張 騁史同新?楊彥華孟慧娟孫文龍

解脲脲原體血清型1和4在雌性小鼠生殖道中的致病性研究

張 騁1史同新1?楊彥華2孟慧娟3孫文龍4

目的: 確定解脲脲原體(UU)血清型1(UU1)和4(UU4)在小鼠生殖道中致病性。方法:將408只小鼠隨機分為UU1組和UU4組,實驗組陰道分別接種三種濃度UU標準株菌液。接種后不同時間點隨機檢測陰道、宮頸及部分上生殖道組織中UU陽性率及致病率。結果: (1)陰道和宮頸分泌物:UU1和UU4三組之間總陽性率的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)；UU1和UU4三組之間各組各時間點濃度比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。(2)宮頸、子宮體與輸卵管組織:UU4組陽性率、總致病率均高于UU1組,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。結論: (1)UU1和UU4主要在宮頸致病。(2) UU4的致病性比UU1強。

解脲脲原體； 生殖道； 致病性； 血清型； 小鼠

解脲脲原體(Ureaplasma urealytium,UU)是人類泌尿生殖道中最常檢出的微生物之一。已有報道UU與人類多種臨床疾病相關,且致病性可能與不同血清型相關。我們既往通過對正常人群不同年齡階段泌尿生殖道流行病學調查中,發(fā)現(xiàn)UU可能是正常人群泌尿生殖道中的定植菌,其致病性可能與在生殖道部位等有關。本研究擬通過建立生物一群的血清型1 (UU1)和生物二群的血清型4(UU4)的小鼠動物模型,來探討UU在泌尿生殖道中不同生物群血清型不同濃度及部位的致病性。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 SPF級雌性昆明小鼠408只,小鼠8周齡,體重24±2 g,購于青島大學醫(yī)學院動物實驗中心。

1．2 實驗方法

1．2．1 主要試劑及設備 凍干標準株UU1和UU4 (由南華大學病原微生物教研室提供)、苯甲酸雌二醇(上海通用藥業(yè)股份有限公司)、UU液體培養(yǎng)基(珠海浪峰生物技術有限公司產品)、FQ－PCR試劑盒(中山大學達安基因股份有限公司)、ABI－7300 PCR儀(美國ABI公司)。

1．2．2 動物模型的建立 408只昆明小鼠全部每周頸部皮下注射一次苯甲酸雌二醇,連續(xù)2周,劑量為0．5 mg/只,然后將全部小鼠完全隨機分為UU1組和UU4組,每組204只小鼠。將UU1、UU4組分別分為A、B、C 3組實驗組(每組各60只)和對照組(每組各24只)分籠飼養(yǎng)。將UU1、UU4凍干標準株復蘇后分別培養(yǎng)增菌配制成105、106、107copy/g后在無麻醉狀態(tài)下用微量移液器分別接種至A、B、C實驗組小鼠陰道內,對照組D接種無菌液體培養(yǎng)基。所有小鼠接種劑量均為每只50μL。

1．2．3 分泌物標本采集及FQ－PCR測定 將單獨包裝的每只小鼠2支無菌棉拭子分別稱重,于接種后的第1、3、7、14、28、42天隨機取UU1和UU4組各實驗組的10只和對照組4只小鼠,將其處死。將第1根棉拭子伸入小鼠陰道0．5～1 cm停留5 s后轉動數周取其陰道分泌物。然后將小鼠宮頸管前壁切開,用棉拭子在宮頸管內旋轉數周取宮頸分泌物。將每支棉拭子放回試管中再次稱重,兩次稱重之差作為分泌物的重量。將分泌物立即洗入1 m L滅菌生理鹽水中充分震蕩搖勻,擠干棉拭子。吸取全部液體轉至1．5 m L離心管中,12 000 r/min離心5 min后加入50μL DAN提取液充分混勻后100℃恒溫處理10±1 min再離心,吸取2μL上清液做PCR反應。嚴格按照FQPCR試劑盒說明書操作進行標準品的稀釋及設定循環(huán)參數,每次均設陽性及陰性對照并作標準曲線。計算UU的濃度,按Copy/g＝(Copy/mL×0．05 m L)/G計算每克分泌物中的UU數量。

1．2．4 組織UU液體培養(yǎng)基檢測 剪取各個時間點解剖的小鼠子宮體、輸卵管及卵巢小塊組織加入UU液體培養(yǎng)基置于37℃溫箱培養(yǎng),24～48 h觀察結果,以培養(yǎng)基顏色由黃色變?yōu)榧t色且澄清判斷為陽性。

