宋紅衛(wèi), 安鐵洙, 樸善花, 王春生

東北林業(yè)大學生命科學學院, 哈爾濱 150040

哺乳動物DNA甲基化及其在體細胞誘導重編程中的作用

宋紅衛(wèi), 安鐵洙, 樸善花, 王春生

東北林業(yè)大學生命科學學院, 哈爾濱 150040

誘導多能干細胞(Induced pluripotent stem cell, iPS)技術提供了將終末分化的細胞逆轉為多潛能干細胞的可能, 在干細胞基礎理論研究和再生醫(yī)學中具有重要意義。然而, 目前體細胞誘導重編程方法效率極低, 常發(fā)生不完全的重編程。研究表明, 在不完全重編程的細胞中存在體細胞的表觀遺傳記憶, 而DNA甲基化作為相對長期和穩(wěn)定的表觀遺傳修飾, 是影響重編程效率和iPS細胞分化能力的重要因素之一。哺乳動物 DNA甲基化是指胞嘧啶第五位碳原子上的甲基化修飾, 常發(fā)生于CpG位點。DNA甲基化能夠調節(jié)體細胞特異基因和多能性基因的表達, 因此其在哺乳動物基因調控、胚胎發(fā)育和細胞重編程過程中發(fā)揮著重要作用。此外, 異常DNA甲基化可能導致iPS細胞基因印記的異常和X染色體的失活。文章重點圍繞DNA甲基化的機制、分布特點、及其在體細胞誘導重編程中的作用進行了綜述。

DNA甲基化; 誘導多能干細胞; 體細胞重編程

哺乳動物是由受精卵經(jīng)過分裂和分化最終形成的復雜的多細胞生命體。不同類型的細胞含有相同的基因組, 但基因的表達具有時空特異性。與原核生物不同, 哺乳動物的DNA、組蛋白、非組蛋白和少量 RNA形成特殊的染色體結構。在染色體中, DNA的甲基化、組蛋白修飾和染色體重塑等表觀遺傳因素都能夠影響相應基因的表達, 在細胞分化和胚胎發(fā)育中具重要作用[1～3]。

1957年, Waddington提出的表觀遺傳模型描述了表觀遺傳在哺乳動物發(fā)育過程中的作用[4]。模型中將分化中的細胞比作山坡上滾落的石頭。受精卵具有全能性, 位于山坡的最頂端; 細胞沿著不同的路徑“滾落”, 最終形成某些成體干細胞和各種終末分化細胞。該模型認為, 細胞不同的分化狀態(tài)由不同的表觀遺傳組所限定和維持, 這就決定了細胞分化的單向性和不可逆性。因此, 分化成熟的體細胞逆轉成多能干細胞的過程中必然發(fā)生表觀遺傳重編程[5,6], 而核移植、細胞融合和誘導多能干細胞等體細胞重編程技術的出現(xiàn), 證明了體細胞的終末分化狀態(tài)在一定條件下能夠發(fā)生逆轉, 從而重編程為多能干細胞。

綜上所述, 細胞發(fā)生重編程必須克服自身的表觀遺傳障礙。DNA甲基化作為一種關鍵的表觀遺傳因素, 能夠維持細胞長期的表觀遺傳記憶, 在細胞重編程中具有重要作用[7,8]。本文重點論述了 DNA甲基化的相關機制及其在細胞誘導重編程中的作用。

1 DNA甲基化

在哺乳動物中, 胞嘧啶第五位碳原子可在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的催化作用下, 由 S-腺苷甲硫氨酸提供甲基, 最終產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶(5mC)[9]。DNA甲基化與基因沉默、基因組的穩(wěn)定性、X染色體失活和遺傳印記等多種生命現(xiàn)象有關[10,11]。DNA甲基轉移酶和催化DNA主動去甲基化酶對于維持和調節(jié)不同分化階段細胞的DNA甲基化水平具有重要作用。此外, DNA甲基化可發(fā)生于基因組的不同區(qū)域, 并通過抑制轉錄因子的結合等方式影響基因的表達。異常的DNA甲基化能夠導致胚胎發(fā)育的異常和某些疾病(如癌癥)的產(chǎn)生, 但其具體機制有待于進一步研究。

