李 寧 吉曉濱 謝景華 劉啟才 (廣州市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣州 510180)

黑色素瘤抗原A3 基因隸屬黑色素瘤抗原家族，除睪丸、胎盤外，在其他正常組織中不表達(dá)。它所編碼的蛋白可被細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)識別和殺傷［1］，但睪丸、胎盤生殖細(xì)胞不表達(dá)MHCⅠ/Ⅱ類分子，不能遞呈MAGE抗原，表達(dá)MAGE-A3 抗原的生殖細(xì)胞不會誘導(dǎo)體內(nèi)的免疫應(yīng)答［2］，并且MAGE-A3 在多種腫瘤如黑色素瘤、舌癌、食管癌、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、骨肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病和淋巴瘤等，都有較高程度的表達(dá)［3-8］，喉癌也不例外［9］，因此，MAGE-A3 抗原具有腫瘤涵蓋類型廣、特異性強的特點，被認(rèn)為是癌-睪丸抗原的典型代表，可作為特異性免疫拮抗的理想靶點及腫瘤輔助診斷、預(yù)后提示的指標(biāo)。

小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞是應(yīng)用較廣的一種腫瘤模型細(xì)胞，體外培養(yǎng)能穩(wěn)定傳代，能有效接種實驗動物體內(nèi)形成移植性腫瘤模型。用于研究腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程，及影響腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移的免疫學(xué)、病理學(xué)參數(shù)［10］。

基于MAGE-A3 喉癌中的較高表達(dá)，我們將先期構(gòu)建喉癌組織MAGE-A3 基因的pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達(dá)質(zhì)粒載體包裹后，通過脂質(zhì)體將MAGE-A3 基因?qū)氲叫∈蠛谏亓鯞16 細(xì)胞內(nèi)，通過G418 篩選，建立表達(dá)MAGE-A3 抗原的B16 腫瘤細(xì)胞模型。該細(xì)胞模型具備B16 細(xì)胞生物的特性，同時能表達(dá)MAGE-A3 抗原。這為以后能以該細(xì)胞模型為基礎(chǔ)，通過體外、體內(nèi)實驗，尋求藥物或方法來抑制、殺滅表達(dá)MAGE-A3 抗原的腫瘤細(xì)胞或組織，特別是研究MAGE-A3 在喉癌免疫治療中的作用，奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞系購自萊德爾公司。pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達(dá)質(zhì)粒先期由廣州醫(yī)科大學(xué)實驗醫(yī)學(xué)研究中心構(gòu)建。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine LTX 及Plus 試劑、OPTI-MEM 培養(yǎng)基為Invitrogen 公司產(chǎn)品，DNA marker、Trizol 及RT-PCR 試劑盒為Takara 公司產(chǎn)品，G418、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 純化試劑盒購自Qiagen 公司，Brilliant ⅡSYBR Green QPCR Master Mix 購自Stragene 公司，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、EcoRⅠ購自New Eenlang Biolabs 公司。

1.2 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 用質(zhì)粒提取試劑盒提取大腸桿菌中pIRES2-EGFP/MAGE-A3。提取的質(zhì)粒純化后進(jìn)一步用XhoⅠ、EcoR Ⅰ雙酶切，然后做1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 轉(zhuǎn)染B16 細(xì)胞 B16細(xì)胞分實驗組、未轉(zhuǎn)染組，每組3 個復(fù)孔。用含雙抗10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)B16 至對數(shù)生長期，消化后做細(xì)胞計數(shù)。在6 孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入5 ×106個細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞70%～80%鋪滿孔底時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，取EP 管兩個，一個EP 管中用375 μl OPTI-MEM 培養(yǎng)基溶pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達(dá)質(zhì)粒7 500 ng，同時加Plus 試劑7.5 μl;另一管用375 μl OPTI-MEM 培養(yǎng)基溶Lipofectamine LTX 22.5 μl。兩者各自混勻后，將一EP管溶液移至另一管中，混勻，室溫孵化5 min。用無血清1640 培養(yǎng)液洗滌孔板中細(xì)胞。實驗組每孔加入脂質(zhì)體質(zhì)?；旌先芤?50 μl 及OPTI-MEM 培養(yǎng)基2 250 μl，共3 孔，對照組直接加入OPTI-MEM 培養(yǎng)基2 250 μl，共3 孔。5 h 后，換成含雙抗10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24 h，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。而后用含800 μg/ml G418 的1640 培養(yǎng)基篩選，直至對照孔未轉(zhuǎn)染細(xì)胞完全死亡。篩選的陽性克隆用含200 μg/ml G418 的1640培養(yǎng)。

