楊慧文，張旭紅，梁嘉君，潘育方

（廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣東廣州510008）

白簕葉黃酮的提取純化及其抗炎作用初探

楊慧文，張旭紅，梁嘉君，潘育方*

（廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣東廣州510008）

研究了白簕葉黃酮的提取純化及抗炎效果。實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化了超聲輔助提取法提取白簕葉黃酮，并考察了大孔樹(shù)脂的純化效果。采用50只SD大鼠，分為陰性對(duì)照組、地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組、白簕葉黃酮低、中、高劑量組，灌胃給藥7d，末次給藥后1h，分別測(cè)定大鼠足腫脹度，考察各組用藥對(duì)角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響。結(jié)果顯示，采用最優(yōu)方案提取白簕葉黃酮并進(jìn)行純化，所得提取液中總黃酮含量為37.01mg/g，純化后黃酮純度達(dá)到24.36%。將SD大鼠連續(xù)給藥7d后，白簕黃酮提取物10、20、40mg/（kg·d）均能有效抑制角叉菜膠致大鼠足趾腫脹程度。研究結(jié)果表明，白簕葉黃酮具有抗炎效果，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了白簕的藥用價(jià)值。

白簕，總黃酮，超聲輔助提取法，大孔樹(shù)脂純化，抗炎

白簕（Acanthopanan trifoliatus（L.）Merr.）為五加科五加屬的植物，又名鵝掌簕、禾掌簕、三加皮、三葉五加等，在我國(guó)大陸多分布于中南部各省。白簕的根、根皮、莖、葉均可作為藥材使用，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、散瘀止痛、止咳平喘等功效[1-2]。據(jù)研究，白簕含有皂苷、三萜羧酸、黃酮、糖苷等，化學(xué)成分豐富[3-6]，其植物黃酮經(jīng)過(guò)大量國(guó)內(nèi)外研究證明具有良好的抗氧化抗菌作用[7-8]，而對(duì)其抗炎作用卻鮮有研究。炎癥是指具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)。炎癥與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展和治愈的過(guò)程密切相關(guān)。自從百余年前，水楊酸鈉被應(yīng)用于臨床發(fā)揮抗炎作用以來(lái)，非甾體抗炎藥得到了不斷地改進(jìn)發(fā)展，但對(duì)胃腸道的損傷始終是其最常見(jiàn)且最嚴(yán)重的不良反應(yīng)之一[9]。植物藥物常具有高活性、低毒性的特點(diǎn)，因此，尋找臨床有效的植物抗炎藥物具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)研究白簕葉黃酮的抗炎作用，有利于白簕的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白簕葉（經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院中藥資源系劉基柱副教授鑒定為五加屬植物白簕，標(biāo)本保存于廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院標(biāo)本室） 購(gòu)自恩平響山簕菜茶廠；HPD-600大孔樹(shù)脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中山優(yōu)諾生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)11040302；角叉菜膠 廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院譚毓治教授饋贈(zèng)；地塞米松 天津天藥藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020686；硫酸、無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚、丙酮、苯酚、正丁醇、甲醛等 均為分析純；SD大鼠，體重180～200g，雌雄各半 廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：SCXK（粵）2008-0020，粵監(jiān)證字2008A003。

YLS-7B大鼠足趾容積測(cè)量?jī)x 上海軟隆科技發(fā)展有限公司；HH-2恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LD4-2A離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；DL-360A超聲儀 上海之信儀器有限公司；UV-1200紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；注射器廣東康爾美醫(yī)療器械有限公司，規(guī)格：1mL；烘箱ShanghaiBoxun；BL-220H電子天平 Shimadzu Corporatzon Japan；FA2104A萬(wàn)分之一天平 上海精天電子儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白簕葉的預(yù)處理 將烘干的白簕鮮葉粉碎過(guò)60目篩，稱(chēng)取約200g白簕葉細(xì)粉于1000mL錐形瓶中，并加入500mL石油醚，于30℃恒溫?cái)嚢?，待上層提取液顏色較深時(shí)進(jìn)行抽濾；更新溶劑，如此反復(fù)少量多次浸提至提取液幾近無(wú)色；把溶劑傾去，樣品置于通風(fēng)處自然揮干溶劑至無(wú)醚味，得到脫色素后的白簕葉粉末，備用。

1.2.2 白簕葉黃酮的提取正交優(yōu)化 稱(chēng)取9份白簕葉粉末，每份各2.0g，采用超聲輔助提取法（超聲功率250W）提取白簕葉總黃酮，以蘆丁為對(duì)照品做含量測(cè)定指標(biāo)。以總黃酮含量為測(cè)定指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝。根據(jù)白簕葉黃酮的性質(zhì)，選擇乙醇濃度、超聲時(shí)間、固液比和超聲次數(shù)作為四個(gè)考察因素[10]，每個(gè)因素設(shè)定三個(gè)水平，按L9（34）表做正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程的建立