1.1 DNA甲基化的分子機制

與DNA甲基化修飾相關的酶有兩種：維持甲基轉移酶(Maintenance methyltransferase)和從頭甲基轉移酶(De novo methyltransferase)。DNMT1是維持甲基轉移酶, 在DNA復制過程中催化新合成鏈的甲基化, 從而維持親代與子代DNA甲基化修飾的一致性[12]。UHRF1蛋白能夠識別并結合半甲基化的DNA鏈, 招募 DNMT1完成甲基化的修飾[13]。Dnmt1在終末分化的細胞中高表達, 而在胚胎干細胞(Embryonic stem cells, ESCs)中幾乎不表達。Dnmt1缺失突變的小鼠細胞中 5mC的水平降低約 2/3, 并導致胚胎死亡[14]。與 DNMT1不同, 從頭甲基轉移酶DNMT3a和DNMT3b的作用不依賴DNA的復制,而在原先未發(fā)生甲基化的特定位點上進行新的甲基化修飾[12,15]。小鼠Dnmt3b高表達于囊胚內細胞團和胚外組織中, Dnmt3b敲除的小鼠胚胎在著床前因發(fā)育異常而死亡。Dnmt3a在胚胎發(fā)育第10.5 d(E10.5)才開始廣泛表達于各種組織細胞中, 而 Dnmt3a表達缺陷的小鼠在出生后的早期死亡[16]。維持甲基轉移酶DNMT3L沒有催化活性, 但能結合到未甲基化的 H3K4(組蛋白 H3第四位賴氨酸)上, 并招募DNMT3a和DNMT3b催化相應DNA位點重新甲基化[17,18]。因此, DNMTs在調節(jié)和維持胚胎發(fā)育過程中正常的DNA甲基化水平中具有重要作用。

Dnmt1的異常表達與某些腫瘤的生長具有相關性, 如淋巴瘤和乳腺癌等[19]。低劑量的 5-氮雜胞苷(5-Azacitidine, 5-Aza)能夠通過抑制DNMT1降低腫瘤干細胞(CSCs)的數(shù)量, 并延長小鼠的存活時間[20],其原因可能是DNMT1催化了某些抑癌基因和干性相關通路基因啟動子區(qū)的高甲基化, 從而維持了CSCs的致癌性和增殖能力。

1.2 DNA去甲基化的分子機制

DNA去甲基化有被動和主動兩個不同的途徑。DNA被動去甲基化是由于 Dnmt1表達的缺失, 在DNA復制時新合成的鏈不能被甲基化修飾, 因而全基因組的甲基化隨著細胞分裂被“稀釋”[15]。例如,小鼠早期卵裂時Dnmt1表達水平很低, 而DNA甲基化水平隨著細胞的分裂逐漸降低[21]。DNA主動去甲基化需要特定的酶參與, 如 TET家族(Ten-eleven translocation family)蛋白(包括TET1、TET2和TET3)能使 5mC氧化形成 5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC), 并且5hmC能被TETs進一步氧化形成 5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine, 5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine, 5caC)[15,22]。5fC和5caC被胸腺嘧啶 DNA糖基化酶(Thymine-DNA glycosylase, TDG)進一步修飾, 最終通過堿基修復途徑轉變?yōu)榘奏23]。另外, 激活誘導胞啶脫氨酶(Activation-induced cytidine deaminase, AID)可能使5mC發(fā)生脫氨基作用, 形成 5-羥甲基尿嘧啶(5-hydroxymethyluracil, 5hmU), 再通過堿基切除修復最終完成DNA主動去甲基化[22～24]。

DNA主動去甲基化對胚胎的正常發(fā)育具有重要影響。TET3是成熟卵母細胞中的一種重要的母源性因子, 在受精后雄原核DNA主動去甲基化過程中具有重要作用[25]。小鼠囊胚內細胞團中Tet1和Tet2表達豐富, 但隨著細胞分化和胚胎發(fā)育而逐漸降低[26]。TET1能通過去甲基化作用調節(jié)多能性基因(如Nanog、Esrrb、Klf4和 Prdm14等)的表達, 而利用siRNA技術干擾Tet1的表達后, ESCs的多潛能性降低, 并且容易分化為胚外組織[22,27]。因此, TET1和TET2可能是 ESCs多能性調控網(wǎng)絡中的一部分。TETs和5hmC的水平能夠影響胚胎的正常發(fā)育, 如造血干細胞、腦組織和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[28], 而人類中 TET1和 TET2的異常表達可能與某些腫瘤相關,如前列腺癌和結腸癌等[29]。

1.3 DNA甲基化的分布特點

哺乳動物體細胞中 5mC幾乎全部發(fā)生于 CpG位點上, 但在人類胚胎干細胞(hESCs)中發(fā)現(xiàn), 約有25%的 5mC發(fā)生于非 CpG(Non-CpG)位點上, 如CpA和CpT[6,30]。非CpG位點5mC的發(fā)生與DNMT3a和DNMT3b的作用有關[31]。已經(jīng)有研究證實非CpG位點的甲基化對 ESCs多能性的維持具有一定作用,但其具體的分布情況和功能仍有待進一步的研究。

DNA甲基化可發(fā)生于基因組的不同區(qū)域, 如基因的啟動子、遠端調控序列、轉錄區(qū)和側翼序列等[3,32,33]。這些不同區(qū)域的甲基化對基因轉錄的調節(jié)有所不同。例如啟動子或增強子的高甲基化常引起基因的轉錄沉默, 而基因轉錄區(qū)的甲基化則可能與基因的轉錄激活有關。當基因的啟動子含有高水平的甲基化時, 其附近的染色體結構常發(fā)生凝聚, 暗示 DNA甲基化與組蛋白修飾因子或染色體重塑因子的相互作用, 但其具體機制尚不清楚。

