劉丹丹 俞秋霞 張慧娟 姜曉艷 (哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，哈爾濱 150001)

2 型糖尿病與脂代謝異常關(guān)系密切［1］。胰島素抵抗貫穿2 型糖尿病發(fā)展的始終。2 型糖尿病患者多伴有游離脂肪酸升高。高游離脂肪酸與胰島素抵抗和B 細(xì)胞功能損傷有密切關(guān)系。G 蛋白偶聯(lián)受體120(G protein-coupled receptor 120，GPR120)為中長鏈脂肪酸的受體，推測其與影響糖代謝的胰島素信號通路有關(guān)。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(Glucose transporter 4，GLUT4)是胰島素敏感的靶組織主要的胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，它的表達和功能的改變可能涉及肌肉和脂肪細(xì)胞胰島素抵抗。本研究分析脂肪細(xì)胞中脂肪酸受體GPR120 與GLUT4 的關(guān)系，進而揭示其與胰島素抵抗的關(guān)系，為研發(fā)治療糖尿病藥物提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 3T3-L1 細(xì)胞培養(yǎng) 3T3-L1 細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件培養(yǎng)3T3-Ll 細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達70%～80%時，把siRNA-GPR120 轉(zhuǎn)入細(xì)胞，24 h 后(此時記為第0 天)，換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ［DMEM+10%FBS+0.5 mmol/L isobutylmethylxanthine，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)(Sigma)+10 μg/ml 胰島素(Ins)(Sigma)+1.0 μmol/L 地塞米松(Dex)(Sigma)］，第2 天換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ［DMEM +10 μg/ml 胰島素(Ins)+10% FBS］培養(yǎng)2 d，第4 天換成含10%FBS，軟脂酸(PA)(Sigma)0.5 mmol/L 的DMEM 培養(yǎng)24 h，第5 天換成含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)，以后每2 d換液1 次。

1.2 GPR120 siRNA 轉(zhuǎn)染 靶向小鼠(GPR120)基因mRNA(NM_181748.2)熒光標(biāo)記的siRNA 寡核苷酸由上海吉瑪公司化學(xué)合成，siRNA 寡核苷酸序列(GPR120-siRNA)如下所示，靶向mRNA 的位點為:1116-1134，Sense:5'-GUGCAUGUAAAGGGAGUUATT-3';Antisense:5'-UAACUCCCUUUACAUGCACTT-3'。陰性對照:Sense 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3' Antisense 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。siRNA 陰性對照寡核苷酸(Negative control siRNA 或NC-siRNA)購自上海吉瑪公司。待3T3-L1 細(xì)胞生長至70%～80%時，進行轉(zhuǎn)染實驗。把siRNA-GPR120 轉(zhuǎn)入細(xì)胞，40 μg siRNA 溶于160 μl的DEPC 水中。然后按照X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent 的說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染效果用Real-time PCR 測定。

1.3 油紅O 染色 取轉(zhuǎn)染siRNA 后誘導(dǎo)分化第8天的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液經(jīng)PBS 洗3 次后，10%的福爾馬林固定液固定30 min，PBS 洗2 次，油紅O 工作液(0.5 g 油紅O 粉末溶于100 ml 98%的異丙醇)染色8 min，60%異丙醇分色10～20 s，蒸餾水沖洗。顯微鏡下觀察。

1.4 Real-Time PCR siRNA 轉(zhuǎn)染3T3-L1 細(xì)胞后24 h，細(xì)胞誘導(dǎo)分化，第4 天0.5 mmol/L 軟脂酸(PA)孵育24 h 后，向PA 處理后的細(xì)胞中加人胰島素使終濃度為100 nmol/L，37℃孵育15 min。第5天提取3T3-L1 細(xì)胞RNA(Omega 試劑盒)。RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA(TaKaRa PrimeScriptTMRT-PCR Kit)，然后按照 LightCycler480 SYBR Green I Master(Roche)說明書進行。各基因引物如下:β-actin:R 5'-TACGACCAGAGGCATACAGGGACAA-3' ;F 5'-ACCAACTGGGACGATATGGAGAAGA-3'。GPR120:R 5'-CTCGGATCTGGTGGCTCTCA-3';F 5'-GATTGGCCCAACCGCATAG-3'。GLUT4 引物如參考文獻［2］Gyeong-Min DO 所描述的。

1.5 Western blot 3T3-L1 細(xì)胞按照如上所述轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)脂肪酸處理后，第5 天收集細(xì)胞，SDS-PAGE 膠電泳(分離膠15%，濃縮膠5%)，電泳完畢后進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件100 mA 60 min。轉(zhuǎn)膜完畢后應(yīng)用5%脫脂奶粉封閉20 min，15 ml PBST 洗滌1 次，5 min。GPR120 Antibody，GLUT4 antibodies (R＆D Systems，USA)β-actin antibodies (Lab Vision，USA)按1 ∶1 000 稀釋，Western 信號增強劑(HaiGene，M2501)處理2 h，用10 ml Rapid WB buffer 孵育預(yù)處理的一抗40 min。PBST 洗滌1 次，5 min。向10 ml Rapid WB buffer 中加入HRP 標(biāo)記二抗反應(yīng)20 min，二抗按1∶10 000 稀釋。二抗孵育結(jié)束后，PBST洗滌3 次，每次5 min。2 ml 增強型ECL 顯色液(HaiGene，M2301)進行暗室曝光至膠片，曝光30 s。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)3T3-L1 細(xì)胞分化導(dǎo)致GPR120 mRNA 表達 提取誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)分化后第5 天的3T3-L1 細(xì)胞總RNA，用RT-PCR 方法檢測其中GPR120 mRNA的表達，結(jié)果顯示，正常3T3-L1 細(xì)胞中不表達GPR120 mRNA，誘導(dǎo)分化第5 天后可檢測到GPR120 mRNA 表達(P ＜0.05，圖1)。

