鄭喜群 馬艷秋 劉曉蘭 楊雙 李凱園

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006; 2.齊齊哈爾大學(xué)黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006)

2012年中國(guó)玉米產(chǎn)量為2.01億噸，首次超過(guò)稻谷，成為第一大糧食作物.以玉米為原料濕法生產(chǎn)淀粉時(shí)，可分離出相對(duì)玉米(干基)6%左右的副產(chǎn)物玉米蛋白粉(CGM)，CGM的主要成分是玉米蛋白(55%～65%)，其中玉米醇溶蛋白占總蛋白的65%～68%.

與其他谷物蛋白相比，玉米醇溶蛋白含有高比例的亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸等疏水性脂肪族氨基酸，具有獨(dú)特的抗氧化［1］、抗高血壓［2］和促酒精代謝［3］功能序列，是一種潛在的功能性蛋白原料.但玉米醇溶蛋白是高度緊密及疏水的“醇溶蛋白體”，蛋白結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定［4］，功能性難以釋放，可采用必要的加工方法及技術(shù)手段，改變天然玉米醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)，改善其功能特性.

擠壓膨化技術(shù)具有效率高、用時(shí)短、操作簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)環(huán)保的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中［5］.蛋白質(zhì)的擠壓膨化是指在高溫、高壓、高剪切力及高能量水分子的協(xié)同作用下，其高級(jí)結(jié)構(gòu)的去折疊、線性化和再交聯(lián)的過(guò)程［6］.研究發(fā)現(xiàn)適度擠壓膨化可以改善玉米蛋白的吸水性、乳化性等物理性質(zhì)［7］;同時(shí)，擠壓膨化也可以改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，增加其對(duì)蛋白酶的敏感性［8］.

文中采用掃描電子顯微鏡、差示量熱掃描法及傅里葉紅外光譜等技術(shù)手段對(duì)擠壓膨化前后玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行研究，并分析其物性的變化情況.以期為玉米醇溶蛋白的開發(fā)利用提供更多的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

玉米蛋白粉(蛋白含量為57.07%)由黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司提供，8-苯胺-1-萘磺酸(ANS，色譜純)和5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸(Ellman's試劑，色譜純)購(gòu)于Sigma公司，大豆油為市售，其他試劑均為分析純?cè)噭?

DS32-Ⅱ型雙螺桿擠壓膨化機(jī)，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn);Spectrum One傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)，PE公司生產(chǎn);Q-20型差示量熱掃描儀，TA儀器公司生產(chǎn);Nano-ZS90激光散射儀，Malvern儀器有限公司生產(chǎn).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CGM的擠壓膨化及醇溶蛋白的提取

將CGM含水量調(diào)節(jié)至16%，放置過(guò)夜.膨化機(jī)工作參數(shù)為160～180℃、1.0～1.5 MPa.膨化的CGM在室溫下干燥，用粉碎機(jī)粉碎、篩分，收集粒徑小于280μm的膨化CGM作為原料備用.

將收集的CGM加入到70%乙醇水溶液(質(zhì)量/體積比為1∶10，g/mL)中，置于水浴磁力攪拌器中，60℃萃取2h，4500 r/min離心10 min，收集上清液，將沉淀按上述方法再次提取.將兩步提取的上清液混合，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到原體積的1/3，析出沉淀即為玉米醇溶蛋白，冷凍干燥.

1.2.2 玉米醇溶蛋白表觀結(jié)構(gòu)的觀察

應(yīng)用掃描電子顯微鏡(SEM)考察玉米醇溶蛋白表觀結(jié)構(gòu).將少量蛋白樣品固定到樣品臺(tái)上，噴金鍍膜處理，用電子顯微鏡觀察.電鏡工作參數(shù)為:離子濺射儀工作距離為50mm，真空度為0.05mbar，電流控制為30 mA，濺射時(shí)間為40～60 s，噴金厚度大于5nm.

