楊文旭, 潘虹

北京大學(xué)第一醫(yī)院實驗中心, 北京 100034

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的重要機制之一,是抑制性轉(zhuǎn)錄的標(biāo)志。20世紀(jì)90年代初期, Lewis等[1]發(fā)現(xiàn)了一種能特異性地與 DNA序列中甲基化CpG二核苷酸結(jié)合的蛋白, 即甲基化CpG結(jié)合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2, MeCP2), 具有在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用。編碼基因MECP2突變能引起 Rett綜合征(Rett syndrome, OMIM 312750)。MeCP2有3個主要的功能域: CpG結(jié)合域(Methyl-CpG-binding domain, MBD)、轉(zhuǎn)錄抑制域(Transcription repression domain, TRD)和 C-末端域(C-terminal domain, CTD)。細(xì)胞內(nèi)的 MeCP2通過MBD識別甲基化DNA并特異性地與之結(jié)合; TRD募集多種轉(zhuǎn)錄抑制因子, 如 sin3A和組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase, HDAC)等形成共抑體, 抑制核小體中的組蛋白乙?；? 從而影響染色質(zhì)壓縮過程, 抑制基因轉(zhuǎn)錄[2]。盡管MeCP2主要作為轉(zhuǎn)錄抑制蛋白, 但最新的研究表明其有可能具有促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的能力[3]。

1 Rett綜合征

RTT是一種 X連鎖的神經(jīng)發(fā)育障礙性遺傳病,臨床主要表現(xiàn)為: 出生6～18個月后出現(xiàn)嚴(yán)重的精神運動發(fā)育遲緩、手的失用和刻板動作、語言發(fā)育障礙、孤獨癥樣表現(xiàn)和癲癇等, 主要累及女性, 發(fā)病率約1/10000[4]?；疾∨宰铋L可存活60余年[5], 是僅次于21三體綜合征引起女性、散發(fā)性嚴(yán)重智力障礙的主要原因之一。臨床分為典型和不典型二大類:典型RTT病程分為4個期, 即發(fā)育停滯期、快速倒退期、假性靜止期和運動惡化期; 不典型RTT主要有 5種類型, 即早發(fā)驚厥型、保留語言變異型、先天型、頓挫型和晚發(fā)退化型。

RTT的主要致病基因是MECP2[6], 近年在不典型RTT的早發(fā)驚厥型中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞周期依賴性激酶樣 5蛋白基因(Cyclin-dependent kinase-like 5,CDKL5)和叉頭框蛋白 G1基因(Forkhead box G1,FOXG1)突變[7]。MECP2突變以點突變引起的錯義和

無義突變最常見[8], 8種常見的點突變分別是R106W、R133C、T158M、R168X、R255X、R270X、R294X和 R306C, 占總突變的 65%, 這些熱點突變主要位于MBD和TRD兩個功能域。C末端的突變主要為小缺失, 占所有突變的 10%～12%; 通過多重連接依賴的探針擴增(Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)方法可檢測到 MECP2大片段缺失, 有全外顯子及部分外顯子缺失, 約占10%。此外, 復(fù)雜重排占6%[9～11]。

研究 RTT最常用的模型是基因敲除的小鼠模型[12], 不同的基因敲除方式包括: 全部敲除 Mecp2基因使其完全缺失, 如Mecp2Bird和Mecp2Jae小鼠模型; 部分敲除使 Mecp2基因部分缺失, 如Mecp2-308小鼠模型。Mecp2Bird小鼠模型由于使用了重組酶 CreloxP(Crerecombinase-loxP, CreloxP)系統(tǒng)明顯減少了小鼠模型的致死性。小鼠模型與 RTT患者有許多相同的表現(xiàn): 在解剖學(xué)水平, 部分腦區(qū)體積明顯縮小, 如小腦和運動皮質(zhì)層; 在細(xì)胞學(xué)水平, 神經(jīng)元更加密集甚至成團(tuán), 神經(jīng)元體積減少[13];突觸數(shù)目減少, 樹突和軸突分支形成過程減慢, 突觸復(fù)雜性降低和突觸形態(tài)改變。在神經(jīng)遞質(zhì)方面,目前大部分學(xué)者認(rèn)同興奮和抑制性失衡學(xué)說[14,15],Mecp2基因敲除小鼠的部分腦區(qū)存在自發(fā)性興奮性突觸傳遞明顯減少, 而抑制性活動明顯增加, 這些變化最終導(dǎo)致腦區(qū)興奮性和抑制性比率失衡[15]。在了解RTT遺傳病因的基礎(chǔ)上, 近年通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對RTT小鼠模型進(jìn)行Mecp2基因表達(dá)水平的修復(fù)實驗, 發(fā)現(xiàn)有局部治療的作用。但是, 過度表達(dá)Mecp2基因則與 Mecp2基因缺失相似, 均具有致病性或致死性。這些結(jié)果提示, Mecp2基因在腦內(nèi)的表達(dá)量必須十分精確, 表達(dá)量過多或過少都影響其功能。