某段 DNA序列的甲基化水平往往與該段序列CpG的密度呈負相關[32]。低密度 CpG(low-CpG)序列常發(fā)生高甲基化, 見于大多數(shù)組織特異性基因(Tissue-specific genes)中[15,32,34]。而高密度CpG(high-CpG)序列常維持相對低水平的甲基化, 主要包括持家基因和發(fā)育相關基因等[15,35]。低密度CpG序列的高甲基化可能作為一種比較長期和穩(wěn)定的表觀遺傳修飾, 從而在相當長的時期內維持體細胞正常的表觀遺傳特征。某段DNA序列中CpG密度大于50%且長度大于200 bp時稱為CpG島(CpG island, CpGi)[36]。多能性基因和發(fā)育相關基因的啟動子常含有 CpG島[15,37]。Mohn等[38]將小鼠ESCs誘導分化為神經(jīng)祖細胞和神經(jīng)細胞后, 利用甲基化DNA免疫沉淀技術(MeDIP)分析全基因組啟動子的甲基化, 發(fā)現(xiàn)某些含CpG島的基因啟動子在神經(jīng)發(fā)育的早期即被甲基化, 并且這些基因的甲基化大部分是神經(jīng)細胞所特有的, 對于其命運的決定具有重要作用。

1.4 DNA甲基化與基因的表達

DNA甲基化是影響基因表達調控的重要因素。基因啟動子的甲基化能夠阻礙轉錄因子與 DNA的結合, 從而抑制轉錄。例如, 多能性轉錄因子c-Myc的識別靶序列CACGTG中含有CpG, 后者被甲基化后降低了 c-Myc與靶序列的親和力, 影響基因轉錄[39]。而FoxA1蛋白能夠結合到被甲基化的基因遠端調控序列上[40]。此外, 基因側翼序列的甲基化可使染色體結構更加穩(wěn)定, 不利于轉錄因子的結合從而抑制轉錄起始復合物的形成。因此對于不同的轉錄因子, 在基因組上結合的區(qū)域(如啟動子和遠端調控序列等)不同, DNA甲基化對其調節(jié)作用也不同。此外, 甲基化的DNA可通過甲基化CpG結合蛋白影響相關基因表達。例如, 甲基化 CpG結合蛋白2(Methyl-CpG-binding protein2, MeCP2)是人類神經(jīng)發(fā)育的關鍵轉錄調控因子, 能夠結合5mC并招募組蛋白去乙酰化酶(HDACs)使組蛋白去乙?；? 最終使基因處于沉默狀態(tài)[41]。甲基化 CpG 結合蛋白MBD3能識別并結合5hmC, 是核小體重塑去乙?；?Nucleosome remodeling deacetylase, NuRD)復合物的一部分[42]。TET1催化 5mC轉變?yōu)?5hmC后, MBD3作為DNA序列上5hmC的“閱讀器”(Reader of 5hmC)介導 NuRD對組蛋白的去乙?；饔? 進而導致基因沉默[6,42,43]。因此, 甲基化CpG結合蛋白能將兩個重要的表觀遺傳因素——DNA甲基化和組蛋白修飾聯(lián)系起來, 共同調節(jié)基因的表達。目前DNA甲基化和組蛋白修飾相互作用的具體機制仍不清楚, 相關領域的研究對于進一步揭示DNA甲基化在基因調控中的作用具有重要意義。

2 DNA甲基化在體細胞誘導重編程中的作用

2.1 體細胞誘導重編程

Waddington的表觀遺傳模型認為動物細胞的分化是不可逆的。而1962年, Gurdon[44]將蝌蚪(Xenopus laevis)中腸上皮細胞的細胞核移植到去核卵母細胞中并成功發(fā)育為性成熟的蛙, 首次在理論上證明了動物終末分化的細胞能夠發(fā)生逆轉。1987年, Lassar等[45]通過外源表達一個轉錄因子 MyoD, 將成纖維細胞轉化為肌細胞。這項研究暗示了只需通過外源轉錄因子的誘導即可使細胞發(fā)生重編程。2006年, Yamanaka等[46]通過外源表達 4個多能性轉錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc, 將小鼠胚胎皮膚成纖維細胞轉變?yōu)榫哂蓄愃朴?ESCs多向分化潛能和自我更新能力的誘導多能干細胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)。目前, iPSCs可以由多種終末分化的細胞得到, 并可直接來源于病人的體細胞。iPS技術避免了人類胚胎干細胞研究的倫理和自體免疫等重大問題, 因而在細胞移植、藥物篩選和疾病模型的建立中具有巨大的應用前景。近年來 iPS技術不斷發(fā)展, 例如減少外源誘導因子的使用, 以及誘導過程中非整合型載體、小分子化合物和 microRNA的應用等[47～49]。然而這些方法與技術上的改進仍無法徹底解決 iPS的低效性、致癌性和免疫原性等問題, 而這些問題的解決是未來體細胞重編程能否更廣泛地應用于再生醫(yī)學的關鍵。

