張濤濤，王蘭，*，龔頻，陳福欣

（1.陜西科技大學(xué)生命與工程學(xué)院，陜西西安710021；2.西安科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安710054）

金黃色葡萄球菌基因組DNA提取方法的優(yōu)化

張濤濤1，王蘭1，*，龔頻1，陳福欣2

（1.陜西科技大學(xué)生命與工程學(xué)院，陜西西安710021；2.西安科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安710054）

實(shí)驗(yàn)分別采用CTAB法、堿法、改良型堿法、改良型SDS法等提取金黃色葡萄球菌基因組DNA，比較其提取質(zhì)量，對(duì)金黃色葡萄球菌總DNA提取方法進(jìn)行優(yōu)化，以便高效、節(jié)約的應(yīng)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等分子生物學(xué)研究。結(jié)果表明：改良型SDS法穩(wěn)定性好，能夠有效破壁，DNA的質(zhì)量高，A260/A280為1.76，介于1.75～1.85之間。提取所需時(shí)間較少，僅需40min，有利于金黃色葡萄球菌總DNA高效、快捷的提取。

金黃色葡萄球菌；基因組DNA提??；改良型SDS

金黃色葡萄球菌是食品中三大致病菌之一，在自然界中分布廣泛，其毒力因子為葡萄球菌腸毒素SE和侵襲性酶等，在條件適宜時(shí)，即可在很短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生腸毒素[1]，因此，快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地檢測(cè)金黃色葡萄球菌，對(duì)食品安全質(zhì)量控制及食品鏈中致病性細(xì)菌的溯源追蹤具有重要作用。目前，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)因其高靈敏度、高特異性及操作簡(jiǎn)單、迅速等特點(diǎn)，被廣泛的應(yīng)用于食源性致病菌檢測(cè)的研究及開(kāi)發(fā)，而DNA的提取質(zhì)量直接關(guān)系到PCR及其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)而影響其靈敏性，特異性，檢測(cè)限等，因此，亟需建立一種高效、快速的金黃色葡萄球菌基因組DNA提取方法。

金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，具有較厚的細(xì)胞壁，而且90%的金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面都含有蛋白A，并與細(xì)胞壁中的肽聚糖結(jié)合成致密的共價(jià)交聯(lián)結(jié)構(gòu)，增加了提取該基因組DNA的難度。傳統(tǒng)的提取該基因組DNA方法有免疫磁珠法[2]、CTAB法[3]、SDS法[4]以及常用堿法[5]，但是以上方法具有破壁不徹底、提取量少、純度不高等缺點(diǎn)，不利于分子生物學(xué)進(jìn)一步研究，從而不能滿(mǎn)足金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)的需求。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較4種不同的DNA提取方法，優(yōu)化了金黃色葡萄球菌DNA的提取方法，最終確立改良型SDS法是一種較為理想的金黃色葡萄球菌DNA的提取方法，為該菌的進(jìn)一步分子生物學(xué)檢測(cè)提供便利。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源

金黃色葡萄球菌（由陜西科技大學(xué)環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.2 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、酵母膏、牛肉膏等（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；Tris-base（SIGMA）；乙二胺四乙酸鈉（天津市巴斯夫化工有限公司）；SDS（天津福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)）；蛋白酶K、RnaseE、溶菌酶、CTAB（生工生物有限公司）；異丙醇（天津天力化工試劑有限公司）。

溶液1：TrisHCl（pH8.0）25mmol/L；EDTA（pH8.0）10mmol/L；葡萄糖50mmol/L；溶菌酶（現(xiàn)加）5mg/mL。

溶液2：（現(xiàn)用現(xiàn)配）NaOH0.2mol/L；SDS10%（w/v）。

溶液3：25mmol/LKAc 60mL；冰醋酸11.5mL；超純水28.5mL。

1.3 試驗(yàn)儀器

微量移液器（eppendorf）；TGL-16G高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；DDC-10C型水平電泳儀器：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；UV9100-AC220V紫外分光光度計(jì)：北京瑞麗分析儀器有限公司；YXQSG46-280S滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.4 菌種培養(yǎng)法及其菌種鑒定

