紀 楠，董 懿，唐 欣，劉愛惠，王鋼樂

重組人p53腺病毒在乳腺癌裸鼠體內(nèi)耐藥逆轉(zhuǎn)作用及其對P-糖蛋白表達的影響

紀 楠，董 懿，唐 欣，劉愛惠，王鋼樂

目的研究重組人p53腺病毒(rAd-p53)對人乳腺癌MCF-7/ADR裸鼠移植瘤的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及其對耐藥相關(guān)P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)表達的影響。方法建立人乳腺癌MCF-7/ADR裸鼠耐藥模型，隨機分為對照組、rAd-p53組、阿霉素組、聯(lián)合組，分別給予不同治療。觀察裸鼠腫瘤體積的變化， western blot檢測P-gp蛋白表達情況。結(jié)果成瘤后rAd-p53組、阿霉素組、聯(lián)合組抑瘤率分別為42.05%、49.21%、69.97%，各治療組體積與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且聯(lián)合組顯著優(yōu)于rAd-p53組和阿霉素組(P<0.05)。對照組、rAd-p53組、阿霉素組、聯(lián)合組P-gp表達水平分別為(0.5964±0.0806)、(0.5506±0.0127)、(0.5641±0.0055)、(0.4652±0.0982)，聯(lián)合組P-gp表達水平低于其他各組。結(jié)論Ad-p53對人乳腺癌阿霉素耐藥細胞株MCF-7/ADR建立的裸鼠移植瘤具有多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用,并可下調(diào)P-gp的表達。

乳腺癌；p53基因；多藥耐藥；P-糖蛋白

腫瘤細胞的多藥耐藥(multi-drug resistance, MDR)是指腫瘤細胞對多種結(jié)構(gòu)類型和作用機制不同的藥物同時產(chǎn)生抗藥性，從而降低化療藥物的療效。多藥耐藥性可成為影響化療療效的主要屏障。腫瘤產(chǎn)生MDR的原因十分復(fù)雜，其中多藥耐藥基因1(multidrug resistance 1, MDR1)編碼的跨膜蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)高表達為其主要機制之一[1]。p53基因突變或缺失是目前發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤細胞中最常見的基因突變之一，人類腫瘤中約50%存在p53基因突變[2]，其突變或缺失在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤化療耐藥的形成中起著重要作用，導(dǎo)致化療失敗[3,4]。有研究表明，突變型p53基因可增強MDR1/P-gp的啟動子表達[5]，因此認為在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中MDR1/P-gp表達可能是p53抑癌基因突變失活的結(jié)果。本研究中，筆者以腺病毒介導(dǎo)的野生型p53基因?qū)氲胶蛔冃蚿53基因的人乳腺癌MCF-7/ADR裸鼠耐藥模型中，觀察對其耐藥性、P-gp表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7細胞株及其阿霉素耐藥株MCF-7/Adr購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所；BALB/c裸鼠，雌性，4～6周齡，17～20 g，購自首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，SPF環(huán)境飼養(yǎng)；重組人p53腺病毒注射液(rAd-p53)購自深圳賽百諾公司；阿霉素購自意大利法瑪西亞普強公司； RPMI-1640、小牛血清均購自Gibco公司；β-actin由上海生工合成；鼠抗P-gp(C219)單克隆抗體購自Alexis公司；熒光標記山羊抗小鼠IgG購自rockland公司；β-Actin(C4)為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 腺病毒滴度測定 rAd-p53劑量為1×1012VP/支(VP:病毒顆粒,virus particle),空斑實驗確定其滴度為1×1010PFU /支(PFU:空斑形成單位,plaque forming unit)。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將人乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/ADR置于10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液，在37 ℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細胞為單層貼壁生長。用0.25%胰蛋白酶消化傳代，每3～4 d傳代1次。

