趙 琳，曹夢(mèng)晗，王民憲

血清腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測(cè)鑒別肝內(nèi)膽管癌和肝細(xì)胞癌

趙 琳，曹夢(mèng)晗，王民憲

目的:研究評(píng)價(jià)肝內(nèi)膽管癌(ICC)和肝細(xì)胞癌(HCC)患者血清胸苷激酶1(TK1)、甲胎蛋白(AFP)、糖類抗原19-9 (CA19-9)和癌胚抗原(CEA)的表達(dá)。方法:應(yīng)用化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光點(diǎn)印跡法定量檢測(cè)48例HCC患者和17例ICC患者血清TK1濃度，直接化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清AFP、CA19-9和CEA濃度；50例健康志愿者作為對(duì)照組。結(jié)果:血清TK1、AFP、CAl9-9和CEA濃度在HCC組和ICC組均明顯升高（P＜0.05）。血清CA19-9對(duì)ICC診斷敏感性最高(76.5%)，CEA其次(64.7%)。結(jié)論:血清TK1、AFP、CA19-9和CEA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC和ICC的鑒別診斷具有一定臨床意義。

腫瘤標(biāo)志物；定量檢測(cè)；肝內(nèi)膽管癌；肝細(xì)胞癌

肝內(nèi)型膽管細(xì)胞性肝癌簡(jiǎn)稱肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma ICC)，與肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在病因、發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)和治療方案上均有所不同，近年來在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。雖然隨著影像學(xué)發(fā)展，ICC的診斷率明顯提高[1]，但難與HCC相鑒別。2009年1月—2012年12月，我們對(duì)本院HCC和ICC患者血清胸苷激酶1(TK1)、甲胎蛋白(AFP)、糖類抗原19-9 (CA19-9)和癌胚抗原(CEA)水平進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，探討其在鑒別診斷方面的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組共65例，其中HCC48例，男29例，女19例；年齡39歲～77歲，中位年齡57.2歲。ICC 17例，男11例，女6例；年齡35～80歲，中位年齡59.3歲。以上病例為我院2009年1月—2012年12月住院患者。正常對(duì)照組為體檢中心健康人群50例，男27例、女23例；年齡28～73歲，中位年齡52.4歲，均為排除貧血、女性月經(jīng)期等處于細(xì)胞增殖狀態(tài)之外的健康人。3組性別和年齡等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 試劑和儀器 TK1診斷試劑盒：抗TK1抗體( anti-TK1 Ab)，硝酸纖維素薄膜，TK1校準(zhǔn)品(2.2、6.6、20 pmol/L)，ECL試劑，生物素化二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素，封閉劑，抗體稀釋液，抗體洗滌液。CIS-I型化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像分析儀。試劑及儀器均由深圳華瑞同康公司提供。AFP測(cè)定試劑盒(直接化學(xué)發(fā)光法)。糖抗原19-9測(cè)定試劑盒(直接化學(xué)發(fā)光法)。CEA測(cè)定試劑盒(直接化學(xué)發(fā)光法)。ADVIA Centaur XP全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。均由西門子醫(yī)藥公司提供。