2.2 DNA甲基化是體細胞誘導重編程的重要障礙

目前的研究表明, 體細胞被誘導為 iPSCs的過程中經(jīng)歷了一系列有序的生物學事件, 包括外源基因的表達、全基因組組蛋白修飾的改變、間充質細胞向上皮樣細胞的轉化(Mesenchymal-to-epithelial transition, MET)、內源多能性轉錄因子的激活和全集因組DNA的去甲基化等[2,3,50]。因此, 表觀遺傳的改變是誘導多能干細胞所必需的。相比于組蛋白修飾, DNA的去甲基化是一個相對緩慢且低效的過程。全基因組甲基化狀態(tài)的改變發(fā)生于 iPS的最后階段, 推測其可能是 iPS的限速步驟, 決定最終iPSCs產(chǎn)生的效率和分化能力。DNA甲基化在誘導多能干細胞中的作用有以下4方面：

(1) 不徹底的DNA甲基化重編程降低了iPSCs的分化能力。為探究DNA甲基化對iPSCs分化潛能的影響, Kim等[51]通過四因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)的誘導, 經(jīng)過較少的傳代次數(shù)(Low-passage),分別將成年小鼠的血細胞和成纖維細胞重編程為iPSCs。然后在相同的誘導條件下, 血細胞來源的iPCSs(B-iPSCs)更傾向于分化為造血細胞, 而成纖維細胞來源的iPSCs(F-iPSCs)更易分化成骨細胞。進一步利用基于全基因組高通量芯片的相對甲基化(Comprehensive high-throughput array-based relative methylation, CHARM)分析和比較不同細胞中全基因組的甲基化, 發(fā)現(xiàn)B-iPSCs 和F-iPSCs都與ESCs存在大量的差異甲基化區(qū)域(Differentially methylated regions, DMRs)。在B-iPSCs 和F-iPSCs 中24個最為明顯的DMRs中, 分布有11個與血細胞發(fā)育相關的基因和3個骨細胞發(fā)育相關的基因。因此在iPS過程中, DNA甲基化未發(fā)生徹底的重編程, 從而導致B-iPSCs和 F-iPSCs中都含有原初體細胞的表觀遺傳“記憶”, 并最終限制了iPSCs的分化能力。提高 iPSCs的傳代次數(shù)有利于表觀遺傳“記憶”的擦除, 但也可能增加基因突變和癌變的風險。

(2) 促進DNA去甲基化有利于提高iPSCs的產(chǎn)生效率。體細胞誘導為多能干細胞通常需要幾周甚至數(shù)周時間, 并且誘導效率極低。在iPS過程中添加DNMT1的抑制物5-Aza, 或者利用siRNA技術干擾Dnmt1的表達, 重編程效率明顯提高[50,52]。這說明重編程過程中DNA發(fā)生了被動的去甲基化。由于DNA被動去甲基化依賴細胞的分裂, 是一個相對緩慢的過程, 因而可能是iPS低效性的原因之一。

(3) iPS過程中細胞通過DNA去甲基化開啟多能性基因的表達, 同時通過高甲基化關閉體細胞特異基因的表達。多能性基因(如Oct4和Nanog等)特異表達于ESCs中, 對iPSCs的自我更新和多向分化能力至關重要[53]。多能性基因的啟動子在體細胞中被高甲基化并且處于轉錄沉默狀態(tài), 在 iPS過程中必須通過 DNA去甲基化而重新激活。有學者發(fā)現(xiàn)TET1和TET2能通過催化DNA的主動去甲基化作用, 促進多能性基因(如 Nanog、Esrrb、Klf4和Prdm14等)的表達[26,54]。因此, 重編程過程中也發(fā)生了DNA的主動去甲基化, 而TET1/2等主動去甲基化酶能有效地提高誘導多能干細胞的重編程效率,是未來相關領域研究的重點內容。與多能性基因不同, 體細胞特異基因在 iPS過程中必須通過啟動子的重新甲基化而關閉其表達, 否則將導致不完全的重編程[55]。因此在iPS過程中, DNA甲基化和去甲基化同時存在, 從而影響不同類型基因的表達。DNA甲基化與去甲基化的這種復雜的平衡對體細胞誘導重編程至關重要。通過促進DNA去甲基化提高 iPS的效率, 可能會引起體細胞基因的表達從而導致細胞發(fā)生不完全的重編程。

(4) DNA的異常甲基化可能導致iPSCs基因印記的異常和X染色體的失活。例如, Akutsu等[56]比較了小鼠ESCs和iPSCs的全基因組甲基化狀態(tài), 發(fā)現(xiàn)印記位點Dlk1-Dio3在iPSCs中異常高甲基化并處于轉錄沉默狀態(tài)。Dlk1-Dio3的沉默降低了iPSCs的分化潛能, 而添加維生素 C有助于抑制 Dlk1-Dio3的高甲基化, 其機制可能是 Vc對于 TETs的激活,后者導致 DNA的主動去甲基化[57]。人類胚胎在著床前的發(fā)育過程中, X染色體并未失活。而 Tchieu等[58]發(fā)現(xiàn), 女性來源的iPSCs中X染色體處于失活狀態(tài), 可能是XIST基因的啟動子被高甲基化且處于轉錄沉默狀態(tài)。DNA的異常甲基化可能與iPSCs的培養(yǎng)條件有關, 但其中的具體因素仍不清楚, 相關方面的研究將有助于iPS在醫(yī)學上的應用。