將金黃色葡萄球菌經(jīng)過(guò)斜面活化、平皿劃線(xiàn)分離培養(yǎng)，然后接種于5mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。取出培養(yǎng)液，并對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色檢驗(yàn)，若其為紫色，則證明其為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。

1.5 基因組DNA提取法

取上述培養(yǎng)得到的菌液1.5mL于eppendorf管中，4℃、12 000 r/min離心2min，棄上清，得到菌體細(xì)胞，然后用200μLTE懸浮一管中的沉淀，并將其吸入第二管中。（將兩管中的沉淀合并為一管，并盡量的小心吹打，使細(xì)菌懸浮，溶液變渾濁。）對(duì)該細(xì)胞懸浮液分別利用以下幾種方法進(jìn)行DNA提取。

方法1：CTAB法[6]。取上述4℃離心后得到的菌體細(xì)胞，進(jìn)行液氮研磨，依次加入10%SDS 30μL、高鹽緩沖液（Tris-Cl 50 mmol/L，pH8.0；EDTA10 mmol/L；NaCl0.7mol/L；CTAB1.5%）150μL，80μLCTAB/NaCl，并分裝到1.5mL的eppendorf管中，60℃水浴40min；加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），輕輕混勻，4℃、12 000 r/min離心5min；取上清液，加入400μL異丙醇，混勻，4℃、12 000 r/min離心5min；棄上清，加入70%的乙醇洗滌沉淀，自然晾干后，用30μL～50μL含有胰RNA酶（20mg/mL）的TE溶解DNA，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

方法2：堿法1[5]。取200μL菌懸液，加入100μL溶液1，劇烈振蕩；加入200μL溶液2，顛倒混勻，冰上靜置5min；加150μL的溶液3，顛倒混勻，冰上靜置5min；12 000 r/min離心5min，取上清液；加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），混勻，5 000 r/min離心10min，取上清；加入2倍體積的無(wú)水乙醇，室溫靜置2min，10 000 r/min離心5min，棄上清；取1mL 70%的乙醇洗滌沉淀，自然晾干后，加入50μL含有胰RNA酶（20mg/mL）的TE，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

方法3：改良?jí)A法1。取200μL菌懸液，加入200μL溶液1混勻；加入300μL新配制的溶液2，靜置5 min；加入300μL預(yù)冷的溶液3，上下顛倒5次，混勻，充分混勻后，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，冰上放置5min；5 000 r/min離心10min，吸上清；加入等體積的氯仿，混勻后，12 000 r/min離心10min；棄上清，加入0.7倍體積的異丙醇，混勻，12 000 r/min離心10min；棄上清，用70%的乙醇洗滌沉淀，自然晾干后，加入50μL含有胰RNA酶（20mg/mL）的TE，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

方法4：對(duì)傳統(tǒng)的SDS法[7]進(jìn)行改良。取200μL菌懸液，加入40μL溶菌酶（20mg/mL）；加30μL 10%的SDS，10μL蛋白酶K（濃度為20mg/mL），混勻，37℃保溫30min；加入250μL 5mol/LNaCl，混勻；取等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提，靜置，5 000 r/min離心10min，移上清液至新離心管；用等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）再次抽提，5 000 r/min離心5min，移上清液至新離心管；加2倍體積的無(wú)水乙醇或0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下靜置5min，離心取沉淀；用70%的乙醇洗滌沉淀后，自然晾干，用30μL～50μL含有胰RNA酶（20 mg/mL）的TE溶解DNA，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 金黃色葡萄球菌DNA提取及質(zhì)量評(píng)定

分別將菌液進(jìn)行濃度梯度稀釋?zhuān)⒗蒙鲜龇椒ǚ謩e進(jìn)行DNA提取，所提取的菌液量均相同，對(duì)提取產(chǎn)物測(cè)定其A260、A280，然后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定其提取效果。

2 結(jié)果

不同方法提取金黃色葡萄球菌DNA質(zhì)量比較結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同方法提取金黃色葡萄球菌DNA質(zhì)量比較Table1 The quality by different extraction methods of Staphylococcus aureus DNA

