34a抑制人鼻咽癌CNE2細(xì)胞生長增殖的能力。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示，與DMSO對照組細(xì)胞相比，益氣解毒方處理組的CNE2細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，抑制效應(yīng)呈劑量依賴關(guān)系。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，益氣解毒方處理組中的miR-34a表達(dá)量較DMSO對照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：益氣解毒方可通過上調(diào)miR-34a表達(dá)而抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。

miR-34a；益氣解毒方；鼻咽癌

中醫(yī)藥在腫瘤治療方面有獨(dú)特療效，其因療效確切、毒性低而受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。中藥復(fù)方及其有效成分可直接抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞，是篩選抗癌藥物的重要來源?！耙鏆饨舛痉健笔翘锏婪ń淌谠诙嗄昱R床經(jīng)驗(yàn)和研究的基礎(chǔ)上研發(fā)的抗鼻咽癌制劑，其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用中都顯示了良好效果，且該方經(jīng)劑型改革，已經(jīng)被藥監(jiān)部門批準(zhǔn)，以“益氣解毒顆粒”的劑型作為醫(yī)院制劑，用于鼻咽癌的防治[1-4]。miRNA是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)，其參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步研究益氣解毒方對鼻咽癌的治療效果，本文從miRNA入手探討益氣解毒方抑制鼻咽癌細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

CNE2為低分化鼻咽癌細(xì)胞株，由南華大學(xué)腫瘤研究所贊助。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640，在95%濕度、5% CO2、37℃條件下貼壁生長。

1.2 益氣解毒方制備

該方是臨床上治療鼻咽癌，特別是鼻咽癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣解毒、生津潤燥之功效，由黃芪、黨參、天花粉、黃連、白花蛇舌草、茯苓、甘草等藥物組成。上述藥材用雙蒸水浸泡4h，煮沸25min，過濾，50℃水浴中濃縮成1g/mL的藥液，抽濾除菌供實(shí)驗(yàn)用。

1.3 定量PCR檢測

采用SYBR方法，應(yīng)用Biorad公司的定量PCR儀 IQ5進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。通過公式2-△Ct計(jì)算miR-34a的相對表達(dá)量，其中 Ct=miR-34a平均Ct值-U6平均Ct值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 益氣解毒方抑制人鼻咽癌CNE2細(xì)胞生長增殖

MTT結(jié)果顯示，采用益氣解毒方處理CNE2細(xì)胞24h、48h、72h后的OD值分別為 (0.37±0.03)、(0.44±0.04)、(0.51±0.05) ，對照組分別為(0.57±0.06)、(0.81±0.06)、(1.25±0.17)。處理48h、72h后，兩組OD值差異顯著，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果提示，益氣解毒方對鼻咽癌CNE2細(xì)胞有抑制作用，且抑制效應(yīng)呈顯著的時(shí)間依賴關(guān)系。

2.2 益氣解毒方上調(diào)miR-34a表達(dá)

筆者試從miRNA的角度探討益氣解毒方抑制鼻咽癌細(xì)胞的分子機(jī)制，前期結(jié)果顯示miR-34a在鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào)，且能抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長與侵襲。為了研究益氣解毒方處理后的鼻咽癌CNE2細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)情況，本文采用qRT-PCR法，分別檢測了經(jīng)過DMSO或益氣解毒方處理后的鼻咽癌細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，益氣解毒方顯著上調(diào)了miR-34a表達(dá)，與處理前比較升高(4.24±0.89)倍，與DMSO對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

研究顯示，腫瘤相關(guān)的死亡中有70%以上是由癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移所致。因此，早期準(zhǔn)確、無創(chuàng)地預(yù)測和監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移，可為患者制定個(gè)體化的預(yù)防和治療方案提供重要依據(jù)，是提高腫瘤患者，特別是中晚期患者生存時(shí)間及生存質(zhì)量的重要前提。尋找有效預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移的方法是臨床面臨的重大課題。鼻咽癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病具有明顯的地區(qū)聚集性，廣東省等華南地區(qū)尤為高發(fā)。世界衛(wèi)生組織研究顯示，40%的鼻咽癌發(fā)生在中國，嚴(yán)重威脅我國人民的生命健康。

miRNA是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)，其參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。miR-34a在前列腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌、膠質(zhì)瘤以及乳腺癌等腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)均下調(diào)。miR-34a過表達(dá)可抑制多種腫瘤的生長、侵襲與轉(zhuǎn)移，在抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5-7]。以上研究均表明miR-34a是一種具有抑瘤功能的miRNA，本文前期研究也顯示miR-34a在鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào)，且能抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長與侵襲。

為證實(shí)益氣解毒方是否通過上調(diào)miRNA抑制鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展，筆者首先研究了益氣解毒方對鼻咽癌CNE2細(xì)胞的影響。MTT結(jié)果顯示，益氣解毒方的抗腫瘤效應(yīng)呈時(shí)間依賴性；后運(yùn)用qRT-PCR法檢測出益氣解毒方能顯著上調(diào)miR-34a表達(dá)。綜上所述，益氣解毒方可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，通過上調(diào)miR-34a在鼻咽癌組織中的表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤效果。益氣解毒方安全、可靠、低毒，結(jié)合其在miRNA通路中的調(diào)控作用，相信在不久的將來，其將在鼻咽癌的治療中發(fā)揮廣泛作用。

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

2013-12-27

黃遠(yuǎn)見(1975-)，男，南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院主治醫(yī)師，碩士研究生，研究方向?yàn)楸茄拾┑陌l(fā)病機(jī)制與防治。

羅志強(qiáng)(1964-)，女，南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槎呛砼R床。

R285.5;R739.6

A

1673-2197(2014)08-0035-02