舒 蕾，張曼麗，劉 杰，潘海波，劉 丹，張 勇，顏其貴，3

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心，四川 雅安625014；2.重慶太極藥用動(dòng)植物資源開(kāi)發(fā)有限公司，重慶涪陵408000；3.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安625014）

大腸埃希菌也稱大腸桿菌，在畜牧生產(chǎn)中常引發(fā)豬大腸桿菌病，大腸桿菌病也是人畜共患的腸道細(xì)菌性傳染病，主要有仔豬黃痢、仔豬白痢及仔豬水腫等在規(guī)模化豬場(chǎng)中發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展。因大腸埃希菌的血清型眾多，變異較大，濫用抗生素易誘發(fā)和傳播耐藥菌的特點(diǎn)[1-2]，使得大腸桿菌病防治十分困難。本試驗(yàn)隨機(jī)采集川渝地區(qū)43個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)的仔豬腹瀉性病料，進(jìn)行血清型鑒定及耐藥性監(jiān)測(cè)，旨在掌握各區(qū)域大腸埃希菌的流行血清型和耐藥性發(fā)展現(xiàn)狀，為制定治療方案和防制措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來(lái)源 2011年11月-2012年5月，在川渝地區(qū)對(duì)隨機(jī)選擇的43個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)進(jìn)行病料采集。

1.1.2 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、細(xì)菌生化鑒定管和藥敏紙片，均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；MH培養(yǎng)基，購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；50種大腸埃希菌屬診斷血清，購(gòu)自天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏質(zhì)控菌株標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25922，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；其他試劑實(shí)驗(yàn)室制備。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 儀器均為常規(guī)設(shè)備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1病料采集 調(diào)查走訪川渝18個(gè)地區(qū)的43個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查后采集仔豬腹瀉發(fā)病豬的新鮮糞便合計(jì)300份，具體采集、保存方法參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)菌分離純化 取病料于麥康凱平板上劃線接種，37℃，培養(yǎng)18 h，挑取單個(gè)粉紅色菌落接種于伊紅美藍(lán)平板純化，37℃，培養(yǎng)18 h，挑取有紫黑色帶金屬光澤的單個(gè)菌落進(jìn)行染色鏡檢，將符合大腸埃希菌鏡檢特征的接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃搖床擴(kuò)大純培養(yǎng)。

1.2.3 生化鑒定 取純化后新鮮菌液分別接種TSI和細(xì)菌生化鑒定管，方法及判定結(jié)果參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。

1.2.4 血清型鑒定 將鑒定為大腸埃希菌的菌株進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，方法及判定結(jié)果參照血清診斷試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 耐藥性監(jiān)測(cè) 對(duì)鑒定為大腸埃希菌的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏質(zhì)控參照標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25922進(jìn)行，試驗(yàn)采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)CLSI[5]推薦的K-B法進(jìn)行，結(jié)果判定依據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離鑒定 280份病料中分離出273株大腸埃希菌，分離率為97.5%，273株大腸埃希菌的TSI及生化試驗(yàn)結(jié)果均符合腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定特征，即TSI出現(xiàn)斜面底層變黃、有氣體；生化鑒定分離菌可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖、木糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，少數(shù)能發(fā)酵蔗糖，M.R試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)為陽(yáng)性，尿素酶、枸櫞酸鹽、檸檬酸鹽、V-P試驗(yàn)為陰性。

2.2 血清型鑒定 273株菌株中有205株定型，定型比例為75.09%。血清定型分別屬于：O1、O2、O6、O7、O8、O9、O11、O15、O18、O20等43個(gè)不同血清型，其中O138檢出率最高，為12.2%，其次是O20（6.83%）、O8（6.34%）、O60（5.85%）、O141（5.85%），共占定型比例為75.09%。

2.3 藥敏試驗(yàn)

2.3.1 藥敏結(jié)果 16種臨床常用抗菌藥物中抑菌作用最強(qiáng)的為丁胺卡那霉素、頭孢他啶，敏感菌株分別占53.11%、49.45%，對(duì)氨芐西林、磺胺嘧啶、四環(huán)素呈高度耐藥，耐藥率均在80%以上，對(duì)其他藥物也表現(xiàn)出不同程度耐藥，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 273株大腸埃希菌對(duì)14種抗菌藥物的耐藥性

2.3.2 耐藥譜分析 對(duì)多重耐藥性分析結(jié)果（圖1）表明：試驗(yàn)菌株對(duì)所試14種藥物表現(xiàn)出嚴(yán)重的多重耐藥，大部分菌株對(duì)5種及以上耐藥，總比例占86.45%，最高達(dá)14耐，大部分呈7耐、8耐及12耐，比例為35.53%，273株大腸埃希菌共有142種耐藥譜型。

