李進波盛婧李想潘良文呂蓉楊捷琳

（1.華東理工大學生物工程學院，上海 200237；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；3.上海市亭新中學，上海 201505）

五種DNA提取方法對魚加工制品DNA提取效果的比較

李進波1，2盛婧3李想2潘良文2呂蓉2楊捷琳2

（1.華東理工大學生物工程學院，上海 200237；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；3.上海市亭新中學，上海 201505）

比較5種DNA提取方法對各種魚加工制品的DNA提取效果，為后續(xù)檢測提供更加有效的DNA提取方案。以11種不同加工方式和加工程度的魚制品為樣本，采用5種DNA提取方法——CTAB法以及4種常用市售試劑盒進行DNA提取。對DNA的提取質量、濃度和用于PCR擴增的效果及方法的可操作性等方面進行比較研究。結果顯示，5種方法均可用于大多數(shù)魚加工制品的DNA提取，但每種方法各有利弊。因此認為沒有一種DNA提取試劑盒可以廣泛地對所有類型魚制品樣品均有非常好的提取效果。

魚加工制品 DNA提取 DNA純化 PCR

魚肉及其加工制品是人們佐餐的重要原料，作為日常消費的主要副食品深受廣大消費者喜愛。魚肉加工方式多樣，可冰鮮切片、油浸、煎炸、烘烤、腌漬、煙熏及醬燒等，而制成罐頭、魚子醬、魚片干、咸魚干、魚丸及魚松等食品，也制備成干粉、脫水干片等加入嬰兒食品、方便面及其他速食食品中。冰鮮、冷凍等魚加工制品在我國出口食品中占有主導地位，主要輸往日本、韓國、美國和歐洲等國家和地區(qū)，而每年我國從俄羅斯、美國、秘魯和日本等地進口各種魚類等食用水產(chǎn)品100多萬噸［1，2］。在食品制備過程中，很多加工程序又包括了多個處理步驟而使魚肉改變了原有的形態(tài)特征，因此從外觀上很難進行區(qū)分和辨認。許多國家的食品監(jiān)管部門在市場上發(fā)現(xiàn)魚類制品假冒替代、以次充好現(xiàn)象十分嚴重。僅美國在1998年-2007年間就有34%水產(chǎn)品亂貼標簽、以次充好、以養(yǎng)殖冒充自然捕撈的現(xiàn)象。為此，2010年國家質檢總局曾發(fā)布警示通報，要求加強標簽檢驗、感官查驗和品種鑒別［3］。

而同樣，美國部分水產(chǎn)品進口商從2012年5月起啟動對部分水產(chǎn)品的DNA檢驗程序，以確保產(chǎn)品如實申報，消除水產(chǎn)品以次充好、以養(yǎng)殖冒充自然捕撈的亂象［4］。

為此，在檢測方法建立初期，尋找適宜的DNA提取方案至關重要，是后續(xù)試驗順利進行的保障。魚肉制品在加工過程中很多都經(jīng)過長時間高溫等操作，破壞了細胞的正常結構，而使DNA鏈斷裂［5］，也使DNA鏈與蛋白質之間產(chǎn)生交聯(lián)阻礙DNA提取或擴增［6-8］；另外，加工過程中還經(jīng)常添加如脂類、酚類等大分子化合物以增加色香味，但這些物質在DNA提取中是較難去除的抑制因子，而且化學處理也會使DNA鏈隨機斷裂而形成大小不一的片段。同時，加工過程中的酸性或堿性物質也會使DNA鏈的氫鍵易于水解［9］。這些因素對DNA的提取和純化以及后續(xù)檢測影響很大。因此，本研究對現(xiàn)有的主要DNA提取方法和試劑盒進行比較和評價，旨在為基于核酸的檢測方法建立提供必要的數(shù)據(jù)和樣品處理方案。

1 材料與方法

1.1 材料

采用11種不同加工方式的魚制品為材料，包括醬煮、油浸、與沙拉醬混合、魚子醬、煙熏、腌漬烘干、烤制、粉碎、烤制魚骨、魚松和冰鮮等，基本涵蓋了目前市售的主要加工方式魚制品（表1）。