1.4 B16 陽性克隆EGFP 表達(dá)的檢測 轉(zhuǎn)染24 h后，更換實驗組6 孔板中培養(yǎng)基，用熒光顯微鏡在藍(lán)光下激發(fā)B16 陽性克隆EGFP，觀察綠光熒光蛋白含量、強度。用含G418 的1640 培養(yǎng)基篩選20 d后，再次檢測。

1.5 B16 陽性克隆MAGE-A3 總RNA 的提取及檢測 用含G418 的1640 培養(yǎng)基篩選20 d 后，從實驗組和未轉(zhuǎn)染組的6 孔板中隨機各取一孔，消化后吸取相同細(xì)胞數(shù)于EP 管中，離心后每管加入1 ml Trizol，室溫放置5 min，待其充分裂解。12 000 r/min離心5 min，棄沉淀后加入氯仿200 μl，振蕩混勻，室溫放置15 min。4℃12 000 r/min 離心10 min。吸取上層水相移至另一EP 管。管中加異丙醇0.5 ml，混勻，室溫孵育5 min。4℃12 000 r/min 條件下離心10 min，棄上清，RNA 沉于管底。管中加入75%乙醇1 ml，溫和振蕩，懸浮沉淀。4℃條件下8 000 r/min 離心5 min，棄上清。室溫晾干至RNA沉淀變透明。用30 μl RNase Free dH2O 溶解RNA沉淀。測定RNA 濃度及OD260/280值。提取RNA 在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳觀察RNA 質(zhì)量，電壓設(shè)定為110 V。

1.6 B16 陽性克隆MAGE-A3 總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 提取的B16 陽性克隆MAGE-A3 總RNA 用TaKaRa primeScript RT-PCR Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在Microtube 管中配制混合液:dNTP Mixture(10 mmol/L each)1 μl、Oligo dT Primer(2.5 μmol/L)1 μl、Template RNA 500 ng，用RNase Free dH2O 配成總體積為10 μl 體系，然后在PCR 儀上65℃5 min 進(jìn)行變性、退火反應(yīng)。反應(yīng)后，在Microtube 管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液:上述變性、退火后反應(yīng)液10 μl、5 ×PrimeScript Buffer 4 μl、RNase Inhibitor(40 U/μl)0.5 μl、PrimeScript RTase(for 2 Step)0.5 μl、RNase Free dH2O 5 μl，總體積20 μl，然后在PCR 儀上按30℃10 min、46℃30 min、95℃5 min 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.7 B16 陽性克隆MAGE-A3 mRNA 表達(dá)水平的檢測 將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 作為模板，設(shè)計MAGEA3 和內(nèi)參照GAPDH 基因的引物，序列分別為:MAGE-A3 正義鏈 5 '-GTACATCTTTGCCACCTGC CTG-3'，反義鏈5'-CTCTTGCGATTATGGTCCAGGAC-3';GAPDH 正義鏈5'-TGGTGCCAAAAGGTCAT-3'，反義鏈5'-TCACACCCATCACAAACATG-3'。序列提交給TaKaRa 公司進(jìn)行引物合成。熒光定量PCR 按SYBR Green Kit(Stratagene)說明書建立20 μl 體系，包括:SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2 ×)10 μl、ROX Reference Dye(50 ×)0.4 μl、2 μm 引物(正義鏈+反義鏈)3 μl、cDNA 1 μl、RNase Free dH2O 5.6 μl。在Stratagene 的M3000P 上進(jìn)行，反應(yīng)條件為:95℃30 s;然后95℃5 s、56℃30 s 及72℃30 s，共40 個循環(huán);最后95℃1 min。每個循環(huán)的第二步完成后檢測熒光信號。

2 結(jié)果

2.1 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒用XhoⅠ、EcoRⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳可見約957 bp 的目的片段、5.3 kb 的載體片段(圖1)，表明先期成功地構(gòu)建了MAGE-A3 的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP/MAGE-A3。

2.2 B16 細(xì)胞EGFP 表達(dá)的檢測 用Lipofectamine LTX 脂質(zhì)體包裹pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染B16 細(xì)胞24 h 后，熒光顯微鏡觀察B16陽性克隆EGFP，見表達(dá)含EGFP 的細(xì)胞散在分布，用熒光顯微鏡觀察示其熒光較弱(圖2、3)，表明pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達(dá)質(zhì)粒已轉(zhuǎn)染到B16 細(xì)胞內(nèi)，EGFP 在B16 細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)。由于MAGE-A3 和EGFP 基因從一個單一的雙順反子mRNA 中被翻譯，EGFP 表達(dá)表明MAGE-A3 蛋白有表達(dá)。

