段秀梅 騰永亮 佟玲玲 田 莊 孫 默 王?，?金美善

(吉林大學白求恩第一醫(yī)院病理診斷中心，長春 130021)

甲狀腺乳頭狀微小癌(Papillary thyroid microcarcinoma，PTMC)是甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)的一種亞型，占全部甲狀腺乳頭狀癌的50%左右，約有1/3 的病例可發(fā)生淋巴結轉移，甚至發(fā)生遠處轉移，具有侵襲性發(fā)展的特點［1］，因此，對于直徑≤1.0 cm 的甲狀腺微小病灶的準確判斷，為預測臨床生物學特征，為臨床醫(yī)生選擇合理的治療方案提供依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，PTC 中存在BRAF 基因第15 外顯子V600E 高頻率的點突變，而在其他的甲狀腺良、惡性腫瘤中均未檢測到BRAF 基因的突變，這表明BRAF 突變是PTC 特異性的癌基因［2-4］。由于PTMC 病灶小，發(fā)病隱匿，大體檢查時容易忽略，且在組織學中呈現(xiàn)不典型的病變特征，會導致診斷困難或漏診，所以，檢測BRAF基因的變異對輔助診斷PTMC 很重要，但在檢測BRAF 基因突變時發(fā)現(xiàn)，采用直接測序法和ARMS方法檢測的突變率存在差異。本文旨在探討直接測序法與ARMS 法檢測PTMC 腫瘤組織中BRAF 基因突變的檢出率，并比較兩種方法檢測BRAF 突變的敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 收集吉林大學第一醫(yī)院病理科2012～2013 年接受手術治療的56 例PTMC 標本。男性22 例(39.3%)，女性34 例(60.7%)，年齡33～68 歲，平均48 歲。入選標準:所有患者手術前均未行內(nèi)、外放射治療;標本均經(jīng)常規(guī)病理診斷確診;PTMC 初次切除術后原發(fā)灶無癌殘留。排除標準:術后復發(fā)病例標本;有遠處臟器轉移病例標本;初次手術后原發(fā)灶有癌殘留者。

1.1.2 主要試劑 基因組DNA 提取試劑盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 為德國QIAGEN 產(chǎn)品，聚合酶鏈反應試劑Premix Ex Taq(Loading dye mix)購自日本TaKaRa 生物技術(大連)有限公司;DNA 凝膠回收試劑盒為美國OMEGA 公司產(chǎn)品。人類BRAF 基因V600E 突變檢測試劑盒(熒光PCR法)購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA 提取 中性福爾馬林固定的包埋蠟塊標本切取5～10 μm 厚的切片5～8 張，同時完成1張常規(guī)HE 染色切片，并由病理科醫(yī)生鑒定腫瘤細胞的存在。DNA 抽提采用QIAamp DNA FFPE 試劑盒，根據(jù)說明書提取基因組DNA。洗脫后的DNA經(jīng)Nano-Drop 核酸蛋白測定儀檢測其濃度及純度。

1.2.2 PCR 法及DNA 測序法檢測BRAFV600E基因突變 根據(jù)NCBI-GeneBank 中公布的BRAF 基因全序列(NM_007873.2)，確定擴增目的基因片段，應用Primer 5.0 軟件，根據(jù)引物設計原則設計引物，上游引物:5'-GCTTGCTCTGATAGGAAAATGAG-3';下游引物:5'-GGGCCAAAAATTTAATCAGTGG-3'。利用設計的上、下游引物擴增包含BRAF 基因突變熱點(第15外顯子1 799 位點)的DNA 片段，PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(產(chǎn)物大小為224 bp)，最后將目的片段凝膠回收純化送至吉林省庫美生物科技有限公司進行DNA 測序，并將測序結果與BRAF 基因序列(NM_004333.4)進行比對，以確定有無突變。