表1 本研究采用的不同加工方式魚制品列表

1.2 方法

1.2.1 樣品處理和DNA提取 用無菌手術刀將試驗材料切成小塊，先在液氮中將樣品迅速冷凍，后用冷凍研磨機（Spex 6850型，美國）研磨成均勻的粉末。按照試劑盒說明書或方法要求稱取一定量的樣品，采用目前國內外應用較廣泛的Qiagen、Tiangen、Promega和TaKaRa公司生產(chǎn)的動物組織相關DNA提取試劑盒以及傳統(tǒng)的CTAB法分別對11份樣品進行DNA提取，每種試劑盒每個樣品設置3個平行重復，即取樣3管。同時設提取空白對照。

1.2.1.1 CTAB法 各樣品分別取100 mg于2 mL離心管中，加入500 μL 2.0% CTAB 緩沖液（2.0% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，pH8.0；20 mmol/L EDTA-Na，1.4 mol/L NaCl）和5 μL蛋白酶K（天根生化科技有限公司，Cat#RT403）溶液；65℃恒溫孵育30 min，15 000 ×g離心10 min；吸出上清，加入200 μL 氯仿，15 000 ×g離心10 min；吸出上清，加入2倍體積0.5% CTAB 緩沖液（0.5% CTAB，40 mmol/L NaCl，pH 8.0），靜置1 h；15 000 ×g離心5 min，棄上清；加入350 μL TE 緩沖液溶解DNA；加入10 μL RNaseA溶液（天根生化科技有限公司，Cat#RT405-02），37℃溫浴20 min；加入350 μL氯仿，15 000 ×g離心10 min；取出上清，加入0.7倍體積異丙醇，15 000 ×g離心10 min；棄上清，加入200 μL 70% 乙醇洗沉淀2次；吹干殘余乙醇，將DNA晾干；加入100 μL TE 緩沖液溶解DNA。

1.2.1.2 DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen Cat.# 69504）（以下簡稱Qiagen 試劑盒）分別稱取25 mg樣品，按照試劑盒說明書提取DNA，最后在吸附柱中加入100 μL Buffer AE洗脫DNA。

1.2.1.3 海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Cat. # DP324-03）（以下簡稱Tiangen試劑盒）分別稱取30 mg樣品，按照試劑盒說明書提取DNA，最后在吸附柱中加入100 μL TE洗脫液洗脫DNA。

1.2.1.4 Wizard? Genomic DNA Purification Kit（Promega Cat. #A1120）（以下簡稱Promega試劑盒）分別稱取20 mg樣品，按照試劑盒說明書提取DNA，最后加入100 μL DNA Rehydration Solution溶解DNA。

1.2.1.5 Universal Genomic DNA Extraction Kit（Takara Cat. #DV811A）（以下簡稱TaKaRa試劑盒）分別稱取100 mg樣品，按照試劑盒說明書提取DNA，最后向吸附柱中加入100 μL Elution Buffer洗脫DNA。

1.2.2 樣品DNA質量和濃度測定 采用微量分光光度計（GE公司NanoPlus）分別測定DNA在230、260和280 nm的吸收值，以及A260/A280和A260/A230值，以評估提取的DNA中蛋白質和鹽分等雜質去除情況。同時，測定提取的DNA濃度。

1.2.3 PCR擴增

1.2.3.1 DNA樣品稀釋 由于每種DNA提取方法的取樣量不同，為了在同一水平上比較和評價各提取方法，先對提取的DNA進行稀釋。以取樣量最低的Promega試劑盒（20 mg樣品）為標準，采用0.1×TE緩沖液進行稀釋，則CTAB法和TaKaRa試劑盒提取的DNA需要稀釋5倍，Qiagen試劑盒提取的DNA需要稀釋1.25倍，Tiangen試劑盒提取的DNA需要稀釋1.5倍。調整后樣品DNA濃度單位均為ng/μL·20 mg樣品。為了使DNA濃度適于PCR擴增，將調整后的所有樣品DNA均稀釋10倍后再加入反應液中。

1.2.3.2 引物 采用在魚類樣本中均存在的檢測線粒體上12S rRNA基因的引物（12S-F1 5'-TAAGAGGGCCGGTAAAACTC-3'和 12S-R2 5'-GTGGGGTATCTAATCCCAG-3'）［10］對提取的DNA進行擴增，片段大小為224 bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成和純化。

1.2.3.3 PCR擴增 采用25 μL體系進行PCR擴增，其中包括12.5 μL HSTaqMasteMix預混液（寶生物工程（大連）有限公司），400 nmol/L上下游引物，5 μL DNA模板（空白對照用ddH2O補齊）。反應條件為：94℃，5 min；36個循環(huán)×（94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s）；72℃，5 min。