雖然 iPS的低效性、致癌性和免疫原性等問題尚未得到有效解決, 而其他體細胞重編程方法(如核移植)似乎有更大的局限性。然而, 近年來的研究表明核移植在去除體細胞表觀遺傳記憶方面比 iPS更加充分和有效。例如 Daley等[51]證明了核移植多能干細胞(ntESCs)全基因組的去甲基化比 iPSCs更為徹底, 并且具有更強的分化能力, 其原因可能是去核卵母細胞中所含的多能性因子和去甲基化酶更加豐富或多樣。此外最近的一項研究表明, 體細胞核移植能夠更有效地提高端粒酶和線粒體的活性, 并且其所得到的多能干細胞比 iPSCs有更強的分化潛能和自我更新能力[59]。

3 結語與展望

探索 DNA甲基化與去甲基化確切的分子機制是理解其在體細胞誘導重編程中作用的基礎。哺乳動物能夠精確和嚴格地調節(jié)不同基因在不同發(fā)育時期的甲基化程度。然而目前發(fā)現(xiàn)的參與DNA甲基化與去甲基化的酶一般作用于全基因組, 并不具備基因或位點的特異性。進一步探索DNA甲基化在細胞重編程過程中作用的關鍵在于研究細胞是如何在確保某些基因發(fā)生去甲基化的同時, 而又使另外一些基因發(fā)生重新甲基化。最近的一項研究發(fā)現(xiàn), CEBPA基因轉錄的一個非編碼 RNA(Non-coding RNA, ncRNA)能夠特異性地結合并抑制 DNMT1, 從而調節(jié)CEBPA基因本身的甲基化修飾[60]。因此某些基因可特異性地調節(jié)自身的甲基化修飾進而影響其表達狀態(tài)。此外, 一些長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs, lncRNAs)通過招募 DNMT3引起相應位點DNA的甲基化, 從而進一步導致染色體處于轉錄抑制狀態(tài), 在細胞分化和胚胎發(fā)育中具有重要作用[61]。因此非編碼RNA對于特定基因甲基化修飾的調節(jié)作用, 可能有助于理解細胞是如何調節(jié)不同類型基因甲基化和去甲基化之間的平衡。另外, DNA甲基化與組蛋白修飾等其他表觀遺傳因素能夠相互影響, 在體細胞重編程過程中發(fā)揮重要作用, 但對其分子機理仍不十分清楚。研究DNA甲基化與組蛋白修飾之間的關系將有助于進一步揭示胚胎發(fā)育和細胞重編程的表觀遺傳機制。

iPS技術在建立疾病模型、避免自體免疫和解決倫理等問題上展現(xiàn)了巨大的優(yōu)越性。然而目前iPSCs的誘導效率極低, 且常發(fā)生不完全的表觀遺傳重編程。在不完全重編程的細胞中常含有體細胞的表觀遺傳記憶, 暗示DNA甲基化是體細胞誘導重編程的重要障礙。不徹底的DNA去甲基化使iPSCs具有分化的傾向性, 而多能干細胞的定向誘導一直以來是干細胞及再生醫(yī)學研究的難點, 因此利用DNA甲基化對細胞分化傾向性的影響可能有助于實現(xiàn) iPSCs的定向誘導。iPS過程中DNA甲基化的重編程具有雙向性, 即對于不同類型的基因, DNA甲基化和去甲基化同時發(fā)生。其中DNA去甲基化包括主動和被動兩個過程, 而DNA被動去甲基化依賴DNA的復制和細胞的分裂, 可能是iPS低效性的重要原因。小分子物質（如5-Aza）能夠促進體細胞的重編程, 但也可能破壞iPS過程中DNA甲基化和去甲基化之間的平衡, 從而導致DNA的異常去甲基化。目前仍不清楚DNA甲基化對iPSCs致癌性和免疫原性等問題的影響, 而這可能成為未來相關領域研究的熱點問題。進一步探討DNA甲基化在體細胞重編程中的作用對于重編程技術的理論研究和實際應用都具有重要意義。

[1] Cantone I, Fisher AG. Epigenetic programming and reprogramming during development. Nat Struct Mol Biol, 2013, 20(3): 282–289.

[2] Apostolou E, Hochedlinger K. Chromatin dynamics during cellular reprogramming. Nature, 2013, 502(7472): 462–471.

[3] Papp B, Plath K. Epigenetics of reprogramming to induced pluripotency. Cell, 2013, 152(6): 1324–1343.

[4] Waddington CH. The Strategy of the Genes. London: George Allen & Unwin, 1957.

[5] Hochedlinger K, Plath K. Epigenetic reprogramming and induced pluripotency. Development, 2009, 136(4): 509–523.