1.2.3 人乳腺癌耐藥裸鼠模型的建立及分組給藥 取對數(shù)生長期MCF-7/ADR細胞進行實驗。收集細胞并用PBS液配置成為5×107/ml細胞懸液。于5只BALB/C雌性裸鼠的右側(cè)第2乳墊部位注射，0.1 ml/只，接種20 d后接種部位出現(xiàn)結(jié)節(jié)，待接種腫瘤直徑長至5 mm，頸椎脫臼處死裸鼠，完整剝除腫瘤塊，用其作為瘤源，將瘤塊切成直徑約2 mm，應(yīng)用套管針埋入20只實驗裸鼠右側(cè)第2乳墊部位。乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/ADR裸鼠移植瘤耐藥模型建立。自腫瘤成功插塊于裸鼠后第2天起，每日觀察并隔2 d測量腫瘤體積，待第14天插塊腫瘤直徑長至5 mm后，隨機將20只裸鼠分為4組，每組5只，分別為對照組、rAd-p53組、阿霉素組、聯(lián)合給藥組。自分組之日起，治療方法為：(1)對照組，瘤內(nèi)注射生理鹽水0.1 ml/只，隔日給藥，共7次；(2)rAd-p53組，第3天起，瘤內(nèi)注射rAd-p53，每次5×1010Vp/只，隔日1次，共6次；(3) 阿霉素組，阿霉素4 mg/(kg·次)尾靜脈注射，每4 d 1次，共4次；(4) 聯(lián)合組，兩藥給藥方法同前。

1.2.4 腫瘤體積測量及形態(tài)學(xué)觀察 自分組之日起，用游標卡尺隔2 d測量腫瘤長短經(jīng)，根據(jù)公式V=ab2/2(a為長徑，b為短徑)計算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線、計算抑瘤率。同時自給藥之日起觀察裸鼠精神、飲食、活動、糞便等。用藥后第44天，頸部脫臼法處死全部負瘤裸鼠，解剖裸鼠，觀察局部浸潤情況及有無其他臟器轉(zhuǎn)移。

1.2.5 P-gp表達的檢測 采用western blot半定量法。取腫瘤組織，用剪刀剪成細小顆粒，將樣品加入含1 mmol/L DMSF的RIPA裂解液，并在冰域條件下于預(yù)冷的研缽中研磨均一，冰域條件下超聲1 min，13 000 r/min,4 ℃離心15 min,取上清提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度。以30 μg/孔 上樣，在8% SDS分離膠中恒壓120 V進行電泳90 min，后100 V濕轉(zhuǎn)至PVDF膜70 min，常溫搖床下封閉1 h，鼠抗P-gp單克隆抗體(1∶1000)4 ℃孵育過夜，常溫搖床TBST洗膜3次，熒光標記山羊抗小鼠IgG(1∶3000)常溫搖床孵育1 h，常溫搖床TBST洗膜3次，以β-actin(1∶1000)作為內(nèi)參照，Odyssey熒光掃描。

2 結(jié) 果

2.1 裸鼠腫瘤體積變化及形態(tài)學(xué)情況 實驗裸鼠被種植14 d后成瘤率為100%。用藥后觀察至第44天，腫瘤生長曲線見圖1。對照組，rAd-p53組，阿霉素組，聯(lián)合組腫瘤終末體積分別為(472.5±69.6)mm3，(273.8±50.4)mm3，(240±73.8)mm3，(141.9±44.8)mm3，各治療組抑瘤率分別為42.05%，49.21%，69.97%，與對照組相比，體積差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且聯(lián)合組顯著優(yōu)于rAd-p53組和阿霉素組(P<0.05)。解剖全部裸鼠，肉眼可見：腫瘤呈結(jié)節(jié)狀生長，包膜完整，未向周圍浸潤，腫瘤切面灰白色，有部分出血壞死灶。雙肺無腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移灶。

2.2 P-gp蛋白表達 Western blot檢測顯示見圖2，對照組、rAd-p53組、阿霉素組、聯(lián)合組的P-gp相對表達水平分別為0.5964±0.0806、0.5506±0.0127、0.5641±0.0055、0.4652±0.0982。與對照組相比，聯(lián)合組對P-gp蛋白表達的影響差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

目前，在乳腺癌綜合治療中，化療仍是重要手段。然而，許多乳腺癌患者經(jīng)歷了最初的一段有效化療之后，出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，這主要歸因于腫瘤MDR的產(chǎn)生，后者又與多種機制有關(guān),其中MDR1/P-gp的高表達最為重要。文獻[6]報道指出，未治乳腺癌中P-gp表達率約為40%，說明部分乳腺癌患者在接受化療前就已存在MDR，而經(jīng)化療后P-gp蛋白的表達率可提高37%。此時化療可誘發(fā)P-gp表達率增高[7-14]。

野生型p53基因所編碼的p53蛋白在參與細胞周期調(diào)控、誘導(dