高華娟，李希，黃嫣，馮建安，楊華，李遠(yuǎn)輝

·炮制制劑·

HPLC同時(shí)測(cè)定抗骨增止疼片中淫羊藿苷和芒柄花素含量

高華娟1，李希2，黃嫣2，馮建安2，楊華1，李遠(yuǎn)輝1

目的：建立HPLC同時(shí)測(cè)定抗骨增止疼片中淫羊藿苷和芒柄花素的含量方法。方法：采用Shim-pack VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-水為流動(dòng)相，線性梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，流速為1.0 mL．min-1，柱溫為30℃。結(jié)果：淫羊藿苷、芒柄花素進(jìn)樣量分別在0.2760-2.760 μg (r=0.9999）和0.1378-1.378 μg (r=0.9999）范圍內(nèi)與峰面積具有良好線性關(guān)系，平均回收率為 98.58% （RSD=1.18%）和 99.32% （RSD=0.41%）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確，可靠，操作簡(jiǎn)便，可用于抗骨增止疼片中淫羊藿苷和芒柄花素的質(zhì)量控制。

]抗骨增止疼片；高效液相色譜法 ；淫羊藿苷；芒柄花素；含量測(cè)定

抗骨增止疼片是由淫羊藿、雞血藤、威靈仙等藥材組成的中藥復(fù)方制劑，本品具有補(bǔ)肝腎，活血，止痛的功效。用于治療骨質(zhì)增生，瘀血阻絡(luò)諸癥，療效顯著。淫羊藿是方中君藥，具補(bǔ)腎壯陽(yáng)，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕等功效；雞血藤為臣藥，補(bǔ)血活血，舒筋活絡(luò)，可治療腰膝酸痛、肢體麻木、風(fēng)濕麻痹等。淫羊藿苷和芒柄花素分別是淫羊藿和雞血藤的主要有效成分[1]。為保證制劑療效，建立簡(jiǎn)便、快捷的控制方法，本文參照文獻(xiàn)[2～5]，以淫羊藿苷和芒柄花素為定量控制指標(biāo)，采用HPLC對(duì)上述兩種成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示方法穩(wěn)定，簡(jiǎn)便，可用于本品質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），Shim-pack VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）（美國(guó)Agilent公司），DAD檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司），SZ-93型自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮儀器廠），必能信超聲波清洗器（必能信超聲有限公司），BP2110電子天平（Sartorius公司），TU-1901紫外分光(Sartorius公司)。淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)0737-9709，供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）、芒柄花素對(duì)照品（批號(hào)111703-200602，供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供），乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher公司出品），水為超純水（自制），甲醇，乙醇，其它試劑均為分析純，抗骨增止疼片（自制）（批號(hào)：130301、130302、130303）

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品貯備液制備

精密稱(chēng)取芒柄花素對(duì)照品6.89 mg，置10 mL容量瓶中，加乙醇適量，超聲使溶解，用乙醇稀釋至刻度，作為對(duì)照品貯備液，得芒柄花素對(duì)照品貯備液0.689 mg．mL-1。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取淫羊藿苷6.90 mg，置50 mL容量瓶中,和芒柄花素對(duì)照品貯備液5mL，加入乙醇稀釋至刻度，最終得到含淫羊藿苷對(duì)照品0.138 mg．mL-1和芒柄花素對(duì)照品0.0689 mg．mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備[6]

取同一批次抗骨增止疼片6片，除去薄膜，研細(xì)，取約3 g，精密稱(chēng)定，置10 mL容量瓶中，加入70%乙醇10 mL，超聲處理30 min，放置至室溫，加70%乙醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μL微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 陰性溶液制備

按處方比例稱(chēng)取除淫羊藿、雞血藤外的其余藥材，依制備工藝制成缺淫羊藿、雞血藤陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.5 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；保護(hù)柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5 μm);以乙腈(A)-水(B)為流動(dòng)相，線性梯度洗脫，0～6min（A：25→30），6～15min（A：30→33）；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流速：1.0 mL．min-1；進(jìn)樣量：10 μL。淫羊藿苷的理論板數(shù)不低于1500，芒柄花素的理論板數(shù)不低于3000。

2.6 專(zhuān)屬性

取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，進(jìn)樣，陰性對(duì)照對(duì)樣品無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 抗骨增止痛片HPLC圖

