（中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

甘藍無蠟粉亮綠突變體材料LD10遺傳規(guī)律及分子標記研究

劉東明 楊麗梅*孫培田 李景濤唐 俊 劉澤洲 方智遠 劉玉梅 莊 木 張揚勇

（中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

為了明確結(jié)球甘藍無蠟粉亮綠突變體材料LD10的特征特性及遺傳規(guī)律，測定了LD10的主要農(nóng)藝性狀和營養(yǎng)物質(zhì)含量；對LD10和普通材料21-3的葉面超微結(jié)構(gòu)進行了觀察比較；以LD10和21-3為親本構(gòu)建6世代群體，對LD10無蠟粉亮綠性狀遺傳規(guī)律進行分析。結(jié)果表明：無蠟粉亮綠突變體材料LD10葉面蠟粉呈小顆粒狀結(jié)構(gòu)，缺失嚴重，而普通材料21-3葉面蠟粉呈長棒狀結(jié)構(gòu)，含量豐富，二者具有明顯差異；LD10的無蠟粉亮綠性狀由1個隱性基因（cgl-4）控制，其與SSR標記LT-SSR16緊密連鎖，遺傳距離為4.7 cM。用LD10與另一單基因隱性遺傳的無蠟粉亮綠突變體材料10Q-961雜交獲得F1群體，F(xiàn)1群體單株全部表現(xiàn)為葉面有蠟粉，推斷LD10與10Q-961的無蠟粉亮綠基因位于不同的遺傳位點。

結(jié)球甘藍；無蠟粉亮綠；特征特性；遺傳規(guī)律；分子標記

結(jié)球甘藍（Brassica oleracea L. var. capitata L.）起源于地中海沿岸，屬十字花科蕓薹屬，具有營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富、適應(yīng)性廣、易栽培、耐運輸?shù)忍攸c，我國年栽培面積約90萬hm2（方智遠，2008；楊麗梅 等，2011），在蔬菜周年供應(yīng)和出口貿(mào)易中具有重要地位。普通結(jié)球甘藍外葉、外層球葉及莖表皮均覆有一層蠟粉，葉片表現(xiàn)為綠色、灰綠色或深綠色。無蠟粉亮綠甘藍是普通甘藍的突變體，在其整個生長階段植株體表無蠟粉覆蓋，顏色亮綠，與普通甘藍存在著顯著區(qū)別。初蓮香和王余文（1993）研究發(fā)現(xiàn)無蠟粉亮綠甘藍具有葉片脆嫩，糖、VC及干物質(zhì)等營養(yǎng)成分含量豐富的特點；牟香麗等（2013）通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)甘藍無蠟粉突變體材料葉面蠟粉含量極少，且蠟粉發(fā)育不完全；此外，無蠟粉亮綠甘藍對小菜蛾還具有一定的抗性（Lin et al.，1984；Eigenbrode & Shelton，1990；Eigenbrode et al.，1991；Stoner，1992）。因此，無蠟粉亮綠突變體材料的研究對選育商品性狀美觀、營養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)良的甘藍新品種具有十分重要的意義。

Anstey和Moore（1954）、North和Priestley（1962）、趙建鋒等（2006）、曹陽等（2008）、馮輝等（2010）和李景濤等（2012）分別研究了青花菜、抱子甘藍、菜薹、普通白菜、青梗菜和結(jié)球甘藍無蠟粉亮綠性狀的遺傳方式，均證明其符合單基因隱性遺傳規(guī)律。Mo等（1992）和Pu等（2013）分別報道了編號為W-6和6-1025的甘藍型油菜無蠟粉性狀受1對完全顯性基因控制。周熙榮等（1995）報道甘藍型油菜無蠟粉亮綠性狀呈隱性遺傳，受2對基因控制。從前人的研究結(jié)果可以看出，蕓薹屬作物無蠟粉性狀遺傳規(guī)律較為復(fù)雜，現(xiàn)已報道的大多數(shù)突變體無蠟粉性狀受單個隱性基因控制，單基因顯性或多基因遺傳的遺傳方式較少。