1.2.3 玉米醇溶蛋白紅外光譜的測(cè)定

將蛋白樣品進(jìn)行KBr壓片制樣，用傅里葉紅外光譜儀測(cè)定波數(shù)為4000～400 cm-1的蛋白紅外光譜，分辨率為4cm-1，波數(shù)精度為0.01cm-1，掃描次數(shù)為32次，環(huán)境溫度為25℃.利用Omnic V 8.0軟件對(duì)譜圖進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)、去卷帙及曲線擬合處理.

1.2.4 玉米醇溶蛋白變性溫度的測(cè)定

利用Q-20型差示掃描量熱儀測(cè)定.實(shí)驗(yàn)前，調(diào)整蛋白水分含量為6%，稱取約2.0 mg玉米醇溶蛋白放入鋁盒中，密封，置于DSC儀器的樣品支持器上，以密封空鋁盒作為對(duì)照.氮?dú)鈮毫?.05 MPa，升溫速率為10℃/min，溫度范圍20～180℃.每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次.

1.2.5 玉米醇溶蛋白表面疏水性的測(cè)定

取約0.1g玉米醇溶蛋白，溶于5mL 0.01mol/L pH=7.0的磷酸-磷酸鹽緩沖液中，4000 r/min離心10min，收集上清液.測(cè)定上清液可溶性蛋白含量，稀釋蛋白使其含量為0.008～0.500 mg/mL.取4mL樣液加入20 μL 8 mmol/L ANS熒光探針試劑，在室溫條件下避光反應(yīng)15min.在激發(fā)波長(zhǎng)390nm、發(fā)射波長(zhǎng)470nm以及狹縫5nm的條件下，測(cè)定ANS結(jié)合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度，最后以相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，蛋白濃度作為橫坐標(biāo)作圖，以其斜率表示樣品的表面疏水性.

1.2.6 玉米醇溶蛋白游離巰基含量的測(cè)定

參照Ellman’s分光光度法，有改動(dòng).精確稱取0.05g蛋白樣品，加入到8 mL含有8 mol/L尿素的pH值為8.0的Tris-Gly緩沖液(0.086 mol/L Tris、0.09mol/L glycine、0.004 mol/L EDTA)中，攪拌溶解1h，10000r/min離心10min，收集上清液.取2mL上清液加入2mL緩沖液和40μL Ellman’s試劑，立即混勻，1h后測(cè)定412 nm吸光值，以不加樣品、只加Ellman’s試劑為空白.基于Ellman’s試劑-SH的摩爾吸光系數(shù)1.36×104，計(jì)算玉米醇溶蛋白的游離巰基含量Y(μmol/g)，公式如下:

式中:D為412 nm吸光值;ρ為樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL;d為稀釋倍數(shù).

1.2.7 玉米醇溶蛋白持水力和吸油性的測(cè)定

將0.5g玉米醇溶蛋白和5mL蒸餾水或精制大豆油放入10mL的離心管中，攪拌均勻，靜置30min，在3000r/min離心10min，棄去上清液，然后測(cè)量離心管和殘留物的質(zhì)量.持水力或吸油性F按下式計(jì)算:

式中，m0為干燥樣品的質(zhì)量，m1為干燥樣品和離心管的總質(zhì)量，m2為離心后殘留物和離心管的總質(zhì)量.

1.2.8 玉米醇溶蛋白溶解性的測(cè)定

參考Surowka的質(zhì)量差法，有改動(dòng).將烘干后的10mL離心管標(biāo)記、稱重，然后稱取玉米醇溶蛋白0.5g，放入離心管中.再向離心管中加入5 mL蒸餾水，漩渦振蕩10 min后，10000 r/min離心10 min，棄去離心上清液，將沉淀物放入真空干燥箱中(80℃)干燥至衡重.將帶有沉淀物的離心管稱重，按下式計(jì)算溶解性R:

式中，m為玉米醇溶蛋白干物質(zhì)質(zhì)量，m'1為空離心管的質(zhì)量，m'2為離心管和沉淀物的質(zhì)量.