1.2.4 凝膠電泳檢測 配制0.8%瓊脂糖凝膠，吸取5 μL提取的樣品基因組DNA溶液混入上樣緩沖液后加入上樣孔，同時在一個孔中加入DL 10000分子量標準（寶生物工程（大連）有限公司）；配制2.0%瓊脂糖凝膠，在PCR擴增產(chǎn)物中混入上樣緩沖液后加入上樣孔，同時在一個孔中加入DL 2000分子量標準（寶生物工程（大連）有限公司）。調節(jié)電壓在120 V，電泳30 min后在凝膠成像分析系統(tǒng)拍照留存。

2 結果

對4種DNA提取試劑盒和CTAB方法在DNA提取和純化效果上的比較，包括對DNA完整性和純度的測定以及DNA用于PCR擴增的穩(wěn)定性。

2.1 DNA完整性測定

在DNA提取后，首先將基因組DNA在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，但僅有5號煙熏三文魚和11號冰鮮三文魚樣品可見高分子量的基因組DNA條帶（＞10 kb），其余加工樣品在分子量標準250 bp條帶左右有彌散條帶（結果未在此呈現(xiàn)），表明DNA已在樣品加工過程中發(fā)生不同程度的降解。

2.2 DNA純度測定

采用紫外分光光度法測定提取的DNA雜質去除情況，A260/A280比值用來衡量蛋白質的去除情況，A260/A230比值用來衡量鹽分去除情況，結果如表2所示。不同樣品采用5種DNA提取方法的A260/A280比值有較大差異。相對而言，樣品的加工程度越低，獲得的DNA A260/A280比值越接近理想的1.8-2.0之間，如5號煙熏三文魚樣品和11號冰鮮三文魚樣品采用5種方法提取的DNA A260/A280比值差異不大。從每種DNA提取方法對所有樣品的提取效果來看，CTAB法和Tiangen 公司試劑盒在各加工樣品間DNA提取效果差異較大，A260/A280比值在1.7-4.7之間，多數(shù)樣品的該比值均大于2.0，有些甚至大于4.0（采用CTAB法提取的小黃魚咸魚干），表明可能存在大分子雜質產(chǎn)生了光吸收，也可能存在未降解的RNA在260 nm處產(chǎn)生了較高吸收值。其他3種方法提取的各樣品DNA A260/A280比值基本在1.8-2.0附近，表明蛋白質去除效果較好。

230 nm波長是多肽、芳香基團、苯酚和一些碳水化合物的吸光度，因此A260/A230的大小反映了DNA樣品中存在的碳水化合物、鹽類或有機溶劑等的污染情況。結果表明，A260/A230比值在各樣品之間差異明顯，仍然與樣品的加工方式和加工程度有關。相比較而言，采用Qiagen公司和TaKaRa公司試劑盒提取的5號和11號樣品A260/A230比值更接近理想的1.8-2.0，表明采用上述兩種方法提取加工程度較低的魚制品雜質去除效果好。其余3種方法提取的5號和11號樣品A260/A230比值均＜1.0，表明雜質殘留較多，可能的原因之一是三文魚中含有大量的油脂較難去除，與某些鹽離子產(chǎn)生吸附。從每

種DNA提取方法對所有樣品的總體提取效果來看，Qiagen公司和TaKaRa公司試劑盒A260/A230比值更接近1.8-2.0；而其余3種方法對所有樣品A260/A230比值均＜1.0，有些值還≤0.1，表明雜質去除效果不佳。

表2 五種方法提取的DNA純度

2.3 DNA濃度測定

考慮到每種方法取樣量不同，將濃度均換算為每20 mg樣品所提取的DNA濃度，結果如表3所示。相比較而言，加工程度最低的5號和11號樣品采用各提取方法均得到該方法提取的最高DNA濃度，其中采用Qiagen試劑盒得到了最高濃度（分別為246.62 ng/μL和198.66 ng/μL）。而4號樣品鮭魚子醬提取的DNA濃度最低，采用TaKaRa試劑盒只得到0.6 ng/μL DNA。采用5種方法提取的3號樣品紅三文魚沙拉的DNA濃度從1.25-53.28 ng/μL 不等，濃度相差近50倍，說明沙拉醬中的混合油脂等大分子物質在DNA提取中是較難去除的雜質，不同的提取方案對分離純化沙拉醬中的DNA效率有較大差異。6號樣品小咸魚黃魚干的DNA濃度在各提取方法間差異較大，采用TaKaRa試劑盒法只得到1.79 ng/μL，CTAB法得到3.53 ng/μL，Promega試劑盒提取也只得到7.32 ng/μL DNA，說明這些方法對鹽漬樣品的DNA提取效果較差。總體而言，TaKaRa試劑盒提取的所有樣品DNA濃度均較低，除5號和20號樣品外均低于10 ng/μL，表明該試劑盒提取的DNA得率最低。3個平行重復間相對標準偏差（RSD）大于50%的樣品均為DNA濃度較低的樣品，造成此現(xiàn)象的原因可能是當DNA濃度較低時，其實際濃度已偏離紫外風光光度計線性測量范圍，造成測定不準確。