關(guān)于植物表皮蠟質(zhì)基因的研究，目前已從擬南芥（Bernard & Joubes，2013）、水稻（Mao et al.，2012；Zhou et al.，2013）、玉米（ Dietrich et al.，2005；Sturaro et al.，2005）、大麥（Richardson et al.，2007）、小麥（Muria et al.，1999）、小鹽芥（趙寶，2007）等植物上克隆了一些蠟質(zhì)相關(guān)基因，為闡明植物外表皮蠟質(zhì)合成、運輸及調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。李景濤等（2012）、牟香麗等（2013）、Pu等（2013）、Zhang等（2013）對結(jié)球甘藍、甘藍型油菜、大白菜等蕓薹屬植物無蠟粉亮綠性狀分子標記及基因定位進行了研究，獲得一些與無蠟粉性狀控制基因緊密連鎖的分子標記。但是這些標記與甘藍無蠟粉性狀控制基因間的遺傳距離仍較遠，需要進一步尋找與無蠟粉基因連鎖更加緊密的分子標記，為無蠟粉基因的精確定位和克隆奠定基礎(chǔ)。

中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所甘藍課題研究組已搜集獲得6份無蠟粉亮綠甘藍材料，編號分別為10Q-385、10Q-961、10Q-974、LD10、21-3油和大綠，其中10Q-385和21-3油表現(xiàn)為扁球型，其余4份材料均為圓球型；10Q-385的熟性為晚熟，其余5份材料為早熟或中熟。本試驗以圓球型中熟材料LD10為試材，對其主要農(nóng)藝性狀和營養(yǎng)物質(zhì)含量進行了測定，通過掃描電鏡觀察比較了無蠟粉亮綠突變體材料LD10和普通材料21-3的葉表面超微結(jié)構(gòu)，從農(nóng)藝性狀和微觀層面進一步了解了無蠟粉亮綠突變體材料LD10的特征特性；通過構(gòu)建6世代群體和遺傳規(guī)律分析，明確了LD10無蠟粉亮綠性狀的遺傳規(guī)律；通過引物篩選，獲得1個與LD10無蠟粉亮綠性狀緊密連鎖的SSR標記，為無蠟粉亮綠基因的進一步定位與克隆提供了可利用的分子標記，從而加快結(jié)球甘藍無蠟粉亮綠性狀種質(zhì)的研究和利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2011～2013年在本所南口農(nóng)場及甘藍課題研究組實驗室進行。以LD10和21-3為親本構(gòu)建6世代群體；用10Q-961和LD10雜交獲得另一個F1群體。其中LD10由本所甘藍課題研究組于2010年搜集得到，表現(xiàn)為植株體表無蠟粉，圓球形，開展度中等，外葉數(shù)13片左右，中熟；21-3為本所甘藍課題研究組自有高代自交系材料，植株體表有蠟粉，扁球形，開展度較大，外葉數(shù)14片左右，中熟；10Q-961由北京華耐種子有限公司提供，植株體表無蠟粉，圓球形，開展度中等，外葉較直立，外葉數(shù)13片左右，生長勢較強，其遺傳規(guī)律為單基因隱性遺傳（李景濤 等，2012）。