1.2.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg于10mL容量瓶中，加適量70%乙醇，超聲波振蕩使溶解，再加70%乙醇定容到10mL，充分搖勻，即得1.00mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.2.3.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定 取1.2.3.1項(xiàng)下蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于1cm比色皿中，以70%乙醇作為空白對(duì)照，在200～400nm間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

1.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取1.2.3.1項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)溶液60、100、150、180、200μL于1～6號(hào)10mL容量瓶中，用70%乙醇定容到10mL，得到0.006、0.01、0.015、0.018、0.02mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液，采用紫外分光光度法在265.5nm處測(cè)定吸光度A，以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以最小二乘法做線性回歸，即可得蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。

1.2.4 白簕葉總黃酮含量測(cè)定 用移液管準(zhǔn)確吸取一定體積的總黃酮提取液于容量瓶中，按一定的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋?zhuān)讦?265.5nm處，測(cè)定吸光度A，根據(jù)公式（1）求出總黃酮含量[11]。

式中，Y—提取液總黃酮含量，mg/g；C—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的供試品溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；V—定容體，mL；M—稀釋倍數(shù)；W—所用藥材質(zhì)量，g。

1.2.5 白簕葉總黃酮的純化

1.2.5.1 HPD-600大孔樹(shù)脂柱的預(yù)處理 用95%乙醇浸泡HPD-600大孔樹(shù)脂24h以上，進(jìn)行活化；取經(jīng)預(yù)處理的HPD-600大孔樹(shù)脂約20g濕法裝柱，上柱前用去離子水洗去大部分乙醇后，采用去離子水濕法裝柱，裝好后去離子水沖洗至無(wú)醇味，且樹(shù)脂床沉降均勻，無(wú)氣泡。

1.2.5.2 上樣吸附與洗脫 用去離子水配制1.5mg/mL的上樣液，上樣速度為1mL/min，收集泄露黃酮，上樣吸附10h；接著，用4倍柱體積的去離子水洗脫至洗脫液無(wú)色；再用4倍柱體積的70%乙醇洗脫，收集該洗脫液并測(cè)定吸光度，計(jì)算洗脫液中總黃酮濃度[12]。

1.2.5.3 白簕葉總黃酮純化效果考察 取白簕總黃酮提取液、總黃酮純化洗脫液各100mL，用70%乙醇稀釋100倍，按照1.2.4方法測(cè)定總黃酮含量；將溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，真空干燥，得粗制黃酮粉、純化黃酮粉，分別測(cè)定烘干后固體粉末的質(zhì)量，求出黃酮純度。

1.2.7 對(duì)角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響 取體重為180～200g的SD雄性大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（地塞米松5mg/（kg·d））、白簕葉黃酮低、中、高劑量組（10、20、40mg/（kg·d）），每天灌胃給藥1次，陰性對(duì)照組給予同體積生理鹽水，連續(xù)7d，每天觀察大鼠的體重、進(jìn)食、飲水及活動(dòng)狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[13]，實(shí)驗(yàn)前，用記號(hào)筆在每只大鼠左后足趾同一部位做清晰標(biāo)記，并測(cè)定大鼠該標(biāo)記處的正常足容積。各組末次給藥后1h，自左足趾標(biāo)記處皮下注射1%角叉菜膠0.1mL。致敏后分別于1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、12.0h測(cè)定大鼠足容積。按公式（3），計(jì)算致炎前后足容積之差即得腫脹度，比較給藥組和對(duì)照組的差異情況。按公式（4），計(jì)算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)1.2.3.2項(xiàng)下方法，全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在λ=265.5nm處有最大吸收峰，因此白簕黃酮含量測(cè)定波長(zhǎng)定為265.5nm。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為A= 37.242C+0.0219，r=0.9997，式中，A—供試品溶液總黃酮吸光度；C—供試品溶液總黃酮濃度，mg/mL；r—相關(guān)系數(shù)。r=0.9997，表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.006～ 0.020mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。以蘆丁為對(duì)照品，測(cè)定白簕葉總黃酮含量。

2.2 白簕葉總黃酮提取正交實(shí)驗(yàn)

按照1.2.2項(xiàng)下L9（34）表?xiàng)l件提取白簕葉總黃酮，以總黃酮含量為指標(biāo)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2、表3所示。