2.2 干擾GPR120 導(dǎo)致脂質(zhì)減少 3T3-L1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的GPR120-siRNA 后，在藍色激光下可見視野中布滿顯現(xiàn)綠色熒光的物質(zhì)(圖2)。轉(zhuǎn)染NC-siRNA 的細(xì)胞，誘導(dǎo)后第8 天油紅O 染色發(fā)現(xiàn)很多細(xì)胞內(nèi)充滿紅色的脂滴，脂滴圍繞細(xì)胞核排列，一些小脂滴融合成較大的脂滴(圖3 A)。而轉(zhuǎn)染GPR120-siRNA 的細(xì)胞脂滴數(shù)量明顯變少，體積明顯變小(圖3B)。

圖1 3T3-L1 細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中GPR120 mRNA 水平增加Fig.1 Level of GPR120 mRNA was increased through induced differentiation in 3T3-L1 cells

圖2 熒光標(biāo)記的siRNA 的高轉(zhuǎn)染效率(×50)Fig.2 High transfection efficiency of fluorescence labeled siRNA(×50)

圖3 3T3-L1 細(xì)胞油紅O 染色(×200)Fig.3 Oil O red staining of 3T3-L1 cells(×200)

圖4 Real-time PCR 檢測轉(zhuǎn)染NC-siRNA 和GPR120-siRNA 的3T3-L1 細(xì)胞中GPR120 與GLUT4 mRNA 表達水平變化Fig.4 3T3-L1 cells transfected with NC-siRNA or GPR120-siRNA were subjected to real-time PCR for GPR120 and GLUT4 mRNA levels

圖5 Western blot 檢測轉(zhuǎn)染NC-siRNA 和GPR120-siRNA 的3T3-L1 細(xì)胞中GPR120 與GLUT4 蛋白表達水平變化Fig.5 3T3-L1 cells transfected with NC-siRNA or GPR120-siRNA were subjected to Western blot for GPR120 and GLUT4 protein levels

2.3 干擾GPR120 導(dǎo)致GLUT4 表達減少 NC-siRNA 和GPR120-siRNA 轉(zhuǎn)染3T3-L1 細(xì)胞，24 h 后對細(xì)胞進行誘導(dǎo)，3T3-L1 細(xì)胞誘導(dǎo)5 d 后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染GPR120-siRNA 的細(xì)胞GPR120 mRNA 和蛋白表達水平顯著減少(P ＜0.05)，另外GLUT4 mRNA 和蛋白的表達水平也明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖4 和圖5)。

3 討論

GPR120 作為長鏈FFA 的受體，在介導(dǎo)FFA 信號并改變脂肪細(xì)胞的分化和糖脂代謝效應(yīng)等方面可能具有重要的作用。本實驗顯示，在3T3-L1 細(xì)胞誘導(dǎo)之前GPR120 不表達，誘導(dǎo)后第5 天可檢測到GPR120 的表達，可見GPR120 是隨著3T3-L1 細(xì)胞的分化而表達的。當(dāng)GPR120 的表達下調(diào)后，3T3-L1 誘導(dǎo)后8 d 經(jīng)油紅O 染色的細(xì)胞脂滴數(shù)量明顯變少，體積明顯變小。由此可推測GPR120 參與并影響3T3-L1 細(xì)胞的脂肪分化和代謝。

胰島素發(fā)揮生理作用是生物信號發(fā)出、轉(zhuǎn)導(dǎo)與實現(xiàn)的過程［3-5］，胰島素信號傳導(dǎo)障礙是胰島素抵抗的重要形成因素［6-8］。肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞在胰島素刺激下攝取葡萄糖主要通過GLUT4?；A(chǔ)狀態(tài)時細(xì)胞表面GLUT4 很少，但在胰島素刺激下，通過INS-IRS-PI-3K-GLUT4 通路，觸發(fā)含GLUT4 的囊泡以胞吐形式向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)位。

本實驗選擇的軟脂酸為含16 個碳的飽和脂肪酸，為GPR120 的配體。根據(jù)Yi 等［9］報道，5 mmol/L PA 孵育脂肪細(xì)胞24 h 可以誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生。胰島素抵抗發(fā)生時，GLUT4 向細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)位減少。有研究顯示，GLUT4 從細(xì)胞內(nèi)特殊貯存囊泡中的選擇性丟失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GLUT4 的減少，引起GLUT4 轉(zhuǎn)位減少，并可能成為2 型糖尿病的發(fā)病機制。本實驗中采用siRNA 技術(shù)下調(diào)GPR120 在3T3-L1 細(xì)胞中的表達后，高濃度PA 刺激下3T3-L1 細(xì)胞中胰島素信號通路中關(guān)鍵蛋白GLUT4 表達水平較陰性對照組明顯減少。GLUT4 的減少必然影響其向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位，而GLUT4 轉(zhuǎn)位的減少必然影響葡萄糖的轉(zhuǎn)運。因此我們可以推測GPR120 通過影響胰島素信號通路中GLUT4 的表達水平，進一步影響了葡萄糖的代謝。進一步推測GPR120 參與了或加重了胰島素抵抗的發(fā)生。

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