1.2 試驗方法

1.2.1 群體構(gòu)建及農(nóng)藝性狀調(diào)查 2011年7月初播種LD10和21-3的種子；2012年3～6月進行溫室人工授粉，并獲得F1群體種子；2012年7月初播種F1、雙親及10Q-961的種子，8月下旬定植；于成熟期對LD10植株農(nóng)藝性狀和VC、總糖等營養(yǎng)物質(zhì)含量進行調(diào)查、測定，調(diào)查、測定項目包括單球質(zhì)量、球徑、中心柱長、球形、熟性和干物質(zhì)、總糖、蛋白、VC、粗纖維含量，其中農(nóng)藝性狀的測量值取21株單株的平均值，營養(yǎng)物質(zhì)含量的測定采用取3個成熟葉球后混樣測定的方法。2013年3～6月進行溫室人工授粉，獲得F2、BC1、BC2群體種子；以LD10和10Q-961雜交獲得另一個F1群體種子，用于判斷兩材料無蠟粉性狀控制基因間的關(guān)系。2013年7月初播種各群體種子，于3～4葉期調(diào)查、記錄各群體中有、無蠟粉植株數(shù)據(jù)，采用SAS統(tǒng)計分析軟件進行卡平方測驗。

1.2.2 掃描電鏡觀察 于結(jié)球期取無蠟粉亮綠突變體材料LD10和普通材料21-3最內(nèi)層外葉，將新鮮葉片沖洗干凈，避開葉脈切成5 mm×10 mm的長方形小塊，2%鋨酸熏蒸24 h，自然風干24 h，然后將樣品用銀膠固定在樣品臺上，噴金，置于日立S-570掃描電鏡下進行觀察，放大倍數(shù)為3 000倍。

1.2.3 DNA池構(gòu)建 采用CTAB法（謝景梅 等，2006）提取幼嫩葉片DNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和純度，用紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度。采用BSA法（白鳳虎 等，2006），在F2群體中分別隨機選取8株無蠟粉亮綠單株和8株有蠟粉單株，將其DNA分別等量混合，構(gòu)建無蠟粉單株DNA混池和有蠟粉單株DNA混池。

1.2.4 SSR分子標記分析 利用混池對引物進行篩選，挑選在兩池間表現(xiàn)出差異性條帶的引物，對差異性引物再用雙親、F1和F2群體單株進行驗證。PCR反應(yīng)體系為10 μL：模板2.0 μL、Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL、10×PCR buffer（25 mmol·L-1MgCl2）1.0 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）0.8 μL、Forward Primer（5 pmol·L-1）0.4 μL、Reverse Primer（5 pmol·L-1）0.4 μL、ddH2O5.2 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸7 min，擴增產(chǎn)物4 ℃保存。8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，設(shè)恒定電壓100 W，銀染法染色（許紹斌 等，2002）。

1.2.5 數(shù)據(jù)記錄與連鎖分析 將篩選出的SSR標記在雙親及F2群體中進行驗證。F2群體中與無蠟粉亮綠親本LD10帶型一致的記為a，與有蠟粉親本21-3帶型一致的記為b，與F1帶型一致的記為h，未擴增出條帶或條帶模糊不清的記為-。利用Joinmap 4.0軟件進行連鎖分析，繪制連鎖圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LD10葉表皮微觀結(jié)構(gòu)

如圖1所示，在放大3 000倍視野下，無蠟粉亮綠突變體材料LD10葉面光滑，下表皮幾乎沒有蠟粉，上表皮只有極少量蠟粉覆蓋，且蠟粉呈小顆粒狀結(jié)構(gòu)；普通材料21-3葉面蠟粉含量豐富、分布致密，上、下表皮均有大量蠟粉覆蓋，且蠟粉呈長棒狀結(jié)構(gòu)，兩者之間具有明顯差異。

2.2 LD10特征特性

農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果顯示，無蠟粉亮綠突變體材料LD10生育期80 d左右，葉色亮綠，圓球形，橫徑14.82 cm，縱徑12.65 cm，開展度中等（47.86 cm），中心柱長6.51 cm，外葉數(shù)13片左右，單球質(zhì)量0.55 kg，表現(xiàn)出較好的商品性。

圖1 LD10和21-3葉表皮微觀結(jié)構(gòu) （×3 000）

營養(yǎng)物質(zhì)含量測定結(jié)果表明，無蠟粉亮綠突變體材料LD10干物質(zhì)含量7.82%、總糖3.39%、VC 524.00 mg·kg-1、蛋白1.87%、粗纖維0.64%，營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，對選育商品性狀美觀、營養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)良的甘藍新品種具有重要意義。