由表3、表4結(jié)果可見(jiàn)，四個(gè)考察因素中，固液比對(duì)提取液的總黃酮含量有影響，固液比越大，黃酮含量越高。影響黃酮含量的主次順序依次為：固液比＞提取次數(shù)＞乙醇濃度＞超聲時(shí)間，由于超聲時(shí)間對(duì)總黃酮含量影響很小，因此根據(jù)經(jīng)濟(jì)有效的原則，超聲時(shí)間選為10min。由此得到各因素的最佳搭配為B3A2D2C1，即最佳工藝為固液比1∶40，乙醇濃度70%，間歇超聲2次，每次10min。

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal experiments L9（34）

表3 方差分析表Table 3 Analyze of deviation square

表4 HPD-600大孔樹(shù)脂對(duì)白簕總黃酮的純化富集效果Table 4 The purification effect of HPD-600 macroporous resin on total flavoniods from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr

表5 白簕黃酮對(duì)角叉菜膠致大鼠足趾炎癥的影響（±s，n=10）Table 5 Effect of total flavoniods from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr on carrageenan-induced foot edema in rats（±s，n=10）

表5 白簕黃酮對(duì)角叉菜膠致大鼠足趾炎癥的影響（±s，n=10）Table 5 Effect of total flavoniods from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr on carrageenan-induced foot edema in rats（±s，n=10）

注：與陰性對(duì)照組相比*p<0.05，**p<0.01。

致炎后不同時(shí)間的足趾腫脹度（mL）1h 2h 2.5h 3h 4h 5h 6h 12h陰性對(duì)照組 1.37±0.25 1.03±0.22 0.87±0.15 0.77±0.25 0.71±0.31 0.66±0.28 0.62±0.27 0.63±0.23 0.53±0.23低劑量 1.32±0.06 0.31±0.12** 0.44±0.16** 0.43±0.07* 0.46±0.09* 0.42±0.08* 0.35±0.10* 0.30±0.12** 0.16±0.07**中劑量 1.29±0.17 0.18±0.05** 0.34±0.12** 0.34±0.14** 0.33±0.11* 0.26±0.13* 0.23±0.14* 0.22±0.13** 0.073±0.16**高劑量 1.34±0.14 0.16±0.09** 0.29±0.08** 0.25±0.15** 0.25±0.17* 0.21±0.11* 0.13±0.04** 0.10±0.04** 0.015±0.01**地塞米松 1.26±0.07 0.08±0.01** 0.08±0.08** 0.14±0.06** 0.07±0.05** 0.04±0.02** 0.05±0.03** 0.04±0.01** 0.007±0.01**組別 V（致炎前足體積）（mL）

按照正交結(jié)果最優(yōu)方案，稱(chēng)取5份白簕葉粉末各10.0g進(jìn)行提取，計(jì)算總黃酮含量，該方法提取總黃酮含量均值為37.01mg/g，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，RSD=1.70%，表明該優(yōu)化工藝條件穩(wěn)定。

2.3 白簕葉總黃酮純化效果

白簕葉總黃酮提取液經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后，測(cè)定其總黃酮含量及黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，得結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，粗提液烘干得到干粉中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.18%，純化后質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高為24.36%，表明HPD-600大孔樹(shù)脂對(duì)于白簕葉總黃酮有較好的純化富集效果。

2.4 對(duì)角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響

2.4.1 一般狀況及體重 通過(guò)7d的持續(xù)觀察，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組大鼠的體重均正常增加，且活動(dòng)敏捷，毛色有光澤。說(shuō)明給藥未對(duì)大鼠一般狀況產(chǎn)生影響。

2.4.2 腫脹度的測(cè)定結(jié)果 取體重為180～220g的SD大鼠灌胃給藥7d，于最后一次給藥后1h，進(jìn)行角叉菜膠致大鼠足趾腫脹實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5結(jié)果可見(jiàn)，白簕黃酮各劑量組均能顯著抑制角叉菜膠所致大鼠的足腫脹度（p＜0.05）；與陰性對(duì)照組相比，白簕黃酮提取物低、中、高劑量組對(duì)角叉菜引起的炎癥腫脹均有明顯的抑制作用；提取物各濃度間比較可得，該抑制作用具量效關(guān)系，劑量越大，抑制作用越強(qiáng)。