2 MECP2基因及MeCP2蛋白

2.1 MECP2基因

MECP2長約76 kb, 位于染色體Xq28, 包含4個外顯子和 3個內(nèi)含子, 高度保守的 3′非翻譯區(qū)(3′UTR)長約8.5 kb, 可根據(jù)多聚腺苷酸位點產(chǎn)生3種長短不一的mRNA, 分別為1.8 kb、7.5 kb和10 kb。MECP2轉(zhuǎn)錄后形成MECP2-e1和MECP2-e2兩種剪切體。兩種剪切體分別從外顯子1和2開始轉(zhuǎn)錄, 產(chǎn)生的蛋白差異位于N端序列, MeCP2-e2含486個氨基酸, MeCP2-e1含498氨基酸, 蛋白整體結(jié)構(gòu)差異微小。MECP2外顯子1突變可導(dǎo)致典型的RTT, 但突變檢出率不高; 目前尚未發(fā)現(xiàn)外顯子2突變。Kerr等[16]在Mecp2基因敲除的小鼠模型中分別通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)兩種剪切體, 發(fā)現(xiàn)Mecp2-e1表達(dá)量越高越能改善小鼠缺乏 Mecp2所致的癥狀, 但是在兩種剪切體表達(dá)量相同時, Mecp2-e2起到的行為改善作用更明顯。另外, Mecp2-e1在腦中的表達(dá)量明顯高于Mecp2-e2; 在腦區(qū)分布方面, Mecp2-e1以下丘腦居多, 而Mecp2-e2則以丘腦背側(cè)和大腦皮層深層分布多[17]。二者作用功效、含量與密度的不一致均提示兩種剪切體的功能有差異, 需要進(jìn)一步的研究。

2.2 MeCP2蛋白

MeCP2蛋白有兩種分子形式, 分別是 MeCP2-e1和MeCP2-e2。目前推斷MeCP2單體分子量約為53 kDa, 但凝膠過濾法得到的分子量達(dá)到500 kDa。MeCP2蛋白在全身表達(dá)豐富, 中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)量最高, 其次是肺和脾, 這種分布特性在人類和嚙齒類動物中相似。定量分析顯示, 每個離體神經(jīng)元核內(nèi)MeCP2蛋白含量分別為核小體和甲基化CpG的1/2和1/4[18], MeCP2含量雖小卻可以充分發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。MeCP2在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中的功能是否相同存在爭議, 部分學(xué)者認(rèn)同MeCP2在神經(jīng)元中高表達(dá)且高效率作用這一觀點[18,19]。另外, 也有研究顯示神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的 MeCP2作用可能不小于在神經(jīng)元的作用。MeCP2在膠質(zhì)細(xì)胞中的含量只有神經(jīng)元中的1/5～1/4[20], 但是由于膠質(zhì)細(xì)胞在樹突修飾和突觸形成等方面具有重要作用, 所以MeCP2在膠質(zhì)細(xì)胞中的作用不可忽視。在嚙齒類動物中追蹤Mecp2的胚胎發(fā)育蹤跡, 發(fā)現(xiàn)在胚胎12 d出現(xiàn)在脊髓和腦干中, 胚胎18 d到達(dá)大腦皮層表面。小鼠出生后Mecp2的表達(dá)高峰期在生后3～5周[18], 之后達(dá)到平臺期并持續(xù)表達(dá)。