2.3 無蠟粉亮綠性狀遺傳規(guī)律分析

圖2 LD10、21-3及其F1葉片微觀結(jié)構(gòu) （×3 000）

圖3 LD10、21-3及其F1田間性狀

以LD10和21-3為親本構(gòu)建6世代群體，F(xiàn)1群體16株單株全部表現(xiàn)為葉面有蠟粉（圖2、3）；F2群體有蠟粉植株667株，無蠟粉植株231株，分離比例為2.89∶1，經(jīng)卡平方測驗符合3∶1（χ2=0.831＜=3.841）的分離比例；以有蠟粉的21-3為回交親本獲得的回交群體中，180株單株全部表現(xiàn)為葉面有蠟粉；而與無蠟粉的親本LD10回交獲得的回交群體中，有蠟粉植株161株，無蠟粉植株157株，分離比例為1.03∶1，經(jīng)卡平方測驗符合1∶1（χ2=0.057＜=3.841）的分離比例（表1）。表明結(jié)球甘藍LD10的無蠟粉亮綠性狀由隱性單基因控制。

本所甘藍課題研究組之前已研究報道了另一份無蠟粉亮綠突變體材料10Q-961，并確定其遺傳方式符合單基因隱性遺傳規(guī)律（李景濤 等，2012）。為了研究LD10與10Q-961無蠟粉亮綠性狀控制基因之間的關(guān)系，用LD10與10Q-961雜交獲得另一個F1群體，調(diào)查發(fā)現(xiàn)該群體內(nèi)23株單株均表現(xiàn)為葉面有蠟粉（圖4、5）。表明這兩份材料雖同為無蠟粉亮綠突變體，但控制無蠟粉亮綠性狀的基因可能位于不同的遺傳位點。

表1 LD10、21-3及其后代無蠟粉亮綠性狀卡平方測驗結(jié)果

圖4 LD10、10Q-961及其F1葉片微觀結(jié)構(gòu) （×3 000）

圖5 LD10、10Q-961及其F1田間性狀

2.4 引物篩選及連鎖距離的確定

利用構(gòu)建的無蠟粉單株DNA池和有蠟粉單株DNA池對4 753對引物進行篩選，其中Scaffolds SSR引物1 916對，根據(jù)甘藍全基因組測序組裝（王萬興，2013）；SSR引物864對，根據(jù)甘藍全基因組測序信息設(shè)計合成；EST-SSR引物1 013對，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中62 567條甘藍類作物EST序列開發(fā)設(shè)計合成（陳琛 等，2011）；Indel引物960對，根據(jù)兩份骨干材料96-100和01-20重測序信息設(shè)計合成。在兩池間表現(xiàn)出多態(tài)性的引物共168對，多態(tài)性比率為3.53%。結(jié)合葉面蠟粉有無的表型性狀，利用親本和F2群體進行復(fù)篩，結(jié)果表明1對引物（LT-SSR16）與甘藍無蠟粉亮綠性狀存在連鎖關(guān)系，以該引物對F2群體898株單株進行驗證（圖6），利用Joinmap 4.0軟件進行連鎖分析，確定該標記與結(jié)球甘藍LD10無蠟粉亮綠性狀基因cgl-4的連鎖遺傳距離為4.7 cM。

3 結(jié)論與討論

圖6 引物LT-SSR16在F2群體部分單株中的擴增結(jié)果

本試驗結(jié)果表明，結(jié)球甘藍無蠟粉亮綠突變體材料LD10具有葉色亮綠、營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富等重要的商品性狀和品質(zhì)性狀，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)LD10葉面只有極少量蠟粉覆蓋，且蠟粉呈小顆粒狀結(jié)構(gòu)；而普通材料21-3葉面蠟粉含量豐富，蠟粉呈長棒狀結(jié)構(gòu)，兩者差異明顯，這與李景濤等（2012）、牟麗香等（2013）的研究結(jié)果一致。