[6] Watanabe A, Yamada Y, Yamanaka S. Epigenetic regulation in pluripotent stem cells: a key to breaking the epigenetic barrier. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2013, 368(1609): 20120292, doi: 10.1098/rstb.2012.0292.

[7] Simonsson S, Gurdon J. DNA demethylation is necessary for the epigenetic reprogramming of somatic cell nuclei. Nat Cell Biol, 2004, 6(10): 984–990.

[8] Koche RP, Smith ZD, Adli M, Gu H, Ku M, Gnirke A, Bernstein BE, Meissner A. Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling. Cell Stem Cell, 2011, 8(1): 96–105.

[9] Sulewska A, Niklinska W, Kozlowski M, Minarowski L, Naumnik W, Niklinski J, Dabrowska K, Chyczewski L. DNA methylation in states of cell physiology and pathology. Folia Histochem Cytobiol, 2007, 45(3): 149–158.

[10] Bestor TH, Bourc'his D. Transposon silencing and imprint establishment in mammalian germ cells. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 2004, 69: 381–387.

[11] Jaenisch R, Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet, 2003, 33(Suppl.): 245–254.

[12] Goll MG, Bestor TH. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annu Rev Biochem, 2005, 74(1): 481–514.

[13] Bostick M, Kim JK, Esteve PO, Clark A, Pradhan S, Jacobsen SE. UHRF1 plays a role in maintaining DNA methylation in mammalian cells. Science, 2007, 317(5845): 1760–1764.

[14] Li E, Bestor TH, Jaenisch R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell, 1992, 69(6): 915–926.

[15] Koh KP, Rao A. DNA methylation and methylcytosine oxidation in cell fate decisions. Curr Opin Cell Biol, 2013, 25(2): 152–161.

[16] Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell, 1999, 99(3): 247–257.

[17] Chen ZX, Mann JR, Hsieh CL, Riggs AD, Chedin F. Physical and functional interactions between the human DNMT3L protein and members of the de novo methyltransferase family. J Cell Biochem, 2005, 95(5): 902–917.

[18] Ooi SK, Qiu C, Bernstein E, Li K, Jia D, Yang Z, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Lin SP, Allis CD, Cheng X, Bestor TH. DNMT3L connects unmethylated lysine 4 of histone H3 to de novo methylation of DNA. Nature, 2007, 448(7154): 714–717.

[19] 許力凡, 張記, 田志強, 吳玉章. 表觀遺傳學與腫瘤干細胞. 遺傳, 2013, 35(9): 1049–1057.

[20] Tsai HC, Li HL, Van Neste L, Cai Y, Robert C, Rassool FV, Shin JJ, Harbom KM, Beaty R, Pappou E, Harris J, Yen RW, Ahuja N, Brock MV, Stearns V, Feller-Kopman D, Yarmus LB, Lin YC, Welm AL, Issa JP, Minn I, Matsui W, Jang YY, Sharkis SJ, Baylin SB, Zahnow CA. Transient low doses of DNA-demethylating agents exert durable antitumor effects on hematological and epithelial tumor cells.Cancer Cell, 2012, 21(3): 430–446.

[21] Feng S, Jacobsen SE, Reik W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science, 2010, 330(6004): 622–627.

[22] Kohli RM, Zhang Y. TET enzymes, TDG and the dynamics of DNA demethylation. Nature, 2013, 502(7472): 472–479.

[23] Seisenberger S, Peat JR, Hore TA, Santos F, Dean W, Reik W. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2013, 368(1609): 20110330, doi: 10.1098/rstb.2011.0330.

[24] Nabel CS, Jia H, Ye Y, Shen L, Goldschmidt HL, Stivers JT, Zhang Y, Kohli RM. AID/APOBEC deaminases disfavor modified cytosines implicated in DNA demethylation. Nat Chem Biol, 2012, 8(9): 751–758.

[25] Gu TP, Guo F, Yang H, Wu HP, Xu GF, Liu W, Xie ZG, Shi L, He X, Jin SG, Iqbal K, Shi YG, Deng Z, Szabó PE, Pfeifer GP, Li J, Xu GL. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature, 2011, 477(7366): 606–610.

[26] Koh KP, Yabuuchi A, Rao S, Huang Y, Cunniff K, Nardone J, Laiho A, Tahiliani M, Sommer CA, Mostoslavsky G, Lahesmaa R, Orkin SH, Rodig SJ, Daley GQ, Rao A. Tet1 and Tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell, 2011, 8(2): 200–213.

[27] Freudenberg JM, Ghosh S, Lackford BL, Yellaboina S, Zheng X, Li R, Cuddapah S, Wade PA, Hu G, Jothi R. Acute depletion of Tet1-dependent 5-hydroxymethylcytosine levels impairs LIF/Stat3 signaling and results in loss of embryonic stem cell identity. Nucleic Acids Res, 40(8): 3364–3377.