1.3 方法和步驟 （1）標(biāo)本收集：3組空腹采集2份靜脈血各2 mL，分別用干燥管收集血液(禁抗凝劑和促凝劑)待血液自然凝固，1份行血清AFP、 CA19-9和CEA檢測(cè)，1份行TK1檢測(cè)。3500 r/min，離心10 min，取上清直接點(diǎn)樣或取100～200 μL血清，分裝于兩個(gè)潔凈的EP管中并編號(hào)(1管用于檢測(cè)、另1管用于復(fù)檢)，保存在-20℃以下。（2）TK1檢測(cè)步驟：根據(jù)試劑盒說明書，配制pH為7.6的抗體稀釋液、洗液和封閉劑。根據(jù)樣本量選擇模板的大小，將校準(zhǔn)品1、校準(zhǔn)品2、和校準(zhǔn)品3順序點(diǎn)樣至A1、A2、A3膜孔，待測(cè)樣品按順序依次點(diǎn)樣至后續(xù)膜孔上，室溫下自然晾干20～30 min。取出硝酸纖維素薄膜，在反應(yīng)盒內(nèi)用稀釋液振搖洗膜2次，每次5 min。棄去洗液，倒入封閉液，振搖封閉1 h。棄去封閉液，按1∶500稀釋度配置一抗稀釋液并加入反應(yīng)盒內(nèi)，25℃下振搖反應(yīng)2 h。先用洗液快速漂洗2次后，振搖洗3次，每次5 min。加入生物素化二抗，室溫下振搖精確反應(yīng)40 min。反應(yīng)結(jié)束后洗滌，并按1∶1500稀釋鏈酶親核素-酶復(fù)合物，室溫精確反應(yīng)1 h，洗滌。加入ECL發(fā)光劑，過膜浸濕并精確反應(yīng)1 min，將膜片用吸水紙吸干，放人塑料膜內(nèi)擠干剩余的溶液。將膜放入CIS-1型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行分析。

AFP、CA19-9和CEA檢測(cè)：直接化學(xué)發(fā)光法，在西門子ADVIA Centaur XP全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上測(cè)定。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo) TK1≥2 pmol/L、AFP≥8.1 ng/mL、CA199≥37 U/mL、CEA≥2.5 ng/mL判斷為陽性結(jié)果。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以(±s)表示，組間比較采用one way ANOVA檢驗(yàn)；率的比較用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。敏感性(SE)=[真陽性樣本數(shù)／(真陽性樣本數(shù)+假陰性樣本數(shù))]×100%；特異性(SP)=[真陰性樣本數(shù)／(真陰性樣本數(shù)+假陽性樣本數(shù))]×100%。

2 結(jié)果

2.1 血清TK1、AFP、CA19-9和CEA表達(dá)水平 HCC組和ICC組四項(xiàng)腫瘤標(biāo)記物水平均明顯升高，與正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 ICC組TK1、AFP水平明顯低于HCC組，CA19-9和CEA水平則明顯高于HCC組(P＜0.05)。見表1。

表1 3組血清各項(xiàng)腫瘤標(biāo)記物表達(dá)水平±s)

表1 3組血清各項(xiàng)腫瘤標(biāo)記物表達(dá)水平±s)

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與ICC組比較，bP＜0.05

組別HCC組ICC組正常對(duì)照組n 48 17 50 TK1（pmol/L）2.96±3.27a2.21±4.64a1.17±0.62 AFP（ng/mL）24761.1±22 493.9a、b39.1± 43.7a3.29± 1.69 CA19-9（U/mL）159.6±263.9a、b289.8±375.4a12.17± 7.21 CEA（ng/mL）16.1±32.2a、b27.9±38.4a1.26±0.74

2.2 血清TK1、AFP、CA19-9和CEA陽性率 HCC組AFP陽性率最高(72.9%)，TK1其次（50%）；ICC組CA19-9陽性率最高(76.5%)，CEA其次(64.7%)。見表2。

2.3 四項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷HCC和ICC的敏感性、特異性 AFP診斷HCC的敏感性最高（72.9%），TK1其次（50.0%），CA19-9最差（29.1%）。CA19-9診斷ICC的敏感性最高（76.5%），CEA其次（64.7%），AFP最差（11.8%）。AFP診斷HCC特異性最高（86.6%），CA19-9診斷ICC特異性最高（74.5%）。四項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷HCC和ICC的敏感性均有所提高。見表3。

3 討論

目前ICC的診斷多依賴于影像學(xué)檢查，但常誤診為HCC，且發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)已達(dá)中晚期。ICC和HCC的治療有許多不同之處，尤其是手術(shù)方式，ICC為規(guī)則性肝切除，HCC主要進(jìn)行局部切除[2]，因此明確術(shù)前診斷對(duì)于確定有效治療方案至關(guān)重要。本研究分析了術(shù)前兩組患者血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物的差異，以期提高ICC的診斷率。