1．2．5 組織學形態(tài)觀察 剪取陰道、宮頸以及剩余部分的子宮體、輸卵管及卵巢組織以10%福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,HE染色后進行光鏡下觀察。小鼠生殖道炎癥程度分級,輕度:黏膜層散在個別炎癥細胞；中度:黏膜層有較多炎癥細胞呈灶狀或片狀浸潤；重度:大量炎癥細胞彌漫性浸潤或伴有膿腫形成。鏡下觀察到以中性粒細胞浸潤為主者為急性炎癥,鏡下觀察到以淋巴細胞或漿細胞為主者為慢性炎癥。將中度和重度炎癥的標本設定為致病標本,其余為正常標本,計算各組小鼠致病率。

1．3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17．0軟件進行統(tǒng)計學分析。各組變量間采用Fisher精確檢驗,濃度的比較采用非參數檢驗,以P＜0．05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 接種后小鼠分泌物UU陽性情況及UU濃度。接種第1天UU1和UU4組6組實驗組小鼠陰道、宮頸分泌物UU的檢出率均為100%。

2．1．1 陰道分泌物檢測情況:

2．1．1．1 接種UU后總檢出率 A1、B1、C1組陽性率為33．33%(20/60)、63．33%(38/60)、76．67%(46/ 60),3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)。

A2、B2、C2組陽性率分別為40%(24/60)、68．33%(41/60)、81．67%(49/60),3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)。

UU1和UU4組同種濃度A1、A2,B1、B2,C1、C2組UU陰道陽性率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。

2．1．1．2 接種后UU1、UU4各實驗組陰道UU濃度檢測 接種后同一時間點UU1、UU4各實驗組之間的濃度差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)。同一濃度不同時間點UU1、UU4各組陰道UU濃度比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)。各實驗組小鼠陰道分泌物UU的濃度隨接種濃度的增大而升高,且隨接種時間的延長,UU的濃度逐漸降低。UU1和UU4兩組對照組小鼠各時間點陰道分泌物UU檢測均為陰性,見表1。

2．1．2 宮頸分泌物檢測:

2．1．2．1 接種UU后總的陽性率 A1、B1、C1組陽性率分別為41．67%(25/60)、71．67%(43/60)、85% (51/60),3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)。

A2、B2、C2組UU陽性率分別為46．67%(28/ 60)、76．67%(46/60)、88．33%(53/60),3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)。

UU1和UU4的同種濃度A1、A2,B1、B2,C1、C2組UU宮頸陽性率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。

2．1．2．2 接種后UU1、UU4各實驗組宮頸UU濃度檢測 接種后同一時間點UU1、UU4各實驗組之間的濃度差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)。同一濃度不同時間點UU1、UU4各組宮頸UU濃度比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)。各實驗組小鼠宮頸分泌物UU的濃度隨接種濃度的增大而升高,且隨接種時間的延長,UU的濃度逐漸降低。UU1和UU4兩組對照組小鼠各時間點宮頸分泌物UU檢測均為陰性,見表2。

2．2 接種后小鼠部分器官組織中UU培養(yǎng)情況 對照組各時間點子宮體、輸卵管、卵巢UU培養(yǎng)均為陰性。

2．2．1 子宮體接種后前3 d各實驗組培養(yǎng)均為陰性,至接種后第7～42 d,A1、B1、C1組子宮體培養(yǎng)陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。A2、B2、C2組子宮體培養(yǎng)陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。UU1、UU4組子宮體UU培養(yǎng)總陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05),見表3。

表1 各實驗組陰道分泌物的UU陽性率及平均濃度

表2 各實驗組宮頸分泌物UU的陽性率及平均濃度

表3 子宮體UU培養(yǎng)情況

表4 輸卵管UU培養(yǎng)情況

2．2．2 輸卵管接種后1～7 d,各實驗組小鼠培養(yǎng)均為陰性,至接種后14～42 d,A1、B1、C1小鼠輸卵管培養(yǎng)陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。A2、B2、C2輸卵管陽性率比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。UU1、UU4組輸卵管UU培養(yǎng)總陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05),見表4。

2．2．3 接種后各時間點各實驗組卵巢UU培養(yǎng)均為陰性。

2．3 接種UU后小鼠各組織器官形態(tài)學表現(xiàn)

2．3．1 肉眼大體觀察:

2．3．1．1 對照組 小鼠外陰均正常,陰道、宮頸、子宮、輸卵管以及卵巢的形態(tài)無明顯改變(圖1)。

2．3．1．2 實驗組 解剖小鼠后第3 d,B1、C1組分別有1、2只,B2、C2組有2、4只表現(xiàn)為陰道水腫,宮頸肥大,A2組有1只小鼠陰道壁充血水腫。至接種至第7 d,A1組有3只小鼠陰道壁充血,C1組有2只, B2、C2組有1、3只發(fā)生陰道壁水腫合并宮腔積液、輸卵管水腫并充血(圖2),至14 d除C2組有2只小鼠輸卵管充血外,其余肉眼觀均恢復正常。

2．3．2 光鏡下觀察:

2．3．2．1 陰道組織光鏡下觀察 接種UU后對照組各時間點陰道組織鏡下觀察未見異常。

接種UU后3～7 d,UU1、UU4各實驗組小鼠陰道組織鏡下觀察呈急性炎癥表現(xiàn)(圖3),3組致病率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。UU1、UU4兩組3～7 d,A1、A2,B1、B2,C1、C2致病率比較均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。UU1、UU4組3～7 d陰道致病率比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。

接種后14～28 d,UU1、UU4各實驗組小鼠陰道致病率比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05),小鼠陰道組織鏡下觀察為慢性炎癥(圖4)。至接種后42 d, UU1、UU4各實驗組小鼠陰道鏡下觀察表現(xiàn)為輕度炎癥,嚴重程度與對照組無差異。

接種后3～28 d,UU1、UU4各實驗組小鼠陰道致病率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。UU1、UU4組3～28 d陰道總致病率比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05),見表5。

2．3．2．2 宮頸、子宮體、輸卵管、卵巢光鏡下觀察:

接種UU后對照組各時間點宮頸、子宮體、輸卵管、卵巢均未發(fā)現(xiàn)異常。

圖1 正常小鼠子宮、輸卵管、卵巢外觀圖2 接種UU后子宮、輸卵管水腫圖3 陰道黏膜固有層內見較多中性粒細胞及淋巴細胞浸潤(HE,×200)

圖4 陰道黏膜固有層內見少量淋巴細胞浸潤(HE,×200)圖5 宮頸黏膜固有層內見較多中性粒細胞浸潤(HE,×200)圖6 宮頸壁組織內較多淋巴細胞、漿細胞浸潤(HE,×200)

表5 各實驗組小鼠陰道致病情況

表6 各實驗組小鼠宮頸致病情況

接種后3～14 d,小鼠宮頸管光鏡下觀察為急性炎癥(圖5),UU1、UU4組3個實驗組間宮頸致病率比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05),其中C1與C2組致病率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05),A1、A2,B1、B2,兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)；接種后28～42 d,宮頸鏡下觀察為慢性炎癥(圖6),A1、B1、C1組致病率比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05),A2、B2、C2組宮頸致病率比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。其中C1與C2組致病率差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05),其它各組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。接種后3～42 d,UU1、UU4組總致病率比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05),見表6。

接種后1周內,子宮內膜無明顯炎細胞浸潤,至接種后7～14 d,小鼠子宮體光鏡下觀察為急性炎癥。A1、B1、C1組致病率為5%(1/20)、30%(6/20)、40% (8/20),A2、B2、C2組致病率為5%(1/20)、40%(8/ 20)、50%(10/20),3組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。其中第14 d,C1、B2、C2組分別合并2、1、4只輸卵管炎,至接種后28～42 d,A1、B1、C1組致病率為0(0/20)、10%(2/20)、10%(2/20),3組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。A2、B2、C2組致病率為5% (1/20)、35%(7/20)、40%(8/20),3組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。其中B1、C1組各有1只小鼠合并輸卵管炎,A2、B2、C2組分有1、2、4只小鼠合并輸卵管炎。7～42 d,UU1、UU4組子宮體和輸卵管致病率為15．83%(19/120)、29．17%(35/120),2組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。