通過(guò)不同方法多次平行實(shí)驗(yàn)表明，改良型SDS法與兩種堿法提取時(shí)間較短，僅用40min，CTAB法提取時(shí)間最長(zhǎng)；改良型SDS法的A260/A280在1.75～1.85之間，兩種堿法所提取的DNA均含有較多的雜質(zhì)，而CTAB法A260/A280最小，說(shuō)明其中含有大量的蛋白質(zhì)。同時(shí)，不同方法提取DNA的電泳圖見(jiàn)圖1，通過(guò)比較可知改良型SDS法所得到的DNA所對(duì)應(yīng)的條帶最清晰，表明其提取效率高，純度較好。綜合各因素得知改良型SDS法是最佳方法。

圖1 不同方法提取金黃色葡萄球菌基因組DNA電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total DNA from Staphylococcus Aures using different methods

2.2 應(yīng)用改良型SDS法提取金黃色葡萄球菌基因組DNA

電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 改良型SDS法提取金黃色葡萄球菌基因組DNA電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of total DNA from Staphylococcus Aures using modified SDS method

3 討論

分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)因其具有高度的特異性、靈敏度，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品中致病菌的檢測(cè)，但是致病菌的DNA提取速率及質(zhì)量嚴(yán)重影響著PCR等分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)而影響到檢測(cè)的靈敏度及準(zhǔn)確性。金黃色葡萄球菌由于其具有很厚的細(xì)胞壁，因此，諸多傳統(tǒng)的DNA提取方法受到限制，提取效率都比較低，且純度較差。為此，針對(duì)不同的提取方法進(jìn)行了比較研究及優(yōu)化，最終篩選出適合金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌的DNA提取方法。

SDS法是一種較為常用的DNA提取法，其中的SDS可以溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)和蛋白，從而破壞細(xì)胞膜，便于DNA的釋放。唐俊妮等[8]用SDS法結(jié)合CTAB法提取金葡菌中的DNA，獲得較好的DNA提取效果。在本實(shí)驗(yàn)中，采用了溶菌酶、SDS及蛋白酶K，依次加入反應(yīng)體系，由于SDS不僅可以破壞細(xì)胞膜，而且可以促進(jìn)溶菌酶溶液的乳化作用[9]，兩者結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的裂解，從而優(yōu)化了DNA的提取步驟。兩種堿法雖然均可以提取該菌的基因組DNA，且時(shí)間也為40min左右，但其提取的DNA中含有蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)。CTAB法不能有效破壁，提取效果不佳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：改良型SDS法提取金黃色葡萄球菌總DNA比傳統(tǒng)的一系列方法（堿法、CTAB法等）耗時(shí)短，提取效果好，為其它革蘭氏陽(yáng)性菌總DNA的提取提供參考。

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Optimization of Genomic DNA Extraction Method of Staphylococcus aures

ZHANG Tao-tao1，WANG Lan1，*，GONG Pin1，CHEN Fu-xin2
（1.College of Life Science and Technology，Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an 710021，Shaanxi，China；2.School of Chemistry and Chemical Engineering，Xi'an University of Science and Technology，Xi'an 710054，Shaanxi，China）

In this research，traditional methods，including CTAB method，alkaline method，modified alkaline method，and modified SDS method were applied to extract genomic DNA from Staphylococcus aures，also，the yield and quality of DNA were compared in order to establish an effective and economical method for total DNA extraction of Staphylococcus aure.Results showed Modified SDS method is an effective and economical method for DNA extraction of Staphylococcus aure，and can prompt cell lysis，reducing the time needed to only 40min. The yields of DNA extraction is improved，and A260/A280was1.76，which is between 1.75-1.85.

Staphylococcus aures；genome DNA；lysozyme

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.003

2013-03-20

陜西省自然科學(xué)基金（No.2012JQ2011）；陜西省教育廳自然科學(xué)基金（No.12JK0712，12JK0623）；西安市未央?yún)^(qū)項(xiàng)目（No. 201112，201209）

張濤濤（1984—），女（漢），碩士研究生，主要從事食品安全檢測(cè)。

*通信作者：王蘭（1963—），女，教授，主要從事食品安全檢測(cè)研究。