圖1 重組載體pIRES2-EGFP/MAGE-A3 經(jīng)Xho Ⅰ、EcorR Ⅰ雙酶切后的電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of recombinant vector pIRES2-EGFP/MAGE-A3 digested by Xho Ⅰand EcorR Ⅰenzymes

圖2 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞后24 h(熒光顯微鏡×200)Fig.2 After pIRES2 EGFP/MAGE-A3 eukaryotic expression plasmid was transfected mouse melanoma B16 cells in 24 h (fluorescence microscope，×200)

圖3 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞后24 h(普通顯微鏡，×200)Fig.3 After pIRES2 EGFP/MAGE-A3 eukaryotic expression plasmid was transfected mouse melanoma B16 cells in 24 h (general microscope，×200)

用含800 μg/ml G418 的1640 培養(yǎng)基進(jìn)行篩選20 d 后，可見數(shù)個陽性克隆，熒光顯微鏡觀察，見熒光比例增加、熒光強度增強(圖4、5)，表明經(jīng)G418篩選后，未獲得pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞因缺乏氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，而被G418 殺滅，剩下的絕大多數(shù)為成功轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP/MAGEA3 真核表達(dá)質(zhì)粒后具有表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞，表明MAGE-A3 基因在絕大多數(shù)細(xì)胞中表達(dá)，通過有絲分裂將MAGE-A3 基因傳遞給后一代，所呈現(xiàn)出EGFP 熒光強度較前增加，數(shù)目增多，熒光數(shù)的增多，表明轉(zhuǎn)染能表達(dá)EGFP 熒光蛋白的細(xì)胞增多，因該蛋白基因與MAGE-A3基因在同一單一的mRNA中編碼，表明MAGE-A3 蛋白表達(dá)也增加。間接表明B16 陽性克隆EGFP 表達(dá)細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)。

圖4 用含G418 的1640 培養(yǎng)基篩選經(jīng)pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞20 d 后(熒光顯微鏡，×200)Fig.4 After B16 cells transfected with pIRES2-EGFP/MAGE-A3 eukaryotic expression plasmid were screened with 1640 medium containing G418 in 20 days(fluorescence microscope，×200)

圖5 pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞20 d 后(普通顯微鏡，×200)Fig.5 After pIRES2 EGFP/MAGE-A3 eukaryotic expression plasmid was transfected mouse mela-noma B16 cells in 20 days(general microscope，×200)

2.3 B16 陽性克隆MAGE-A3RNA 純度及完整性的鑒定 用RNase Free dH2O 溶解RNA 沉淀，通過分光光度計測下列各組OD260/280值:①未轉(zhuǎn)染組，②pIRES2-EGFP/MAGE-A3 重組質(zhì)粒組。兩組的OD260/280分別是1.98、2.01，均在1.9～2.1 之間，可以認(rèn)為RNA 純度較好。RNA 完整性見瓊脂膠電泳圖(圖6)。

2.4 熒光定量RT-PCR 鑒定MAGE-A3 在B16 細(xì)胞中的表達(dá) 用熒光定量RT-PCR 對各實驗組中的MAGE-A3、GAPDH 基因的mRNA 進(jìn)行檢測，得到:①空白組中的GAPDH、MAGE-A3 擴增的Ct 值分別為13.97、28.49，△Ct1=14.52;②pIRES2-EGFP/MAGE-A3 重組質(zhì)粒組中的GAPDH、MAGE-A3 擴增的Ct 值分別為13.98、26.53，△Ct2=12.55;采用2-△△Ct法相對定量分析，以空白組為對照，△△Ct=△Ct2-△Ct1=-1.97，相對定量值2-△△Ct=3.92，也就是說pIRES2-EGFP/MAGE-A3 重組質(zhì)粒組是空白組MAGE-A3 基因轉(zhuǎn)錄量3.92 倍(圖7)。

圖6 提取B16 細(xì)胞總RNA 瓊脂膠電泳圖(瓊脂糖凝膠濃度為1.5%)Fig.6 Agar gel electrophoresis figure of total RNA extracted from B16 cells (Agarose gel concentration of 1.5%)

圖7 MAGE-A3 基因的熒光定量PCR 檢測Fig.7 MAGE-A3 gene of fluorescent quantitative PCR detection