AFP是目前診斷HCC最常用的血清學(xué)指標(biāo)，在ICC患者中升高不明顯。近年來，AFP在鑒別HCC和ICC的應(yīng)用中受到越來越多的關(guān)注[3-4]。本研究中，17例ICC患者中只有2例(11.8%)升高，與HCC組(72.9%)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且AFP診斷ICC的特異性僅為19.4%，提示AFP是鑒別ICC和HCC的重要血清學(xué)指標(biāo)之一。

CAl9-9是一種低聚糖類腫瘤相關(guān)抗原，分子量＞50萬，主要存在于胃腸或胰腺癌患者的組織中，正常人血清中含量甚微。研究表明，許多癌細(xì)胞都能分泌CAl9-9，包括膽管癌和結(jié)腸癌，目前臨床上多用于胰腺癌和膽管癌的血清學(xué)診斷。惡性膽管組織中，CAl9-9抗原的表達(dá)與腺癌的分化程度成反比，在低分化膽管癌腺癌中的表達(dá)遠(yuǎn)高于高分化者[5]。CA19-9被認(rèn)為是膽管癌最重要的血清學(xué)指標(biāo)，本研究中，ICC組血清CAl9-9陽性率可達(dá)76.5%，特異性可達(dá)74.5%，CA19-9診斷ICC的敏感性和特異性均優(yōu)于AFP對(duì)ICC的診斷。因此，CAl9-9對(duì)ICC的診斷具有一定價(jià)值。

CEA是一種細(xì)胞膜相關(guān)糖蛋白，分子結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，且有多個(gè)抗原決定簇，除惡性腫瘤決定簇外，還有非特異性的交叉反應(yīng)抗原(NCA)及膽汁糖蛋白-l(BGP-1)。故在正常人及非腫瘤患者體內(nèi)也可檢出CEA，可有假陽性，如酒精后肝硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、膽囊炎、膽結(jié)石、急性胰腺炎，甚至大量吸煙者，也可致濃度升高。CEA通常不表達(dá)于正常膽管組織中，且在惡性膽管組織中多表達(dá)于腺癌，而在腺鱗癌中表達(dá)量較低。高濃度CEA則主要見于結(jié)直腸癌[6]。本研究中，ICC組和HCC組血清CEA水平均明顯升高，與正常對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ICC組的血清CEA陽性率為64.7%，HCC組陽性率只有39.6%，提示CEA對(duì)于ICC和HCC的鑒別診斷具有輔助意義。

TK1和線粒體胸苷激酶(TK2)為同工酶，是胸苷激酶在細(xì)胞內(nèi)存在的兩種形式。TK1為四聚體，相對(duì)分子質(zhì)量為96 000，是DNA合成中的關(guān)鍵酶之一，是嘧啶合成的補(bǔ)救酶，它催化胸苷(Tdr)磷酸化為胸苷-磷酸(TMP)，進(jìn)而形成的胸苷三磷酸(TTP-DNA合成中的4種必須脫氧核苷酸之一)，參與DNA合成。并且這種磷酸化作用是DNA代謝中的惟一途徑。TK1水平的升高和DNA的合成成正相關(guān)。在細(xì)胞周期中，TK1在G1期和S期交界處開始升高，直至S期達(dá)到高峰，至G2期開始下降。由于TK1與細(xì)胞周期S期的特殊相關(guān)性，又被稱為S期關(guān)鍵酶。TK1水平取決于細(xì)胞的增殖度，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，是細(xì)胞周期依賴性標(biāo)志物。在腫瘤細(xì)胞中，這種高TK1水平從S晚期可持續(xù)到M早期，其濃度將伴隨著腫瘤細(xì)胞的急劇增殖而升高。一旦癌變，TK1的活性和含量都將升高，可超過正常水平的2100倍，正常成人細(xì)胞中含量極低。TK2的活性只有TK1的5%，在增殖細(xì)胞中含量很低。在乳腺癌和肺癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，TK1是用于監(jiān)測(cè)腫瘤治療效果的有價(jià)值的標(biāo)記物，已經(jīng)作為腫瘤細(xì)胞的血清學(xué)標(biāo)志物，在乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤中已有相關(guān)研究[7]。本研究中，我們首次使用TK1作為HCC和ICC的腫瘤標(biāo)志物，檢測(cè)HCC患者48例，TK1濃度為(2.96±3.27)pmol/L；ICC患者17例，TK1濃度為(2.21±4.64)pmol/L；健康人50例，TK1濃度為(1.17±0.62)pmol/L。HCC和ICC患者均明顯高于健康人群，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TK1診斷HCC的敏感度可達(dá)50%，特異性可達(dá)62.7%，僅次于AFP，表明TK1對(duì)HCC的診斷具有一定的意義。TK1在ICC組患者中陽性率明顯低于HCC組，且TK1與AFP、CA19-9和CEA聯(lián)合檢測(cè)診斷ICC的敏感度可達(dá)78.2%，說明聯(lián)合檢測(cè)血清TK1、AFP、CA19-9和CEA對(duì)于HCC和ICC的鑒別診斷具有較高的價(jià)值。