圖1 大腸埃希氏菌對(duì)常用抗菌藥物的多重耐藥譜

3 討論與分析

3.1 仔豬常因飼養(yǎng)管理不良，衛(wèi)生條件差，環(huán)境溫差變化等綜合應(yīng)激因素引起仔豬抵抗力降低而誘發(fā)腹瀉。所以，針對(duì)規(guī)?；i場(chǎng)應(yīng)改善飼養(yǎng)管理，減少應(yīng)激發(fā)生；產(chǎn)前母豬可進(jìn)行疫苗免疫，通過(guò)泌乳使仔豬獲得母源抗體；積極進(jìn)行藥物敏感性監(jiān)測(cè)，選擇有效抗菌藥物預(yù)防；加強(qiáng)環(huán)境消毒，防止耐藥菌株的交叉?zhèn)鞑ズ透腥?；選擇使用黃芪多糖等，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體抵抗力，減少疾病發(fā)生；運(yùn)用微生態(tài)制劑改善腸道微環(huán)境，避免正常菌群發(fā)生紊亂。

3.2 大腸埃希菌血清型較多是導(dǎo)致臨床采用商品細(xì)菌疫苗防疫效果不佳的主要因素之一。國(guó)外已有報(bào)道過(guò)主要流行血清型，如O8，O9，O20，O45、O64，O101，O138，O139，O141，O147，O149和O157等[6]，在本次調(diào)查中273株大腸埃希菌分屬43種血清型，其中O138、O20、O8、O60、O141、O7、O38檢出率較高，共占46.83%（96/205）。本次試驗(yàn)結(jié)果與上海地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型（O149、O111和O60）[7]、廣東省優(yōu)勢(shì)血清型（O8、O64）[8]、重慶市優(yōu)勢(shì)血清型（O101、O8、O20、O64、O45和O149)[9]、四川及廣西地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型（O8、O20、O60、O98、O141、O138和O139）[10]相比較得出，同一時(shí)期不同地區(qū)、同一地區(qū)不同時(shí)期優(yōu)勢(shì)血清型也具有較大差異。本次試驗(yàn)的鑒定結(jié)果，有助于掌握本地區(qū)大腸埃希菌血清型流行狀況，為更好防控提供科學(xué)依據(jù)。

3.3 對(duì)273株大腸埃希菌的耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果為：氨芐西林、磺胺嘧啶、四環(huán)素這幾類抗菌藥物存在高耐藥性，耐藥率均超過(guò)90%，丁胺卡那霉素及頭孢他啶是較為敏感的藥物，其他藥物存在不同程度的耐藥；這與李金良等[11]報(bào)道的西南地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)大腸埃希菌的耐藥性具有一致性，其中慶大霉素(67.77%)、頭孢唑啉（51.65%）、丁胺卡那霉素（30.04%）的耐藥率較田國(guó)寶等[10]報(bào)道的四川地區(qū)和魏雅靜等[12]報(bào)道的西南地區(qū)有明顯的增高；頭孢唑啉的耐藥狀況較孫曉鍇[9]報(bào)道的重慶地區(qū)也有明顯的加??；86.45%的試驗(yàn)菌株至少對(duì)5種藥耐藥，豬源大腸埃希菌呈多重耐藥現(xiàn)象，同等耐藥程度的分離菌有多種耐藥譜型，耐藥譜型在增寬，這同林居純等[13]對(duì)我國(guó)不同地區(qū)大腸埃希菌有多重耐藥的結(jié)論一致。

耐藥性監(jiān)測(cè)的結(jié)果真實(shí)反應(yīng)了川渝各地域豬場(chǎng)在抗菌藥物的使用上具有一致性，臨床不合理或?yàn)E用抗菌藥物有利于耐藥菌的篩選和擴(kuò)散，給獸醫(yī)工作者帶來(lái)巨大考驗(yàn)。此次對(duì)四川和重慶地區(qū)豬源大腸埃希菌的耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果為臨床防治大腸桿菌病有著重要的參考意義。

3.4 近年來(lái)，“超級(jí)細(xì)菌”、“速成雞”的出現(xiàn)，是對(duì)畜牧行業(yè)的警鐘和巨大考驗(yàn)。選擇“綠色治療”細(xì)菌性疾病是行業(yè)之福、民心所向。中藥為天然植物，具有殘留低、毒副作用小、藥效時(shí)間長(zhǎng)、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，中獸藥在獸醫(yī)臨床施藥中越發(fā)具有優(yōu)勢(shì)，其療效也被公眾所認(rèn)可，劉玉芹等[15]用板藍(lán)根、連翹、敗醬草等及其復(fù)方配伍可以有效治療仔豬大腸埃希菌性腹瀉；另外，國(guó)內(nèi)外已有利用噬菌體治療大腸桿菌病，并取得較好療效[15-16]。噬菌體作為天然抗菌制劑，可以感染并裂解相應(yīng)的細(xì)菌，具有不良反應(yīng)小、不易產(chǎn)生抗藥性、無(wú)殘留、低成本等優(yōu)點(diǎn)[17]，因而，噬菌體有望成為抗生素的替代品在臨床中得以應(yīng)用。因此，中獸藥的運(yùn)用和噬菌體制劑的研發(fā)為大腸埃希菌的耐藥問(wèn)題打開(kāi)了另一扇窗。

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