2.4 PCR擴增

將各方法提取的每個樣品3個平行管DNA分別擴增魚類12S rRNA基因，電泳結果見圖1所示。5種方法的陽性對照均可得到明顯的擴增條帶，空白

對照無可見條帶產(chǎn)生（數(shù)據(jù)未在此呈現(xiàn)）。整體來看，各樣品間擴增條帶明暗程度差異較大，基本與DNA提取濃度大小趨勢相一致。如DNA濃度較高的5號和11號樣品條帶很亮，在3個平行管間條帶亮度無顯著差異。此外，7號、9號和10號樣品擴增條帶也比較明亮。說明上述5個樣品采用5種提取方法均可得到質量較好、不影響PCR擴增的DNA溶液。

表3 五種方法提取的DNA濃度（ng /μL）

其余6個樣品，即1-4號、6號和8號樣品的擴增條帶在不同提取方法間有明顯差異。1號樣品醬煮鮐魚采用前3種方法（CTAB法、Qiagen試劑盒和Tiagen試劑盒）提取DNA的擴增條帶較其他兩種方法要亮一些，從條帶亮度看醬煮過程對DNA的破壞比較明顯；2號樣品油浸金槍魚的擴增條帶整體都比較暗，說明油浸處理引起了DNA的大量降解；3號樣品紅三文魚沙拉采用Tiagen和Promega試劑盒法提取DNA擴增條帶明顯比其余三種方法提取DNA的擴增條帶亮，與DNA濃度測定結果一致；4號樣品鮭魚子醬測定的DNA濃度雖然很低，但擴增條帶較亮，說明雜質含量較少，對PCR擴增影響??；6號樣品小黃魚咸魚干的擴增結果在幾種方法間差異最大，采用CTAB法和Promega試劑盒提取DNA沒有明顯可見擴增條帶產(chǎn)生，TaKaRa試劑盒提取DNA有較淡條帶產(chǎn)生，說明長期腌漬對DNA的破壞力很大，而從鹽漬樣品中提取DNA采用適宜的方法至關重要；8號樣品大魚丸采用Tiagen試劑盒提取的DNA可見較淡的擴增條帶，雖然DNA濃度測定值與其他試劑盒相比較高，但可能存在某些

抑制因子對PCR擴增不利。

圖1 PCR擴增結果

2.5 各種DNA提取方法的比較

根據(jù)上述DNA濃度的測定結果，分光光度計對DNA A260/A280和A260/A230兩個比值的測定結果，以及PCR擴增結果對各DNA提取方法進行綜合分析，同時對提取過程的簡易程度等其他因素也進行了分析和總結，各方法的優(yōu)缺點歸納于表4。

表4 五種DNA提取方法優(yōu)缺點比較

3 討論

樣品處理和DNA提取是檢測流程中至關重要的第一步，是檢測方法得以順利實施的前提條件。本研究采用將樣品完全冷凍后研磨的方法使樣品可以充分破碎，為后續(xù)DNA提取打下良好的基礎。本研究對市售的11種不同加工方式魚制品采用5種常見DNA提取方法和試劑盒進行DNA提取。11種魚制品包括熱處理、油漬、鹽漬、烤制、煙熏、粉碎及沙拉醬等調料混合等加工方式，基本涵蓋了目前魚來源加工產(chǎn)品的各種加工技術?，F(xiàn)有的DNA提取方法一般先基于SDS試劑或CTAB試劑裂解細胞，然后通過有機試劑（如酚、氯仿）去除蛋白質等大分子物質和雜質，或采用特異性膜吸附DNA（即膜吸附柱）進行純化。本研究使用的5種DNA提取方法采用的均為上述原理之一，因此也對目前常見的各種提取方法對不同加工處理魚制品的DNA提取效果進行了全面的比較。