2.7 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、20 μL，依次注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，分別得淫羊藿苷回歸方程：Y =1172.1X-0.6021，r=0.9999；芒柄花素回歸方程Y =2179.5X-14.394，r=0.9999。結(jié)果表明，淫羊藿苷進(jìn)樣量在0.2760-2.760 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。芒柄花素進(jìn)樣量在0.1378-1.378 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.8 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果淫羊藿苷和芒柄花素峰面積值的RSD分別為0.20%和0.17%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于0、2、4、8、24、48 h后注入高效液相色譜儀，結(jié)果淫羊藿苷和芒柄花素峰面積的RSD分別為1.86%和1.31%，結(jié)果表明供試品溶液在48h內(nèi)的穩(wěn)定性良好，能夠滿(mǎn)足含量測(cè)定要求。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)同一批樣品（批號(hào)130301）分別取樣6份，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，按“2.5”的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果淫羊藿苷和芒柄花素平均含量分別為0.411 mg/g和0.173 mg/g，RSD分別為1.40%和1.27%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.11 再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)130301），分別在不同時(shí)間由不同的試驗(yàn)人員按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，按“2.5”的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果淫羊藿苷和芒柄花素平均含量分別為0.418 mg/g和0.174 mg/g，RSD分別為1.41%和1.36%。結(jié)果表明，本含量測(cè)定方法的再現(xiàn)性良好。

2.12 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的樣品（批號(hào)為130301，除去薄膜，研細(xì)）1.5g，分別加入適量淫羊藿苷和芒柄花素，按前述供試品溶液的制備方法及色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 淫羊藿苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 芒柄花素回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.13 樣品含量測(cè)定

取3批抗骨增止疼片按前述擬定的含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表3 樣品淫羊藿苷含量測(cè)定結(jié)果

表4 樣品芒柄花素含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

用紫外分光光度法，在200-700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描淫羊藿苷和芒柄花素對(duì)照品溶液及供試品溶液，結(jié)果淫羊藿苷、芒柄花素的最大吸收波長(zhǎng)分別是270 nm和250 nm，但在250 nm處淫羊藿苷和芒柄花素分離效果好，故測(cè)定波長(zhǎng)確定為250 nm。

在試驗(yàn)過(guò)程中，考察了甲醇超聲提取30 min、70%乙醇超聲提取30 min、70%乙醇回流提取1 h的效果，結(jié)果表明，用甲醇超聲提取后測(cè)得淫羊藿苷的含量相較其它2個(gè)方法低，芒柄花素含量3個(gè)方法相近，因加熱回流的方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所以最終選擇70%乙醇超聲提取30 min。

選擇合適的流動(dòng)相梯度對(duì)樣品有效成分分離起著關(guān)鍵的作用，本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫的方法，可以使淫羊藿苷、芒柄花素和干擾雜質(zhì)進(jìn)行有效分離，并同時(shí)測(cè)定這兩個(gè)組分的含量，方法簡(jiǎn)便可行。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:180,306.

[2] 徐菁,周本宏.用HPLC法測(cè)定雞血藤膏中芒柄花素的含量[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2008,21(6):721.

[3] 尹志峰,劉敬閃,張?zhí)m桐.淫羊藿苷的含量測(cè)定方法[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2003,23(8):493.

[4] 童玉璽,徐德然.HPLC-MS法分析朝鮮淫羊藿有效部位化學(xué)成分[J].中國(guó)天然藥物,2006,1(2):21.

[5] 楊戒驕．柱層析-高效液相色譜法測(cè)定乳增寧片中淫羊藿苷含量[J].中國(guó)藥房,2004,15(9):565.

[6] 楊加域,譚旭霞.反相高效液相色譜法分析中藥復(fù)方制劑腎寶片中淫羊藿的含量[J].國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào),2006,12(15):99.

（責(zé)任編輯: 胡慧玲）

Simultaneous determination of icariin and formonone in kangguzeng Zhiteng tablets/

GAO Hua-juan1, LI Xi2, HUANGYan, FENG Jian-an, YANG Hua, LI Yuan-hui//(1. Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, Sichuan; 2. Institute of Traditional Chinese Medicine, Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine sciences, Chengdu 610031, Sichuan)

Objective:To establish a HPLC method for simultaneous determination of icariin and formonone in kangguzeng Zhiteng tablets. Method:The separation was performed on the Shim-pack VP-ODS column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) with acetonitrile-water as the mobile phase. The detection wavelength was at 250 nm, and the fow rate was 1.0 mL．min-1. The column temperature was 30℃. Result:The linear response of icariin ranged from 0.2760 μg to 2.760 μg (r=0.9999). The linear response of formonone ranged from 0.1378 μg to 1.378μg (r=0.9999). The average recovery rates of icariin were 98.58% (RSD=1.18%). The average recovery rates of formonone were 99.32% ,RSD=0.41%. Conclusion:The method is accurate, reliable, simple, and can be used for the quality control of icariin and formonone in kangguzengzhiteng tablets.

kangguzeng Zhiteng tablet; HPLC; icariin; formonone; content determination

R 283.6

A

1674-926X(2014)02-013-03

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所，四川 成都 610031

高華娟（1988-），女，四川彭州人，碩士研究生，主要從事中藥新制劑、新劑型研究

Tel:13082171117 Email:845480633@qq.com

李希（1969-），女，主任中藥師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥新藥、新劑型、新技術(shù)的研究

Tel:028-66449601 Email:syslx2003@aliyun.com

2013-08-05