各實驗組各時間點卵巢均未見明顯異常。

3 討論

UU是人類泌尿生殖道中最常檢出的微生物之一,其致病性目前仍有較大爭議。既往有研究表明, UU與多種臨床疾病相關,其中可能與輸卵管炎導致的異位妊娠有關,1以及與不孕不育也有很大關系。2國內外有學者研究發(fā)現(xiàn)UU的致病性可能與不同血清型有關,但各研究結果不盡相同。我們既往對青島地區(qū)不同年齡段的健康人群泌尿生殖道中的UU進行了流行病學的研究,結果發(fā)現(xiàn)UU在健康新生兒、健康幼兒、學齡前兒童、中小學生泌尿道中均有不同程度UU存在,3－5以生物一群為主,但生物二群也有不小的比例,并且女性攜帶率高于男性,提示UU在健康人群各個年齡段泌尿道中均存在不同程度的攜帶狀態(tài),同時說明其致病性可能也與器官不同部位有關。本研究通過建立不同濃度生物一群的血清型1和生物二群的血清型4的動物模型,對雌性小鼠生殖系統(tǒng)不同部位進行了不同方法研究。

研究結果發(fā)現(xiàn),實驗組小鼠陰道分泌物UU的濃度隨接種濃度的增大而升高,且隨接種時間的延長, UU的濃度逐漸降低,至觀測結束時小鼠陰道分泌物中有不同程度的UU存在,且UU1、UU4在陰道分泌物中的檢出率無明顯差異,這與Furr等研究結果相似,6說明UU在小鼠生殖道中雖然有一定的自凈能力但并不能很快被清除,同時提示其檢出率可能與生物群及血清型無關。光鏡下觀察陰道組織發(fā)現(xiàn),接種UU后,UU1、UU4無論是在急性炎癥期還是在慢性炎癥期其致病率各實驗組也無差異,進一步提示UU1、UU4在陰道中的致病性可能與濃度和血清型無關。同時發(fā)現(xiàn),至接種后42天所有小鼠陰道無明顯炎癥,與對照組小鼠陰道鏡下觀察無明顯差異。上述結果可以推斷,小鼠陰道具有一定的自凈作用,可以攜帶低濃度UU且不致病,提示人類可能具有同樣的現(xiàn)象。

對實驗組小鼠宮頸的研究發(fā)現(xiàn),其分泌物中UU的濃度也隨接種濃度的增大而升高,隨接種時間的延長濃度逐漸降低,至觀測結束時分泌物中有不同程度的UU存在,且UU1、UU4的檢出率無明顯差異,與陰道相似。但國內李華等7用UU3研究發(fā)現(xiàn),接種后第35天所有小鼠宮頸分泌物中均無UU3檢出。本研究結果顯示至接種后42天宮頸分泌物中仍有低濃度的UU檢出,這是否由不同血清型在小鼠生殖道中的自凈能力不同導致尚需進一步研究。同時,在光鏡下觀察宮頸組織,發(fā)現(xiàn)在接種后3～14天,組織表現(xiàn)為急性炎癥,在28～42天,觀察為慢性炎癥,其中C1與C2組致病率均有差異。同時研究發(fā)現(xiàn),3～42天UU1、UU4各實驗組總的致病率有差異。提示UU1、UU4在宮頸均可引起炎癥改變,在低濃度時兩者致病性相似,但隨著UU的濃度增大致病率升高,且UU4的致病力比UU1強,與譚飛等8研究結果一致。

本研究對子宮體、輸卵管、卵巢組織進行UU培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),在子宮體及輸卵管均有UU存在,其檢出率明顯低于宮頸,且UU4的檢出率明顯高于UU1,卵巢均未培養(yǎng)出UU。光鏡下,兩者在子宮體和輸卵管均可引起不同程度的炎癥改變,且UU4的致病率明顯高于UU1。提示UU在生殖道中可發(fā)生上行感染, UU4的致病性比UU1強。國內李華等7將不同濃度的UU3接種小鼠陰道,結果發(fā)現(xiàn)UU3可上行感染引起子宮內膜炎及輸卵管炎,且隨接種濃度的增高致病性增強,與本研究結果相似。

國內張帝開等9認為當UU的定量值大于1× 106ccu/mL時致病率明顯升高,本研究結果也呈現(xiàn)類似變化趨勢。整個實驗過程中均未見卵巢致病,這與既往研究UU8可上行播散至卵巢致病6有差異,這不排除UU1和UU4致病力比UU8弱或接種濃度較低暫未上行至卵巢所致。

目前,不同血清型的UU致病能力有差異的原因尚不明確。既往研究表明,不同血清型UU在生殖道中不同部位的黏附能力強弱有差異,10Furr等11通過電鏡觀察到的類似UU的人型支原體定植部位為宮頸的柱狀上皮而非陰道復層鱗狀上皮。本實驗結果也提示同樣的結果。