與其他比較食品樣品DNA提取方法的研究結果相似，本研究也發(fā)現(xiàn)DNA的質量和得率與樣品的加工程度呈負相關，即樣品的加工程度越高DNA的質量越差，得率越低［9，11，12］。而且，很明顯DNA提取方法對DNA的質量、DNA得率以及PCR擴增效果影響很大，因此對不同加工處理的食品樣品采

用適宜的DNA提取方法至關重要。本研究通過對DNA中蛋白質和其他影響后續(xù)檢測的雜質去除情況、DNA濃度和得率，以及PCR擴增情況的綜合分析結果表明，并沒有一個“萬能的”方法或試劑盒對所有樣品均有最好的DNA提取效果，每一種方法（試劑盒）均有其特定的優(yōu)點和缺點。相比較而言，CTAB法由于純化步驟少，去除蛋白質和雜質效果不好，對特殊處理樣品（如腌漬和沙拉醬混合樣品）的DNA提取效果較差，但價格便宜。4種市售試劑盒對不同加工處理樣品的提取效果有一定差異，在對未知魚類加工制品進行DNA提取前，需對樣品類別進行比照，后選擇合適的提取方法進行DNA提取。對鹽漬類樣品，也可選擇Qiagen試劑盒、Tiangen試劑盒和TaKaRa試劑盒進行DNA提取。對沙拉醬等混合魚制品，可選擇Tiangen試劑盒和Promega試劑盒進行DNA提取。

4 結論

本研究采用目前比較常見的5種DNA提取方法和試劑盒對11種不同加工方法和加工程度的魚類來源制品的DNA提取效果進行了比較。經(jīng)對提取的DNA質量、得率和PCR擴增效果的比較，結果表明，每種DNA提取方法各有利弊，沒有一種DNA提取試劑盒可以對所有類型魚類加工制品樣品均有最好的提取效果。尤其在對加工程度較高的魚制品樣品進行DNA提取時，需要選擇適宜的DNA提取方法方能得到最佳的DNA提取效果。

［1］ 上海農(nóng)業(yè)網(wǎng).中國水產(chǎn)品出口貿易結構的現(xiàn)狀及其優(yōu)化對策［OL］http：//www.shac.gov.cn/zxzx/scfx/tjyfx/200712/t2007121 4 _201314.htm

［2］ 國際農(nóng)產(chǎn)品貿易.我國水產(chǎn)品進出口貿易創(chuàng)新高［OL］http：// www.zgnyqss.com/news/yaowen/2012/0516/134530.html

［3］ 國家質檢總局.進口食品、化妝品警示通報（2010年第57號）：關于美國進口水產(chǎn)品的警示通報［OL］ .2010.

［4］ 中國養(yǎng)殖網(wǎng).5月起水產(chǎn)品進美國須進行DNA檢測［OL］. http：//news.spzs.com/NewsView/20885.html

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（責任編輯 狄艷紅）

Evaluation of Five DNA Extraction Methods for Different Processed Fish Samples

Li Jinbo1，2Sheng Jing3Li Xiang2Pan Liangwen2Lü Rong2Yang Jielin2
（1. Institute of Biotechnology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237；2. Shanghai Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau，Shanghai 200135；3. Shanghai Tingxin Middle School，Shanghai 201505）

It was to find more effective method for DNA extraction, five methodologies for DNA extraction from eleven different processed fish samples were compared. Five methods, including CTAB method and four commercial DNA extraction kits were employed and compared on the extraction of DNA from 11 processed fish samples, such as boiled, oil immersed, fumed, roasted, dried and salt-dried fish etc. The quality and quantity of the extracted DNA were evaluated by measurement of the absorbance at 230, 260 and 280 nm, and by qualitative PCR. The result showed that five methods can all be used to extract from the most processed fish samples, but the quality and quantity of the extracted DNA were different. So every method has its benefits and disadvantages.

Processed fish samples DNA extraction DNA purification PCR

2013-09-22

國家“十二五”農(nóng)村領域國家科技計劃課題（2011AA100807），上海市技術性貿易措施應對專項（12TBT011）

李進波，男，碩士研究生，研究方向：分子生物學；E-mail：jinbo_li@live.com

李想，女，博士，高級工程師，研究方向：分子生物學；E-mail：idealne@163.com