1.2.9 玉米醇溶蛋白黏度的測(cè)定

用70%乙醇水溶液配置1%的玉米醇溶蛋白溶液.采用DV-C黏度計(jì)測(cè)定黏度，轉(zhuǎn)子選擇S96，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100r/min，記錄扭矩在20%～80%之間的黏度值穩(wěn)定時(shí)的數(shù)據(jù).

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)都是3次測(cè)定的平均值，采用IBM SPSS Statistics軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用origin 8.6統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米醇溶蛋白的表觀結(jié)構(gòu)

實(shí)驗(yàn)獲得了純度較高的玉米醇溶蛋白，蛋白純度分別為(94.26±0.43)%和(95.92±0.37)%.掃描電子顯微鏡利用入射電子和試樣表面物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的二次電子與被散射電子成像，獲得試樣表面微觀組織結(jié)構(gòu)和形貌信息.玉米醇溶蛋白的掃描電鏡圖像見圖1

圖1 未處理及擠壓膨化的玉米醇溶蛋白SEM圖片F(xiàn)ig.1 SEM photos of zein without and with extrusion

由圖1可見，未處理的玉米醇溶蛋白聚集體直徑較小(0.1～3.0μm)，蛋白質(zhì)聚集體呈現(xiàn)球狀，球的大小不等，表面十分光滑，分布均勻，蛋白質(zhì)聚集體之間有明顯的界限.Yamada等［9］用掃描電鏡觀察玉米醇溶蛋白時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在乙醇溶液中蛋白聚集形成小球狀，小球直徑為 150～550 nm，高度為50～150nm.玉米醇溶蛋白經(jīng)擠壓膨化處理后，除了球狀聚集體之外，多數(shù)聚集體之間的界限變得不明顯，部分呈現(xiàn)棒狀結(jié)構(gòu);球狀與球狀聚集體、球狀與棒狀聚集體、棒狀與棒狀聚集體融合在一起，形成較大的聚集體.這種聚集體可能是蛋白間形成二硫鍵導(dǎo)致的.

2.2 玉米醇溶蛋白紅外光譜

Omnic V 8.0軟件處理后的玉米醇溶蛋白的紅外光譜見圖2，譜圖中的吸收峰與分子中各基團(tuán)的振動(dòng)形式相對(duì)應(yīng)，3000～3 600 cm-1處出現(xiàn)一吸收峰，這主要是蛋白質(zhì)的O—H和N—H的伸展擺動(dòng)，是酰胺A和酰胺B帶的N—H的伸縮振動(dòng);在3000～2800cm-1處也有吸收峰，主要是C—H鍵的伸展搖擺.

蛋白質(zhì)的FT-IR光譜圖譜有幾組特征吸收譜帶，1600cm-1附近出現(xiàn)酰胺I吸收帶，即C==O的伸縮振動(dòng);1530cm-1附近是酰胺Ⅱ吸收帶，即C—N伸縮振動(dòng)或N—H的彎曲振動(dòng);1450 cm-1主要來(lái)源于甲基的不對(duì)稱和對(duì)稱變角振動(dòng)吸收;1230cm-1附近為酰胺Ⅲ吸收帶，主要是C—N的伸縮振動(dòng)和N—H的彎曲振動(dòng).

圖2 未處理及擠壓膨化的玉米醇溶蛋白FT-IR譜圖Fig.2 FT-IR spectra of zein without and with extrusion

由圖2可知，與未處理的玉米醇溶蛋白相比，擠壓膨化的玉米醇溶蛋白的酰胺帶出峰位置與強(qiáng)度均發(fā)生了改變，其中酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶吸收峰位置向低波數(shù)方向發(fā)生移動(dòng)，酰胺Ⅲ帶則向相反方向移動(dòng).同時(shí)擠壓膨化處理的玉米醇溶蛋白在1632cm-1與1243cm-1處峰強(qiáng)度有明顯的增加，其均為β折疊的出峰位置，表明β折疊含量有所增加，與酰胺Ⅰ帶擬合結(jié)果相符.