[28] Song CX, Szulwach KE, Fu Y, Dai Q, Yi CQ, Li XK, Li YJ, Chen CH, Zhang W, Jian X, Wang J, Zhang L, Looney TJ, Zhang BC, Godley LA, Hicks LM, Lahn BT, Jin P, He C. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Biotechnol, 2011, 29(1): 68–72.

[29] Li WW, Liu M. Distribution of 5-hydroxymethylcytosine in different human tissues. J Nucleic Acids, 2011, 2011: 870726, doi: 10.4061/2011/870726.

[30] Lister R, Pelizzola M, Dowen RH, Hawkins RD, Hon G, Tonti-Filippini J, Nery JR, Lee L, Ye Z, Ngo QM, Edsall L, Antosiewicz-Bourget J, Stewart R, Ruotti V, Millar AH, Thomson JA, Ren B, Ecker JR. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature, 2009, 462(7271): 315–322.

[31] Dodge JE, Ramsahoye BH, Wo ZG, Okano M, Li E. De novo methylation of MMLV provirus in embryonic stem cells: CpG versus non-CpG methylation. Gene, 2002, 289(1–2): 41–48.

[32] Lluis F, Cosma MP. Resetting epigenetic signatures to induce somatic cell reprogramming. Cell Mol Life Sci, 2013, 70(8): 1413–1424.

[33] You JS, Kelly TK, De Carvalho DD, Taberlay PC, Liang G, Jones PA. OCT4 establishes and maintains nucleosome-depleted regions that provide additional layers of epigenetic regulation of its target genes. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(35): 14497–14502.

[34] Weber M, Hellmann I, Stadler MB, Ramos L, P??bo S, Rebhan M, Schübeler D. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet, 2007, 39(4): 457–466.

[35] Meissner A, Mikkelsen TS, Gu H, Wernig M, Hanna J, Sivachenko A, Zhang X, Bernstein BE, Nusbaum C, Jaffe DB, Gnirke A, Jaenisch R, Lander ES. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature, 2008, 454(7205): 766–770.

[36] Gardiner-Garden M, Frommer M. CpG islands in vertebrate genomes. J Mol Biol, 1987, 196(2): 261–282.

[37] Liang G, Zhang Y. Embryonic stem cell and induced pluripotent stem cell: an epigenetic perspective. Cell Res, 2013, 23(1): 49–69.

[38] Mohn F, Weber M, Rebhan M, Roloff TC, Richter J, Stadler MB, Bibel M, Schübeler D. Lineage-specific polycomb targets and de novo DNA methylation define restriction and potential of neuronal progenitors. Mol Cell, 2008, 30(6): 755–766.

[39] Prendergast GC, Ziff EB. Methylation-sensitive sequencespecific DNA binding by the c-Myc basic region. Science, 1991, 251(4990): 186–189.

[40] Lupien M, Eeckhoute J, Meyer CA, Wang Q, Zhang Y, Li W, Carroll JS, Liu XS, Brown M. FoxA1 translates epigenetic signatures into enhancer-driven lineage-specific transcription. Cell, 2008, 132(6): 958–970.

[41] Samaco RC, Neul JL. Complexities of Rett syndrome and MeCP2. J Neurosci, 2011, 31(22): 7951–7959.

[42] Yildirim O, Li R, Hung JH, Chen PB, Dong X, Ee LS, Weng Z, Rando OJ, Fazzio TG. Mbd3/NURD complex regulates expression of 5-hydroxymethylcytosine marked genes in embryonic stem cells. Cell, 2011, 147(7): 1498–1510.

[43] Li M, Liu GH, Izpisua-Belmonte JC. Navigating the epigenetic landscape of pluripotent stem cells. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13(8): 524–535.

[44] Gurdon JB. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. J Embryol Exp Morphol, 1962, 10: 622–640.

[45] Davis RL, Weintraub H, Lassar AB. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell, 1987, 51(6): 987–1000.

[46] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006, 126(4): 663–676.

[47] Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, Weir G, Hochedlinger K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science, 2008, 322(5903): 945–949.

[48] Hou P, Li Y, Zhang X, Liu C, Guan J, Li H, Zhao T, Ye J, Yang W, Liu K, Ge J, Xu J, Zhang Q, Zhao Y, Deng H. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science, 2013, 341(6146): 651–654.

[49] Anokye-Danso F, Trivedi CM, Juhr D, Gupta M, Cui Z, Tian Y, Zhang Y, Yang W, Gruber PJ, Epstein JA, Morrisey EE. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell, 2011, 8(4): 376–388.

[50] Mikkelsen TS, Hanna J, Zhang X, Ku M, Wernig M, Schorderet P, Bernstein BE, Jaenisch R, Lander ES, Meissner A. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature, 2008, 454(7200): 49–55.

[51] Kim K, Doi A, Wen B, Ng K, Zhao R, Cahan P, Kim J, Aryee MJ, Ji H, Ehrlich LI, Yabuuchi A, Takeuchi A, Cunniff KC, Hongguang H, McKinney-Freeman S, Naveiras O, Yoon TJ, Irizarry RA, Jung N, Seita J, Hanna J, Murakami P, Jaenisch R, Weissleder R, Orkin SH, Weissman IL, Feinberg AP, Daley GQ. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature, 2010, 467(7313): 285–290.