蕓薹屬植物無蠟粉亮綠性狀遺傳規(guī)律較為復(fù)雜，不同材料之間差異較大，據(jù)報道多數(shù)突變體材料的無蠟粉亮綠性狀為單基因隱性遺傳，顯性遺傳或多基因遺傳方式較少。本試驗以結(jié)球甘藍無蠟粉亮綠突變體材料LD10和普通有蠟粉材料21-3為親本構(gòu)建6世代群體，經(jīng)卡平方檢驗各群體分離比例符合孟德爾隱性單基因遺傳規(guī)律，由此判斷LD10的無蠟粉亮綠性狀受1對隱性基因控制，遺傳方式與本所甘藍課題研究組之前報道的無蠟粉亮綠突變體材料10Q-961相同（李景濤 等，2012），但這兩份材料雜交后獲得的F1群體單株全部表現(xiàn)為葉面有蠟粉，說明這兩份材料的無蠟粉亮綠性狀控制基因位于不同的遺傳位點。本所甘藍課題研究組共搜集得到6份無蠟粉亮綠甘藍材料，經(jīng)研究初步推斷21-3油和大綠的無蠟粉性狀由隱性基因控制，而10Q-385和10Q-974的無蠟粉性狀由顯性基因控制。作物育種的成效很大程度上取決于種質(zhì)資源的數(shù)量，因此進一步搜集、研究更多具有無蠟粉亮綠性狀的甘藍突變體材料對選育商品性狀美觀、營養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)良的甘藍新品種具有十分重要的意義。

本試驗篩選獲得1個與LD10無蠟粉亮綠性狀緊密連鎖的分子標記，確定其與該性狀控制基因cgl-4的遺傳距離為4.7 cM，為進一步篩選與該性狀連鎖更加緊密的分子標記奠定了基礎(chǔ)。在今后的工作中，可以通過合成并進一步篩選引物，獲得與無蠟粉性狀控制基因連鎖更加緊密的分子標記，為結(jié)球甘藍無蠟粉基因的精確定位和克隆奠定基礎(chǔ)。

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Studies on Inheritance and Molecular Marker in Cabbage Glossy Wax-less Mutant LD10

LIU Dong-ming，YANG Li-mei*，TANG Jun，LIU Ze-zhou，F(xiàn)ANG Zhi-yuan，LIU Yu-mei，ZHUANG Mu，ZHANG Yang-yong，SUN Pei-tian，LI Jing-tao

（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

To clarify the characteristics and inheritance of cabbage（Brassica oleracea L. var. capitata L.）glossy wax-less mutant LD10，the major agronomic characteristics and nutrient contents of LD10 were tested，and ultra-structures of leaves in mutant material LD10 and normal material 21-3 were measured，observed and comparatively analyzed. LD10 and 21-3 were taken as parent to construct 6 generations population，and inheritance analysis onthe glossy wax-less characteristics of LD10 was conducted. The results showed that there was little wax on the leaves of LD10，while the wax on the leaves of 21-3 was abundent，and the granular wax in LD10 was of long stick shape，significantly different from the wax in 21-3. The glossy wax-less trait in cabbage LD10 was controlled by one single recessive gene named cgl-4. One molecular marker（LT-SSR16）linked to cgl-4 with genetic distances 4.7 cM. Another F1population obtained through crossing LD10 and 10Q-961 showed that the genes leading to glossy wax-less trait were at different locations in the two glossy wax-less materials.

Cabbage；Glossy wax-less；Characteristics；Inheritance；Molecular marker

劉東明，男，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：liudongming5668@126.com

*通訊作者（Corresponding author）：楊麗梅，女，研究員，博士生導師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：yanglimei@caas.cn

2014-04-08；接受日期：2014-05-23

國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（nycytx-35-gw01），國家“863”計劃項目（2012AA100101），“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD02B01），農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室項目