3 討論

作為癌-睪丸抗原(CT 抗原)家族成員，MAGEA3 有CT 抗原所有的特點［11］，即在正常組織中僅限于睪丸的生殖細(xì)胞、胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)。由于睪丸和胎盤是封閉性組織，且不表達(dá)HLA-I，不能誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)。在各種腫瘤組織有不同頻率的表達(dá);在胃癌MAGE-A3 陽性率是69.44%、Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌是49.5%、原發(fā)性肝癌是24%、頭頸部鱗癌是44.4%、結(jié)腸癌是27.3%、肝內(nèi)膽管癌是40.7%［12］、喉癌MAGE-A3 是51.92%［9］，具有在腫瘤組織中表達(dá)廣泛、特異的特性，是理想的可用于主動免疫治療的靶點。

小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞最初自發(fā)產(chǎn)生于Jackson 實驗室C57BL/6 小鼠的耳部皮膚［13］，后發(fā)展形成實驗動物移植性腫瘤、可在體外生長的傳代培養(yǎng)細(xì)胞系。由于其基因背景清楚、成瘤率高，C57BL/6小鼠的B16 移植瘤模型在腫瘤研究中較常用［14］。本課題選用小鼠黑色素瘤細(xì)胞，保證構(gòu)建MAGE-A3表達(dá)B16 細(xì)胞模型能在小鼠體內(nèi)、體外實驗中，均能發(fā)揮優(yōu)勢。

綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)分子量較小，易與其他目的基因形成融合蛋白，且不影響自身目的基因產(chǎn)物的空間構(gòu)象和功能。GFP 與目的基因融合，將目的基因標(biāo)記為綠色，可定量分析目的基因的表達(dá)水平。增強型綠色熒光蛋白EGFP是紅偏移的變種的野生型GFP，能發(fā)出更明亮的熒光，并優(yōu)化了在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)［15］。

構(gòu)建的pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核質(zhì)粒的核糖體進(jìn)入位點，由pIRES2-EGFP 真核表達(dá)載體決定，位于MAGE-A3 與增強型綠色熒光蛋白(EGFP)編碼區(qū)之間，這就決定MAGE-A3 和EGFP 基因從單一的雙順反子mRNA 中翻譯。因此將MAGE-A3 標(biāo)記為綠色，可通過EGFP 的表達(dá)分析MAGE-A3 的表達(dá)水平。由于pIRES2-EGFP 真核表達(dá)載體上有新霉素抗性盒，pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核質(zhì)粒能使抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶高效表達(dá)，因此，穩(wěn)定表達(dá)pIRES2-EGFP/MAGE-A3 真核細(xì)胞可用氨基糖苷類抗生素G418 篩選，這為篩選穩(wěn)定表達(dá)MAGE-A3 的B16 細(xì)胞創(chuàng)造了條件。

外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法較多，如重組DNA 病毒感染法、顯微注射法、電穿孔法、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和磷酸鈣轉(zhuǎn)染法等［16］。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法適用于把DNA 轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，成功率高。

本實驗用先期構(gòu)建的pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核表達(dá)質(zhì)粒，其中MAGE-A3 基因來自人喉癌組織，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將MAGE-A3 基因?qū)氲叫∈蠛谏亓鯞16 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h 用熒光顯微鏡觀察，綠色熒光蛋白有一定的表達(dá)，濃度低，細(xì)胞核及細(xì)胞胞漿中均可見，以細(xì)胞核中表達(dá)為主，細(xì)胞形態(tài)有改變?？紤]為:①轉(zhuǎn)染過程中脂質(zhì)體對細(xì)胞壁損傷，細(xì)胞壁損傷后，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的改變，對細(xì)胞活性的影響較大，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變及活性下降;②細(xì)胞生長速度快，細(xì)胞密度高，影響細(xì)胞伸展、細(xì)胞形態(tài);③質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，一部分到細(xì)胞核與細(xì)胞DNA 整合，一部分以獨立的環(huán)狀質(zhì)粒形式參加轉(zhuǎn)錄，這表明最初表達(dá)綠色熒光的部位在細(xì)胞核，同時也說明熒光蛋白在細(xì)胞核中能被表達(dá)。