CGM除了含有55%～65%的蛋白質(zhì)之外，還含有21%～26%的碳水化合物，其中淀粉占12%～15%.這些淀粉與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密.未處理的醇溶蛋白在1150～1020cm-1處出現(xiàn)多糖的吸收峰，表明醇溶蛋白含有一定量的多糖，Tatiana等［10］報(bào)道的γ-玉米醇溶蛋白的紅外光譜中也出現(xiàn)了這一吸收峰;而擠壓膨化的玉米醇溶蛋白在1150～1020 cm-1處出現(xiàn)多糖的吸收峰，表明擠壓膨化過(guò)程減弱了蛋白與多糖之間的連接力，使提取的醇溶蛋白含多糖量顯著減少.

紅外光譜可用于研究蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，1 600～1700cm-1為蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶，是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)吸收峰的疊加，因此基于紅外光譜的酰胺Ⅰ帶曲線擬合技術(shù)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析.對(duì)玉米醇溶蛋白光譜中1600～1700 cm-1吸收帶進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)及去卷帙處理，經(jīng)過(guò)處理后疊加峰得到了分離，根據(jù)分辨出來(lái)的子峰，對(duì)原始吸收峰進(jìn)行高斯曲線擬合，擬合圖譜見圖3.

由圖3可知，玉米醇溶蛋白在1600～1700cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)了多個(gè)子峰，定義子峰面積百分比為它的面積除以各個(gè)子峰面積的總和，根據(jù)朗伯比耳定理，這個(gè)子峰的面積百分比就可看做是這個(gè)子峰所代表的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)中的相對(duì)含量.根據(jù)Byler、Smeller等［11-12］對(duì)多種蛋白紅外光譜的研究結(jié)論，確定玉米醇溶蛋白中各個(gè)子峰位置與二級(jí)結(jié)構(gòu)成分的對(duì)應(yīng)關(guān)系，得到各個(gè)子峰的吸收頻率位置、子峰相對(duì)面積及二級(jí)結(jié)構(gòu)見表1.

由表1可知，本實(shí)驗(yàn)工作參數(shù)下，擠壓膨化的玉米醇溶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，未處理玉米醇溶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲的含量分別為23.68%、13.10%、47.59%及15.63%，擠壓膨化的玉米醇溶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲的含量分別為19.60%、22.56%、 36.27%和21.58%.擠壓膨化使玉米醇溶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋與β轉(zhuǎn)角含量減少，β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量增加.擠壓膨化使玉米醇溶蛋白分子結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)了由螺旋向折疊轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，同時(shí)伴隨著無(wú)卷曲結(jié)構(gòu)含量增加，表明玉米醇溶蛋白整個(gè)分子構(gòu)象從有序向無(wú)序轉(zhuǎn)化.由于二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，天然玉米醇溶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低，對(duì)蛋白改性的敏感性增加.

圖3 未處理及擠壓膨化的玉米醇溶蛋白 FT-IR酰胺Ⅰ帶分解和曲線擬合Fig.3 Decomposition and curve fitting for FT-IR of zein without and with extrusion in amide I region

表1 未處理及擠壓膨化的玉米醇溶蛋白在酰胺Ⅰ帶的子峰位置、相對(duì)面積及其二級(jí)結(jié)構(gòu)含量1)Table 1 The peak position，relative area and their secondary structure assignments of Amide I for zein without and with extrusion

2.3 玉米醇溶蛋白的變性溫度

擠壓膨化玉米醇溶蛋白的DSC曲線見圖4.

圖4 未處理及擠壓膨化的玉米醇溶蛋白DSC曲線Fig.4 DSC curves of zein without and with extrusion

由圖4可知，玉米醇溶蛋白的吸熱曲線均出現(xiàn)兩個(gè)吸熱峰，吸熱峰Ⅰ與吸熱峰Ⅱ峰值點(diǎn)溫度分別為蛋白玻璃化溫度(Tg)及變性溫度(Tp).比較可知，擠壓膨化使玉米醇溶蛋白玻璃化溫度升高，變性溫度減小.可能原因是，擠壓膨化使得玉米醇溶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，空間結(jié)構(gòu)變得松散，熱穩(wěn)定性降低，蛋白變性溫度減小.但該數(shù)值比Pablo等［13］通過(guò)DSC方法對(duì)大豆蛋白熱變性分析的數(shù)值(Tp=98.9℃)高，表明與大豆蛋白相比，擠壓膨化后的玉米醇溶蛋白具有更高的熱穩(wěn)定性.

2.4 玉米醇溶蛋白表面疏水性和游離巰基含量的變化

研究表明［14-15］，蛋白的擠壓膨化過(guò)程一般不會(huì)涉及肽鍵等主要化學(xué)鍵的斷裂或改變，但會(huì)在一定程度上改變維系蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的次級(jí)健.文中主要研究了擠壓膨化對(duì)玉米醇溶蛋白表面疏水性及游離巰基含量的影響.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未處理的玉米醇溶蛋白表面疏水性為(638.62±100.21)，擠壓膨化后該數(shù)值上升為(1191.48±111.24).可能原因是，擠壓膨化過(guò)程中，在高溫、高壓及高剪切力的作用下，玉米醇溶蛋白內(nèi)部部分疏水性氨基酸暴露，導(dǎo)致蛋白表面疏水性增加.Park等［14］采用單螺桿擠壓膨化脫脂大豆粉時(shí)也觀察到了類似的現(xiàn)象.同時(shí)，擠壓膨化使得玉米醇溶蛋白的游離巰基含量由(5.37±0.53)μmol/L減小為(3.49±0.20)μmol/L.可能原因是半胱氨酸在高溫、高壓及高剪切力下形成了二硫鍵.Camire［15］通過(guò)研究擠壓蒸煮過(guò)程中食品的化學(xué)變化，也報(bào)道了相似的結(jié)論.

2.5 玉米醇溶蛋白的物性

擠壓膨化玉米醇溶蛋白的部分物性見表2.

表2 未處理及擠壓膨化的玉米醇溶蛋白的物理性質(zhì)Table 2 Physical properties of zein without and with extrusion

由表2可知，擠壓膨化的玉米醇溶蛋白的物理性質(zhì)發(fā)生了變化，持水力、吸油性與黏度均有所升高，但在水相中的溶解性有較顯著的下降.可能的原因?yàn)?擠壓膨化可使蛋白緊密的空間結(jié)構(gòu)變疏松，加強(qiáng)了水與蛋白的結(jié)合作用，持水力增加;也可使蛋白分子內(nèi)部疏水性基團(tuán)暴露，表面疏水性變大，加強(qiáng)了油脂與蛋白的結(jié)合作用，吸油性增加;同時(shí)，溶解性下降顯著的原因可能是，擠壓膨化使得蛋白發(fā)生受熱變性和交聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致溶解性減小.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)工作參數(shù)下，擠壓膨化使玉米醇溶蛋白部分聚集體發(fā)生融合，球狀聚集體直徑變大;二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α螺旋與β轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化為β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲;蛋白變性溫度、游離巰基含量均變小，表面疏水性增加.蛋白的持水力、吸油性和黏度均有不同程度的增加.擠壓膨化處理使玉米醇溶蛋白的穩(wěn)定性降低，當(dāng)將擠壓膨化作為玉米醇溶蛋白及CGM的改性處理的預(yù)處理步驟時(shí)，會(huì)使蛋白的改性效果更好.

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