表2 3組血清各項(xiàng)腫瘤標(biāo)記物陽性率結(jié)果（n,%）

表3 四項(xiàng)腫瘤標(biāo)記物診斷HCC和ICC的敏感性、特異性比較（%）

ICC的診斷需要綜合多方面因素，如臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查等。血清腫瘤標(biāo)記物具有成本低，取樣和檢測(cè)簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。但目前國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)能夠早期檢測(cè)ICC的敏感性和特異性均令人滿意的腫瘤標(biāo)記物，而多項(xiàng)腫瘤標(biāo)記物的聯(lián)合檢測(cè)可明顯提高診斷ICC的敏感性和特異性，有助于ICC的診斷及與HCC的鑒別診斷。對(duì)于右上腹疼痛不適且影像學(xué)出現(xiàn)肝臟實(shí)性占位影像的患者，如出現(xiàn)血清AFP正常而TK1、CA19-9、CEA增高，應(yīng)考慮到ICC的可能，進(jìn)而選擇正確合理的治療，提高ICC患者的治療效果及預(yù)后。

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（收稿：2013-10-22 修回：2014-03-02）

（責(zé)任編輯 孔 棣）

Clinical Significance of Combined Detection of Serum Tumor Markers for Differential Diagnosis of In-trahepatic Cholangiocarcinoma and Hepatocellular Carcinoma

ZHAO Lin,CAO Meng-han,WANG Min-xian Department of Nuclear Medicine,Tianjin NanKai Hospital,Tianjin(300100),China

Objective To evaluate the expression of serum tumor marker TK1,AFP,CAl9-9 and CEA in intrahepatic cholangiocarcinoma(ICC)patients and hepatocellular carcinoma(HCC)patients to discuss the clinical significance of combined detection of these four markers.MethodsThe serum concentrations of AFP, CA19-9 and CEA were measured by automatic chemiluminescence immunoassay.That of TK1 was measured byenhanced chemiluminescence(ECL)and immunoblotting assay.ResultsSerum TK1,AFP,CAl9-9 and CEA in the HCC group were 2.96 pmol/L,24761.1 ng/mL,159.6 U/mL and 16.1 ng/mL respectively,while those in the ICC group were 2.21 pmol/L,39.1 ng/ml,289.8 U/mL and 27.9 ng/mL respectively.The serum concentrations of these four tumor markers were both higher in ICC and HCC groups compared with the control group (1.17 pmol/L,3.29 ng/ml,12.17 U/mL and 1.26 ng/mL).The diagnostic sensitivity of AFP for HCC was highest (72.9%),followed by TK1(50%).The diagnostic sensitivity of CA19-9 for ICC was highest(76.5%),followed by CEA(64.7%).ConclusionIt is practically valuable to assay TK1,AFP,CA19-9 and CEA in serum for differential diagnosis of ICC and HCC．

Tumor marker;quantitative detection;intrahepatic cholangiocarcinoma;hepatocellular carcinoma

R446.62

A

1007-6948(2014)02-0123-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.02.005

天津市南開醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科（天津 300100）

趙 琳，E-mail：linda800202@sina.com