MeCP2主要的功能域是MBD和TRD。核磁共振技術(shù)顯示MBD中4條β鏈反向平行折疊構(gòu)成了楔形結(jié)構(gòu), 其內(nèi)的溝型槽構(gòu)成了甲基化DNA特異性的識別標(biāo)志。MBD具有維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用,如MECP2突變中的R133C和T158M等可通過降低MBD穩(wěn)定性, 使MeCP2的功能障礙。TRD是MeCP2作為轉(zhuǎn)錄抑制物的主要連接域, TRD與共同抑制物sin3a和HDAC等連接后形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體, 介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平的負(fù)性調(diào)節(jié)功能。TRD也可連接轉(zhuǎn)錄因子,如YY1和CREB等產(chǎn)生相應(yīng)的調(diào)控作用。CTD毗鄰TRD, 胰島素酶可將CTD分解為CTDα和CTDβ兩個小片段, 而 CTD中最重要的 WW 域主要位于CTDα內(nèi), 此區(qū)域易連接富含脯氨酸的序列。CTD占 MeCP2總長 3/5, 可能介導(dǎo)染色質(zhì)折疊[21], 其缺乏可引起RTT不同的表型變化。除以上幾個重要域外, 還有N-末端(N-terminal domain, NTD)、核定位信號(Nuclear localization signal, NLS)和間隔區(qū)(Inter domain, ID)等。這些區(qū)域的功能也尚未完全明確。MeCP2內(nèi)部 60%～65%是沒有特定結(jié)構(gòu)的, 典型的二級結(jié)構(gòu)主要集中在 MBD[22]。MeCP2單體在溶液中具有類似線圈樣形態(tài), 這種柔軟的結(jié)構(gòu)可能更有利于MeCP2改變構(gòu)象, 適應(yīng)生理條件下與多種蛋白相互作用。

2.3 MeCP2蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)

MeCP2的絲氨酸殘基磷酸化是一種重要的翻譯后修飾, 分別位于S421和S80。影響磷酸化的主要因素是 Ca2+內(nèi)流和神經(jīng)元活性變化, 當(dāng)神經(jīng)元去極化時, S421被磷酸化, 而S80被去磷酸化。細(xì)胞凋亡也可以影響S80的磷酸化程度[23]。神經(jīng)元去極化時,S421受 CaMKII激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II, CaMKII)調(diào)控, 這種磷酸化只發(fā)生在神經(jīng)系統(tǒng), 參與調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)生長因子(Brain derived neurophic factor, BDNF)的表達(dá)。S80受同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶(Homeodomaininteracting protein kinase 2, HIPK2)調(diào)節(jié)發(fā)生去磷酸化, 這種去磷酸化受MeCP2與DNA的連接緊密程度和 MeCP2對靶基因的作用程度影響。Tao等[24]研究顯示轉(zhuǎn)基因S80突變小鼠出現(xiàn)Mecp2與靶基因的連接障礙, 繼而影響基因表達(dá)。兩種磷酸化修飾均有助于Mecp2與靶基因的連接。

2.4 MeCP2靶基因

MeCP2作用的靶基因目前尚不完全清楚, 多個研究團(tuán)隊試圖從RTT患者或小鼠模型的基因表達(dá)譜中找到MeCP2作用的靶基因, 但重疊的靶基因極少。編碼 BDNF的基因是認(rèn)可度最高的靶基因之一。BDNF具有促進(jìn)神經(jīng)元成熟、維持 Ca2+穩(wěn)態(tài)和改善突觸可塑性的功能; 與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)。缺乏 BDNF可導(dǎo)致一系列神經(jīng)系統(tǒng)異常, 若過度表達(dá)則能改善小鼠模型Mecp2缺乏引起的一些形態(tài)學(xué)缺陷。生理情況下, MeCP2與 BDNF基因的啟動子Ⅳ結(jié)合, 抑制它的轉(zhuǎn)錄功能。當(dāng) Ca2+內(nèi)流增加、神經(jīng)元去極化時, 細(xì)胞內(nèi)各種因子通過信號通路活化 CaMKII激酶。此激酶快速將 MeCP2磷酸化, 改變MeCP2的粘附能力和所在位置。另外, 增加的神經(jīng)元活性也影響了MeCP2結(jié)合的CpG島甲基化程度。MeCP2因而與BDNF基因啟動子Ⅳ分離, BDNF表達(dá)隨即增加。此外, MeCP2受BDNF的負(fù)反饋調(diào)節(jié), 主要涉及的機制有: (1)通過 MeCP2特殊磷酸化 S357、S350和S360, 促進(jìn)MeCP2與14.3.3蛋白相互作用[25], 使MeCP2從BDNF基因啟動子上脫落; (2)MECP23′UTR區(qū)內(nèi)的miR-132被CREB激活[26], 促進(jìn)BDNF分泌, 抑制 MeCP2連接。調(diào)節(jié) BDNF活性的還有RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子(RE1-silencing transcription factor,REST)和 RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子共同抑制物 1 (REST corepressor 1, COREST)[27], 當(dāng)缺乏MeCP2時, 兩因子連接 BDNF基因啟動子Ⅰ和Ⅱ之間, 抑制 BDNF的活性。另一大類靶基因是在 3′UTR區(qū)的小分子RNA, 它們可以在 RNA 水平參與調(diào)控, 故 MeCP2可以通過這些小分子 RNA間接調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育。例如miR-132參與由BDNF介導(dǎo)的神經(jīng)軸突生長, 過度表達(dá)可降低MeCP2在腦內(nèi)皮層區(qū)的表達(dá)量[26]。MeCP2可通過調(diào)控miR-184和miR-137參與細(xì)胞分化與增殖。