蛋白的表達(dá)需要時間，由蛋白分子量的大小、細(xì)胞生長狀態(tài)及分裂周期等因素決定，轉(zhuǎn)染后24 h，熒光較弱，也在預(yù)料之中。經(jīng)過G418 篩選約20 d 后，篩選獲得的陽性克隆在熒光顯微鏡下可見明亮的綠色熒光，較剛轉(zhuǎn)染時強，熒光分布均勻，主要位于胞漿、胞核中，細(xì)胞培養(yǎng)基中也可見弱熒光，細(xì)胞集聚性生長?？紤]:①通過G418 藥物的篩選，沒有成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細(xì)胞或轉(zhuǎn)錄后表達(dá)不穩(wěn)定的細(xì)胞被藥物抑制導(dǎo)致凋亡，存活的細(xì)胞則能抵抗藥物對核糖體干擾，從而不影響熒光及目的基因蛋白質(zhì)合成;②蛋白質(zhì)的不斷表達(dá)，熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)不斷蓄積，導(dǎo)致熒光強度的逐漸增強，熒光蛋白或目的基因通過囊泡細(xì)胞壁融合或轉(zhuǎn)移的形式排到細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基中能見到淡淡的熒光;③藥物的不斷篩選，陽性克隆細(xì)胞通過細(xì)胞分裂，聚集性生長，因空間的改變，對細(xì)胞形態(tài)有一定的影響。

因MAGE-A3 和EGFP 基因從單一的雙順反子mRNA 中被翻譯，觀察熒光蛋白的變化也就能表現(xiàn)MAGE-A3 的變化，熒光蛋白的穩(wěn)定表達(dá)說明MAGE-A3 在B16 細(xì)胞中已獲得穩(wěn)定表達(dá)且表達(dá)產(chǎn)物定位于胞漿、胞核，部分可分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。我們將穩(wěn)定表達(dá)的陽性克隆細(xì)胞傳代后，提取細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，采用熒光定量PCR 技術(shù)，檢測出MAGE-A3 轉(zhuǎn)錄量是空白組的3.92 倍，表明通過脂質(zhì)體能有效將MAGE-A3 轉(zhuǎn)染到小鼠B16 細(xì)胞中并有效地轉(zhuǎn)錄，也由于BRAF 突變與RAS 突變均可在PTC 中發(fā)生，但這些突變是相互排斥的，表明在PTC 中單一致瘤性事件導(dǎo)致的激酶途徑變異足以導(dǎo)致PTC 的發(fā)生［9］。另一方面，PTC 可能是由于其他的激酶途徑如通過另一個RAS 下游的信號通路，包括AKT/STAT 異常激活導(dǎo)致［10］。那么根據(jù)此發(fā)病原理，我們設(shè)計了KRAS/BRAF 拮抗實驗來證實ARMS 方法檢出的BRAF 突變的結(jié)果。結(jié)果證明46 例BRAFV600E點突變均為真陽性。

本研究也存在不足之處，由于BRAF 突變檢測至今未確定“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，計算直接測序法與ARMS 法的敏感性數(shù)據(jù)是兩種方法互為對照得到的，而在特異性方面，我們定義只要檢測到BRAF 突變者即為真陽性，因此兩法的特異性均為100%。對甲醛固定的標(biāo)本是否存在假陽性的問題較難確認(rèn)，有待于今后深入探究。

［1］Wu LS，Milan SA.Management of microcarcinomas (papillary and medullary)of the thyroid［J］.Curr Opin Oncol，2013，25(1):27-32.

［2］Li X，Abdel-Mageed AB，Kandil E.BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma［J］.Int J Clin Exp Med，2012，5(4):310-315.

［3］Virk RK，Van Dyke AL，F(xiàn)inkelstein，et al.BRAFV600Emutation in papillary thyroid microcarcinoma:a genotype-phenotype correlation［J］.Mod Pathol，2013，26(1):62-70.

［4］Rossi ED，Martini M，Capodimonti S，et al.BRAF (V600E)mutation analysis on liquid-based cytology-processed aspiration biopsies predicts bilaterality and lymph node involvement in papillary thyroid microcarcinoma［J］.Cancer Cytopathol，2013，121 (6):291-297.

［5］Xing M.BRAF mutation in papillary thyroid cancer:pathog-enicrole，molecular bases，and clinical implications［J］.Endocr Rev，2007，28(7):742-762.

［6］Lee JH，Lee ES，Kim YS.Clinicopathologic significance of BRAF V600E mutation in papillary calx，inomas of the thyroid:B meta·analysis［J］.Cancer，2007，110(1):38-46.

［7］Li J，Wang L，Mamon H，et al.Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing［J］.Nat Med，2008，14(5):579-584.

［8］Ellison G，Donald E，Mcwalter G，et al.A comparison of ARMS and DNA sequencing for mutation analysis in clinical biopsy samples［J］.J Exp Clin Cancer Res，2010，29:132.

［9］Tang KT，Lee CH.BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma:pathogenic role and clinical implications.［J］J Chin Med Assoc，2010，73(3):113-128.

［10］Legakis I，Syrigos K，Recent advances in molecular diagnosis of thyroid cancer［J］.J Thyroid Res，2011，384213.