在大鼠炎癥模型中，角叉菜膠致炎后1h，陰性對(duì)照組大鼠右后足趾開(kāi)始出現(xiàn)急性炎癥樣紅、腫等變化，1h作用最為明顯，腫脹度達(dá)（1.03±0.22）mL，后逐漸消腫，持續(xù)達(dá)12h以上，足體積在12h由正常值（1.37±0.25）mL增至（1.89±0.07）mL。白簕黃酮各劑量組于致炎1h后即發(fā)揮極顯著抗炎功效（p＜0.01）。以白簕黃酮在致炎作用6h時(shí)為例，各組劑量均能顯著抑制大鼠足趾腫脹，白簕黃酮低、中、高劑量組的抑制率分別為52%、65%、82%。

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，植物提取物具有廣泛的藥理作用，常具有免疫調(diào)節(jié)、抑菌消炎、抗癌防癌等諸多生理活性。據(jù)報(bào)道白簕具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、散瘀止痛的效果[14-15]，因此本實(shí)驗(yàn)針對(duì)白簕的主要成分之一白簕葉黃酮，展開(kāi)了抗炎作用的研究。

本實(shí)驗(yàn)中，以角叉菜膠致大鼠足趾腫脹模型作為評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物抗炎作用的炎癥模型。研究發(fā)現(xiàn)，角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足趾腫脹可能與前列腺素（PGE2）有關(guān)[16]。PGE2是抗炎藥物在臨床上作用靶點(diǎn)中最有效且最敏感的物質(zhì)。本研究中，白簕黃酮提取物能顯著抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足趾腫脹，提示抑制腫脹可能與抑制炎癥介質(zhì)PGE2的釋放有關(guān)。

目前臨床上常用的抗炎藥分為甾體和非甾體兩類(lèi)，療效雖好，但均具有較多不良反應(yīng)，其中最常見(jiàn)的為胃腸道反應(yīng)和肝腎毒性等[17]。因此尋找更好的抗炎藥勢(shì)在必行。近年來(lái)大量的研究表明，中草藥提取物黃酮類(lèi)化合物多具有抗炎作用，中草藥具有毒副作用較小的特點(diǎn)，白簕是一種資源豐富、價(jià)格低廉的草藥，且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其黃酮類(lèi)化合物可降低角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的程度，因此對(duì)白簕黃酮類(lèi)化合物的抗炎藥理研究具有一定意義，有較好的開(kāi)發(fā)前景。

4 結(jié)論

采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化超聲輔助提取法提取白簕葉黃酮，并考察了大孔樹(shù)脂的純化效果。結(jié)果顯示，提取最優(yōu)工藝為固液比1∶40，乙醇濃度70%，間歇超聲2次，每次10min。該方法所得提取液中總黃酮含量為37.01mg/g，純化后黃酮純度達(dá)到24.36%。

通過(guò)研究了白簕葉黃酮對(duì)角叉菜膠致大鼠足趾腫脹模型的抑制能力得出，連續(xù)給藥7d后，白簕葉黃酮提取物10、20、40mg/（kg·d）均能有效抑制角叉菜膠致大鼠足趾腫脹程度。該結(jié)果表明白簕葉黃酮具有抗炎效果，本實(shí)驗(yàn)有助于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)白簕的藥理功效。

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Research of extraction，purification and anti-inflammatory effect of total flavonoids from Acanthopanax Trifoliatus（Linn.）Merr.leaves

YANG Hui-wen，ZHANG Xu-hong，LIANG Jia-jun，PAN Yu-fang*
（Guangdong Pharmaceutical University，College of Pharmacy，Guangzhou 510008，China）

To study the extraction，purification and anti-inflammatory effect of total flavonoids from Acanthopananx Trifoliatus（L.）Merr.leaves，the orthogonal test was carried out to optimize the ultrasonic-assisted extraction method.50 rats were divided into normal group，negative control group，positive control group，flavonoid lowdose group，flavonoid mid-dose group and flavonoid high-dose group.7d after dosing by intra-peritoneal injection，carrageenan-induced hind paw edema in rats were conducted to investigate the anti-inflammatory effect.The content of total flavonoids in extraction with the optimized protocol was 37.01mg/g，and purity was up to 24.36%after purification.Total flavonoids at dose of 10，20，40mg/（kg·d）could inhibite swelling induced by carrageenan.Results showed that total flavonoids from Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr.leaves had anti-inflammatory effect，which further develop the medicinal value of Acanthopanax Trifoliatus（Linn.）Merr.

Acanthopanax trifoliatus（Linn.）Merr.；total flavonoids；ultrasonic-assisted extraction；macroporous adsorption resins；anti-inflammatory effect

TS201.1

B

1002-0306（2014）08-0295-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.058

2013－06－17 *通訊聯(lián)系人

楊慧文（1983-），女，碩士研究生，實(shí)驗(yàn)師，主要從事藥學(xué)及新藥開(kāi)發(fā)方面的研究。