2.5 MeCP2蛋白與甲基化DNA連接

MeCP2的主要作用依賴DNA甲基化。DNA甲基化主要受甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,Dnmts)調(diào)控, 介導(dǎo)基因沉默和維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。甲基化基因沉默作用涉及 3大機制: (1)甲基化連接區(qū)變構(gòu)后物理性阻礙轉(zhuǎn)錄因子連接; (2)募集轉(zhuǎn)錄抑制因子, 如sin3a等形成共同抑制復(fù)合體; (3)直接壓縮染色質(zhì)。MeCP2的轉(zhuǎn)錄抑制功能需要通過 MBD與甲基化DNA連接而發(fā)揮作用。一個分子的MeCP2覆蓋甲基化DNA的11個核苷酸[28], 其中MBD占一半以上[29]。當(dāng)DNA甲基化程度降低時, MeCP2在細(xì)胞核內(nèi)缺乏特定的結(jié)合位點。近期有研究顯示,MeCP2也可以與非甲基化 DNA連接[30]。Adams等[31]發(fā)現(xiàn)MeCP2中的非MBD同樣有親和并連接其他蛋白的能力, 促進(jìn)MeCP2與之相互作用, 在一定程度上影響了甲基化DNA與Mecp2的親和力。盡管MeCP2與DNA的連接方式多樣化, 但是MeCP2的染色質(zhì)壓縮作用仍然不變。Georgel等[32]發(fā)現(xiàn)部分MeCP2可能直接發(fā)揮壓縮染色質(zhì)的作用, 不需要與甲基化DNA的連接, 提示MeCP2可能是一種染色質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白。可以推測, MeCP2在核內(nèi)多個區(qū)域與DNA具有不同的連接方式。研究發(fā)現(xiàn), MeCP2在核小體中軸的位置可與甲基化DNA連接, 而在近核仁的區(qū)域可與非甲基化DNA連接。另外, 在基因協(xié)同性表達(dá)時相臨 DNA可形成類環(huán)狀[33], 拉近不同的DNA位點, 便于各種核內(nèi)蛋白的識別與連接。這種情況下, 相隔較遠(yuǎn)的 MeCP2 單體之間可以短暫接近[30], 從而間接的改變與 DNA的連接方式。此外,組蛋白H1在核內(nèi)與MeCP2存在相互競爭關(guān)系, 由于其競爭能力稍遜于MeCP2, 主要起干擾MeCP2非特異性結(jié)合DNA位點的能力[28], 提高M(jìn)eCP2特異結(jié)合甲基化DNA的水平。

3 結(jié) 語

MECP2是 RTT的主要致病基因, MeCP2作為DNA甲基化調(diào)控基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄抑制因子, 其功能異?？赡苤苯訉?dǎo)致下游靶基因的甲基化異常[34]。而DNA甲基化作為表觀遺傳的重要機制之一, 涉及神經(jīng)發(fā)育、突觸形成和突觸可塑性等高級腦功能的調(diào)控。因此, MECP2基因突變干擾了腦的正常發(fā)育,最終導(dǎo)致整個神經(jīng)發(fā)育網(wǎng)絡(luò)癱瘓。RTT致病機理仍有許多未知及不同的觀點[35～38], 如近期研究提出MeCP2的功能可能取決于與其協(xié)作的蛋白性質(zhì)以及它的下游靶基因[39,40]。缺乏MeCP2是否一定導(dǎo)致不可逆性損傷？MeCP2缺乏程度在腦的局部或全腦細(xì)胞是否一致？由于超過一半的非典型RTT患兒檢測不到 MECP2突變, 是否存在其他相互作用的因子,共同作用導(dǎo)致 RTT表型多樣化？如何尋找調(diào)控MeCP2的信號通路改變其轉(zhuǎn)錄水平？解開這些謎團(tuán),都將為治療及預(yù)防RTT提供新的理論依據(jù)。

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