1.2.3 ARMS 方法檢測BRAFV600E基因突變 加入DNA 模板的量及反應條件均按試劑盒說明書要求，最終反應結果以ADx-BRAF 突變檢測試劑盒提供的判讀標準確定標本BRAF 基因突變狀態(tài)。

1.2.4 ARMS 方法檢測KRAS/BRAF 拮抗試驗 為了避免高敏感性的ARMS 方法檢測BRAF 突變導致假陽性結果，本研究設立拮抗實驗。對于同1 例病人不可能有KRAS/BRAF 雙突變存在。所以KRAS/BRAF 拮抗實驗選取ARMS 法檢測為BRAF突變陽性的樣本46 例，行KRAS 7 個熱點突變檢測，選1 例結腸癌已知KRAS 突變的樣本做實驗平行陽性對照，同時行BRAF 突變檢測，做實驗的陰性對照。實驗操作和結果判定均按照說明書要求進行。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有統(tǒng)計學檢驗采用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法在檢測BRAF 突變陽性率的比較 56 例PTMC 標本中，直接測序法檢測到BRAF 基因突變18 例，陽性率為32.1%(18/56)，18 例突變均發(fā)生第15 外顯子1 799 位點突變，即T→A，可導致蛋白質(zhì)產(chǎn)物中第600 位的纈氨酸(V)被谷氨酸(E)代替(V600E)。見圖1。ARMS 法檢測到突變46例，陽性率為82.9%(46/56)，后者的突變陽性率明顯高于前者(P ＜0.01)?？梢姡珹RMS 法較直接測序法有更高的突變檢出率，見圖2。

2.2 兩種方法檢測BRAF 敏感性的比較 56 例PTMC 中，直接測序法靈敏度為39.1 % (18/46)，ARMS 法靈敏度為100%(46/46)，后者顯著高于前者(P ＜0.001)。兩種檢測方法的特異度均為100%。兩種檢測方法結果不一致者28 例，不一致率為50%，檢驗符合率為50%。見表1。

2.3 KRAS/BRAF 拮抗實驗的結果 在KRAS/BRAF 拮抗實驗中，陰性對照和陽性對照都成立的前提下，46 例BRAF 突變陽性的樣本中，均無KRAS基因突變;表明BRAF 突變陽性的46 例樣本均無假陽性，見圖3。

圖1 測序法檢測PTMC 組織中BRAF 基因第15 外顯子序列Fig.1 Results of sequencing BRAF gene in exon 15 in PTMC tissue

圖2 ARMS 法檢測PTMC 組織中BRAF 基因第15 外顯子點突變V600EFig.2 Result of ARMS with BRAFV600E point mutation in exon 15 in PTMC tissue

表1 兩種方法檢測BRAF 基因突變敏感性的比較Tab.1 Comparison of sensitivity between two detecting methods for BRAF gene mutation

圖3 KRAS/BRAF 拮抗實驗的結果Fig.3 Result of KRAS/BRAF antagonistic experiment

3 討論

BRAF 又名鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，是RAF 基因家族的成員之一，是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶，調(diào)節(jié)細胞的生長、發(fā)育。這條途徑的持續(xù)激活將最終導致腫瘤的發(fā)生。

BRAF 變異在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)中存在很高的發(fā)生率，達29%～83%［5］，它是PTC 特異性的遺傳突變，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，PTC 中的BRAF 突變主要是第15 外顯子上第1799 位核苷酸上的單堿基轉變，即密碼子600 的錯義突變(V 600E)，導致其編碼的氨基酸由纈氨酸轉變?yōu)楣劝彼?。在甲狀腺良性結節(jié)中并不存在這種突變。所以行BRAF 基因突變檢測對于明確甲狀腺的良、惡性有一定的指導意義。在治療方面，由于激活MAPK激酶途徑在甲狀腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到很重要的作用，針對MAPK 激酶途徑的BRAF 抑制劑可能會成為有效的PTC 治療藥物。在預后方面，BRAF變異與PTC 的腺外侵犯、高分期以及頸部淋巴結高轉移率存在一定的相關性［6］，可以幫助臨床醫(yī)生選擇最佳的治療方案。因此，在甲狀腺的診斷，治療以及預后的評估等方面，BRAF 基因突變檢測有可能具有很大的臨床應有價值。