因此,通過對小鼠動物模型的研究發(fā)現(xiàn),UU1和UU4主要在宮頸致病,在陰道可致短期炎癥,UU4在宮頸和子宮、輸卵管的致病性比UU1強,且致病力隨UU感染的濃度增大而增強。

1梁旭東,顧亭亭,王建六,等．不同生物亞群解脲脲原體感染與異位妊娠相關性的研究．中華婦產科雜志,2007,42(6): 370－373．

2 Imudia AN,Detti L,Puscheck EE,et al．The prevalence of ureaplasma urealyticum,mycoplasma hominis,Chlamydia trachomatis and neisseria gonorrhoeae infections and the rubellastatus of patients undergoing an initial infertility evaluation．JAssist Reprod Cenet,2008,25(1):43－46．

3劉立倩,史同新,管淑梅,等．健康足月分娩新生兒泌尿生殖道解脲脲原體的流行病學研究．中國麻風皮膚病雜志,2007, 23(12):1057－1059．

4史同新,徐敬星,趙光．解脲脲原體在健康幼兒泌尿生殖道中的分子流行病學研究．中國艾滋病性病,2008,14(4):389－391．

5孟慧娟,史同新,孫文龍,等．青島地區(qū)中小學生泌尿生殖道解脲脲原體及人型支原體分子流行病學調查．中華皮膚科雜志,2012,45(10):708－710．

6 Furr PM,Taylor－Robinson D．The establishment and persistence of Ureaplasma urealyticum in oestradiol－treated female mice．JMed Microbiol,1989,29(2):111－114．

7李華,張洪文,陳浦香,等．解脲脲原體血清型3在小鼠生殖道中的致病性．中華婦產科雜志,2009,44(3):204－208．

8譚飛,連娟,莫小輝,等．UU1、UU3和UU4致昆明小鼠下生殖道致病性的研究．現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2011,3(11):456－459．

9張帝開,賈春容,李秀云,等．女性下生殖道解脲支原體的定量檢測及致病性研究．中國實用婦科與產科雜志,2005,21 (11):656－658．

10Manchee RJ,Taylor－Robinson D．Studies oil the nature of receptors involved in attachment of tissue culture cells tomycoplasmas．Br JExp Pathol,1969,50(1):66－75．

11 Furr PM,Sarathchandra P,Hetherington CM,eta1．Siteof localization of Mycoplasma pulmonis and Mycoplasma hominis in the genital tract of female mice demonstrated by culture and scanning and immuno－electron microscopy．Int J Exp Pathol, 1995,76(2):131－143．

(收稿:2013－10－22 修回:2013－11－27)

Pathogenicity of ureaplasma urealyticum serotype 1 and 4 in genital tract ofm ice

ZHANGCheng,SHITong-xin,YANG Yan-hua,etal.Department ofDermatology,Qingdao Municipal Hospital,Qingdao,266011

Objective:To determine the pathogenicity of ureaplasma urealyticum serotype 1(UU1)and 4 (UU4)in genital tract ofmice．Methods:A total of 408 adult Kunmingmice were random ly divided into 2 groups:UU1 and UU4 group．Three different concentration of UU1 and UU4 were inoculated intra－vaginally．The quantity of UU1 and UU4 from vaginal secretions,cervical secretions,and the uterus,fallopian tubes and ovaries at different time pointswas detected．The pathogenicity was calculated．Results:(1)vaginal secretions and cervical secretions:the differences of the total positivity rates in both UU1 and UU4 groupswere significant(P s＜0．01)；the differenceswere also significantwith different concentration and at different time in both UU1 and UU4(P s＜0．05)．(2)uterus and fallopian tubes:the total positivity rates of UU and pathogenicity in UU4 group were higher than those in UU1 group(P s＜0．05)；Conclusion:UU1 and UU4 primarily cause inflammation in cervix．The pathogenicity of UU4 is stronger when compared with UU1．

Ureap lasma urealyticum；urogenital tract；pathogenicity；serotype；mice

青島市科技局資助項目(編號1033413nsh)

1青島大學醫(yī)學院附屬青島市市立醫(yī)院皮膚科,山東青島, 266011

2青島大學醫(yī)學院附屬青島市市立醫(yī)院病理科,266011

3濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科,山東濰坊,261031

4青島市第八人民醫(yī)院皮膚科,山東青島,266100

?通信作者