[52] Han JW, Yoon YS. Epigenetic landscape of pluripotent stem cells. Antioxid Redox Signal, 2012, 17(2): 205–223.

[53] Loh YH, Wu Q, Chew JL, Vega VB, Zhang W, Chen X, Bourque G, George J, Leong B, Liu J, Wong KY, Sung KW, Lee CW, Zhao XD, Chiu KP, Lipovich L, Kuznetsov VA, Robson P, Stanton LW, Wei CL, Ruan Y, Lim B, Ng HH. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat Genet, 2006, 38(4): 431–440.

[54] Wu H, D'Alessio AC, Ito S, Xia K, Wang Z, Cui K, Zhao K, Sun YE, Zhang Y. Dual functions of Tet1 in transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells. Nature, 2011, 473(7347): 389–393.

[55] Ohi Y, Qin H, Hong C, Blouin L, Polo JM, Guo T, Qi Z, Downey SL, Manos PD, Rossi DJ, Yu J, Hebrok M, Hochedlinger K, Costello JF, Song JS, Ramalho-Santos M. Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells. Nat Cell Biol, 2011, 13(5): 541–549.

[56] Stadtfeld M, Apostolou E, Akutsu H, Fukuda A, Follett P, Natesan S, Kono T, Shioda T, Hochedlinger K. Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells. Nature, 2010, 465(7295): 175–181.

[57] Stadtfeld M, Apostolou E, Ferrari F, Choi J, Walsh RM, Chen T, Ooi SS, Kim SY, Bestor TH, Shioda T, Park PJ, Hochedlinger K. Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells. Nat Genet, 2012, 44(4): 398–405.

[58] Tchieu J, Kuoy E, Chin MH, Trinh H, Patterson M, Sherman SP, Aimiuwu O, Lindgren A, Hakimian S, Zack JA, Clark AT, Pyle AD, Lowry WE, Plath K. Female human iPSCs retain an inactive X chromosome. Cell Stem Cell, 2010, 7(3): 329–342.

[59] Le R, Kou Z, Jiang Y, Li M, Huang B, Liu W, Li H, Kou X, He W, Rudolph KL, Ju Z, Gao S. Enhanced telomere rejuvenation in pluripotent cells reprogrammed via nuclear transfer relative to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell, 2013, 14(1): 27–39.

[60] Di Ruscio A, Ebralidze AK, Benoukraf T, Amabile G, Goff LA, Terragni J, Figueroa ME, De Figueiredo Pontes LL, Alberich-Jorda M, Zhang P, Wu M, D'Alò F, Melnick A, Leone G, Ebralidze KK, Pradhan S, Rinn JL, Tenen DG. DNMT1-interacting RNAs block gene-specific DNA methylation. Nature, 2013, 503(7476): 371–376.

[61] Fatica A, Bozzoni I. Long non-coding RNAs: new players in cell differentiation and development. Nat Rev Genet, 2014, 15(1): 7–21.

(責任編委: 張飛雄)

Mammalian DNA methylation and its roles during the induced reprogramming of somatic cells

Hongwei Song, Tiezhu An, Shanhua Piao, Chunsheng Wang

College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China

The technology of induced pluripotent stem cell (iPS) provides the possibility to reverse the terminal differentiated cells to pluripotent stem cells, and is therefore of great importance in both the theoretical research of stem cells and regenerative medicine. However, the efficiency of current induced reprogramming methods is extremely low, and the incomplete reprogramming often happens. It has been reported that some epigenetic memory of the somatic cells exists in these incomplete reprogrammed iPS cells, and DNA methylation, as a relative long-term and stable epigenetic modification, is one of the important factors that influence the efficiency of reprogramming and differentiative capacity of iPS cells. Mammalian DNA methylation, which normally appears on the CpG sites, occurs on the fifth carbon atom of the cytosine ring. DNA methylation can modulate the expression of somatic cell specific genes, and pluripotent genes; hence, it playsimportant roles in the processes of mammalian gene regulation, embryonic development and cell reprogramming. In addition, it has also been found that abnormal DNA methylation may lead to the disorder of genetic imprinting and the inactivation of X chromosome in iPS cells. Therefore, in order to provide a concise guidance of DNA methylation studies in iPS, we mainly review the mechanism, the distribution features of DNA methylation, and its roles in induced reprogramming of somatic cells.

DNA methylation; induced pluripotent stem cell (iPS); somatic reprogramming

2013-12-30;

2014-02-27

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(編號: DL13EA06-02)和國家自然科學基金項目(編號:31000990)資助

宋紅衛(wèi),碩士研究生, 專業(yè)方向：體細胞重編程。E-mail: songhongwei25@163.com

王春生, 博士, 副教授, 研究方向：體細胞重編程。Tel: 0451-82191785; E-mail: wangchunsheng79@163.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0431