以往相關研究顯示，直接測序法靈敏度有限，檢測腫瘤組織的突變含量至少達到20%才能被直接測序法檢出［7］，當腫瘤組織中混雜大量正常細胞時其突變信號受抑制，檢測效能顯著降低［8］。而以熒光定量PCR 技術為基礎的ARMS 法，其特異性探針僅識別并擴增BRAF 第15 外顯子V600E 突變序列，使得突變信號的收集過程較少受到腫瘤組織中混雜的正常細胞的干擾。因ARMS 法的高選擇性及高靈敏性，即使腫瘤組織突變含量低至1%也能被其檢出。本次研究結果顯示，對于直徑≤1.0 cm 的甲狀腺微小乳頭狀癌的病灶標本，直接測序法的BRAFV600E的突變檢出率明顯低于ARMS 法(32.1% vs 82.9%，P ＜0.01)，而在敏感性方面，直接測序法也比ARMS 法低(39.1% vs 100%，P ＜0.01);ARMS 法檢測到BRAF突變而直接測序法未檢測到突變的標本共28 例，其中多數(shù)的標本是腫瘤細胞比例低于20%的手術標本，這是經(jīng)HE 染色切片行腫瘤細胞比例評估證實的?？梢娫谶M行病灶小的標本檢測時，考慮到突變檢出率和敏感性等方面，ARMS 法較直接測序法更為可靠。不同靈敏度的方法在檢測小病灶標本BRAF 基因突變時，檢出率等方面差別顯著的主要原因在于病灶小所含腫瘤細胞比例普遍較低。一方面，為提高臨床確診率，常常需要多個病灶切片，來富集腫瘤細胞;另一方面，在進行基因檢測前可經(jīng)過病理評估，將腫瘤區(qū)域圈出并人工刮除區(qū)域外正常細胞，使得處理后的標本所含腫瘤細胞比例達到90%以上，但對病灶內(nèi)分散稀少的腫瘤細胞，無法通過上述簡單方法去除正常細胞，考慮到直接測序法靈敏度僅為20%，因此，應用靈敏度相對不高的直接測序法進行檢測時可導致假陰性結果的增加。另一方面，直接測序法操作繁瑣，時間長，且對DNA 的純度要求較高等方面的缺點，亦不適于大量臨床檢查。由于BRAF 突變與RAS 突變均可在PTC 中發(fā)生，但這些突變是相互排斥的，表明在PTC 中單一致瘤性事件導致的激酶途徑變異足以導致PTC 的發(fā)生［9］。另一方面，PTC 可能是由于其他的激酶途徑如通過另一個RAS 下游的信號通路，包括AKT/STAT 異常激活導致［10］。那么根據(jù)此發(fā)病原理，我們設計了KRAS/BRAF 拮抗實驗來證實ARMS 方法檢出的BRAF 突變的結果。結果證明46 例BRAFV600E點突變均為真陽性。

本研究也存在不足之處，由于BRAF 突變檢測至今未確定“金標準”方法，計算直接測序法與ARMS 法的敏感性數(shù)據(jù)是兩種方法互為對照得到的，而在特異性方面，我們定義只要檢測到BRAF 突變者即為真陽性，因此兩法的特異性均為100%。對甲醛固定的標本是否存在假陽性的問題較難確認，有待于今后深入探究。

［1］Wu LS，Milan SA.Management of microcarcinomas (papillary and medullary)of the thyroid［J］.Curr Opin Oncol，2013，25(1):27-32.

［2］Li X，Abdel-Mageed AB，Kandil E.BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma［J］.Int J Clin Exp Med，2012，5(4):310-315.

［3］Virk RK，Van Dyke AL，F(xiàn)inkelstein，et al.BRAFV600Emutation in papillary thyroid microcarcinoma:a genotype-phenotype correlation［J］.Mod Pathol，2013，26(1):62-70.

［4］Rossi ED，Martini M，Capodimonti S，et al.BRAF (V600E)mutation analysis on liquid-based cytology-processed aspiration biopsies predicts bilaterality and lymph node involvement in papillary thyroid microcarcinoma［J］.Cancer Cytopathol，2013，121 (6):291-297.

［5］Xing M.BRAF mutation in papillary thyroid cancer:pathog-enicrole，molecular bases，and clinical implications［J］.Endocr Rev，2007，28(7):742-762.

［6］Lee JH，Lee ES，Kim YS.Clinicopathologic significance of BRAF V600E mutation in papillary calx，inomas of the thyroid:B meta·analysis［J］.Cancer，2007，110(1):38-46.

［7］Li J，Wang L，Mamon H，et al.Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing［J］.Nat Med，2008，14(5):579-584.

［8］Ellison G，Donald E，Mcwalter G，et al.A comparison of ARMS and DNA sequencing for mutation analysis in clinical biopsy samples［J］.J Exp Clin Cancer Res，2010，29:132.

［9］Tang KT，Lee CH.BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma:pathogenic role and clinical implications.［J］J Chin Med Assoc，2010，73(3):113-128.

［10］Legakis I，Syrigos K，Recent advances in molecular diagnosis of thyroid cancer［J］.J Thyroid Res，2011，384213.