申 薇，梁冰鋒，秦秀紅，秦金金，黃軍巖，程建新*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050011；2.河北女子職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系，河北 石家莊 050091)

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，嚴(yán)重威脅女性健康。目前關(guān)于卵巢癌的治療，除手術(shù)外，以紫杉醇、順鉑等為主的聯(lián)合化療是主要治療手段[1]。然而由于化療藥物在血液、神經(jīng)等方面的不良反應(yīng)，以及多藥耐藥性的產(chǎn)生，嚴(yán)重影響了藥物的化療效果和臨床療效。因此，有必要尋找不良反應(yīng)小的抗腫瘤藥物來改善卵巢癌的治療效果，以提高患者的生存質(zhì)量[2]。那可丁是一種來自于鴉片的鄰苯二甲酸異喹啉生物堿，結(jié)構(gòu)與秋水仙堿相似，一直作為鎮(zhèn)咳藥使用。那可丁能夠與微管蛋白相結(jié)合，使微管蛋白的動態(tài)性能得以改變，進(jìn)而延長了腫瘤細(xì)胞周期有絲分裂的靜止期，達(dá)到抗腫瘤活性的作用，可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長[3]。本實驗采用體外培養(yǎng)的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株作為研究對象，檢測那可丁對細(xì)胞增殖、凋亡及成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)表達(dá)的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器:注射用順鉑購自山東齊魯制藥廠，那可丁、胰蛋白酶、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染液購自美國Sigma公司，磷酸緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、RPMI l640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自天津化學(xué)試劑廠，胎牛血清購自杭州四季青公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購自洛陽華美生物工程公司，F(xiàn)GF-2兔抗人單克隆抗體購自美國Epitomics公司。流式細(xì)胞儀，Epics-XLⅡ型，美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，HT2-125500型，鄭州博賽生物工程公司生產(chǎn)。

1.1.2 細(xì)胞株:人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供。將人卵巢癌SKOV3細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在培養(yǎng)瓶內(nèi)單層傳代培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率：取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，200μL/孔(含5×103個細(xì)胞)，每組設(shè)3個平行孔，分為加生理鹽水的對照組和那可丁(5、10、20、40、80、160μmol/L)組。細(xì)胞培養(yǎng)24、48和72h后，加入MTT(5g/L)20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去上清液，加入DMSO(200μL/孔)，振蕩10min使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀測其在490nm波長處的吸光度(optical delnsity，OD)值，按以下公式計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài):取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，分為加生理鹽水的對照組和那可丁(10、20、40μmol/L)組，細(xì)胞培養(yǎng)48h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡率:取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，分為加生理鹽水的對照組和那可丁(10、20、40μmol/L)組，培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，用無菌冷PBS離心洗滌3次，輕輕振蕩后，加70%酒精固定，4℃保存過夜。PBS離心洗滌細(xì)胞3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，取1mL細(xì)胞懸液，加入PI染液，使其終濃度達(dá)到50mg/L PI，4℃避光染色30min后上流式細(xì)胞儀檢測。分別應(yīng)用Muticycle AV軟件和Expo ADC軟件對細(xì)胞周期的時相分布和細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的蛋白表達(dá)：取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，分為加生理鹽水的對照組和那可丁(10、20、40μmol/L)組，培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，用無菌冷PBS離心洗滌3次，輕輕振蕩后，加70%酒精固定，4℃保存過夜。用PBS離心洗滌細(xì)胞2次，沉淀細(xì)胞后溶于100μL PBS，分別加入FGF-2兔抗人單克隆抗體100μL，避光靜置60min，加入鼠抗兔二抗工作液100μL，對照組只加二抗。避光靜置60min，流式細(xì)胞儀檢測SKOV3細(xì)胞中蛋白的表達(dá)量，以平均熒光強(qiáng)度表示蛋白的含量。

2 結(jié) 果

2.1 那可丁對卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用：隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的增殖抑制率總體呈增高趨勢，但那可丁劑量組中40、80、160μmol/L組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。那可丁作用于SKOV3細(xì)胞24h的半數(shù)細(xì)胞增殖抑制濃度(inhibitory concentration 50,IC50)為46.77μmol/L，作用48h的IC50為22.66μmol/L，作用72h的IC50為19.08μmol/L，細(xì)胞的增殖抑制率隨著作用時間的延長而增強(qiáng)(圖1)。表明那可丁對SKOV3細(xì)胞的抑制存在時間和濃度依賴效應(yīng)。

2.2 那可丁對卵巢癌SKOV3細(xì)胞形態(tài)的影響：對照組卵巢癌SKOV3細(xì)胞圓亮飽滿，排布緊密，呈菱形或梭形，細(xì)胞間界限清楚并隱約可見細(xì)胞核。那可丁作用SKOV3細(xì)胞后，可見到部分細(xì)胞變小變圓、皺縮、破裂、脫落呈懸浮狀，并見到細(xì)胞碎片，且那可丁濃度越高上述細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化越明顯(圖2)。

圖1 卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖抑制率

Figure 1 The growth inhibition rate on human ovarian cancer SKOV3 cells

圖2 卵巢癌SKOV3細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(×100)

A.對照組；B.20μmol/L那可丁組；C.40μmol/L那可丁組

Figure 2 The morphological changes of human ovarian cancer SKOV3 cells (×100)

A.Control group;B.20μmol/L narcotine group;C.40μmol/L narcotine group

2.3 那可丁對卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的影響：與對照組SKOV3細(xì)胞凋亡率(2.87±0.94)%比較，10μmol/L那可丁組凋亡率(3.59±2.83)%差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，20、40μmol/L那可丁組凋亡率分別增加至(10.59±2.99)%、(19.67±4.01)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著那可丁治療濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增高，各劑量組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明那可丁能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并具有劑量依賴性。

2.4 那可丁對卵巢癌SKOV3細(xì)胞周期的影響：與對照組相比，10μmol/L那可丁對SKOV3細(xì)胞周期無明顯影響，而20μmol/L、40μmol/L 那可丁分別使G0/G1期細(xì)胞比例減少17.9%、48.6%，G2/M期細(xì)胞比例增加33.6%、89.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著那可丁濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸降低，G2/M期細(xì)胞比例逐漸升高，40μmol/L那可丁組與10、20μmol/L那可丁組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。表明那可丁對SKOV3細(xì)胞具有G2/M期阻滯作用。

GroupsG0/G1SG2/M Control61.77±4.9721.36±3.6116.87±2.6510μmol/L narcotine54.45±6.7627.94±6.1217.61±4.2120μmol/L narcotine 50.73±2.66?26.67±2.7822.53±2.53?40μmol/L narcotine31.77±9.38?#36.27±10.8732.00±1.80?#

*P<0.05vscontrol group #P<0.05vs10,20μmol/L narcotine groups byANOVA

2.5 那可丁對卵巢癌SKOV3細(xì)胞FGF-2蛋白表達(dá)的影響：對照組FGF-2蛋白表達(dá)量為287.05±10.55，10、20、40μmol/L那可丁組蛋白表達(dá)量分別為284.56±6.33、268.78±7.56、250.72±5.21。與對照組相比，10μmol/L那可丁對FGF-2蛋白表達(dá)無顯著影響，20、40μmol/L那可丁使FGF-2蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著那可丁濃度的增加，F(xiàn)GF-2蛋白表達(dá)逐漸降低，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

目前臨床上常用的微管蛋白抑制劑為長春新堿、紫杉醇等，雖然其療效顯著，但這類藥物有毒性大、水溶性低的特點，并可導(dǎo)致脫發(fā)、骨髓抑制、神經(jīng)病變以及胃腸道毒性等多種不良反應(yīng)。那可丁也可作用微管，可使腫瘤細(xì)胞的紡錘體較早的滅活，導(dǎo)致細(xì)胞無法進(jìn)行有絲分裂并引起腫瘤細(xì)胞死亡。那可丁不僅可以抑制非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌等多種癌細(xì)胞的增殖，而且對一些紫杉醇耐藥細(xì)胞也有較好的抑制作用。本實驗結(jié)果顯示，那可丁明顯抑制SKOV3細(xì)胞生長，并呈劑量和時間依賴性；那可丁作用于SKOV3細(xì)胞24、48、72h的IC50值分別為46.77、22.66、19.08μmol/L，與非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤的IC50值并不相同。表明那可丁對不同腫瘤細(xì)胞作用的敏感性也不一樣[4]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)那可丁可誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡，那可丁作用后的SKOV3細(xì)胞變小皺縮，細(xì)胞間連接減少，細(xì)胞脫落呈懸浮狀，見到細(xì)胞碎片，并出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變。

細(xì)胞分裂的最主要環(huán)節(jié)是紡錘體和微管之間的互變，干擾這一過程的抗微管化合物均能夠阻滯腫瘤細(xì)胞的有絲分裂和細(xì)胞增殖，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡[5]。那可丁作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，可使細(xì)胞周期素B1的表達(dá)增加，磷酸化細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶表達(dá)水平減少，這些周期蛋白的改變與有絲分裂受損引起細(xì)胞死亡時蛋白的改變一致，證實那可丁在調(diào)節(jié)有絲分裂過程中起重要作用[6]。FGF-2是一種具有多種生物活性的細(xì)胞分裂促進(jìn)因子，在細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換中誘導(dǎo)并促進(jìn)G0/G1期細(xì)胞進(jìn)入S期，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、生長和增殖的作用。FGF-2在卵巢癌患者癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。本實驗結(jié)果顯示，那可丁可將SKOV3細(xì)胞阻滯于G2/M期，并降低細(xì)胞內(nèi)FGF-2蛋白的表達(dá)，可能是那可丁誘導(dǎo)細(xì)胞的作用機(jī)制之一。

總之，那可丁具有抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用，其機(jī)制可能與SKOV3細(xì)胞G2/M期阻滯和FGF-2蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

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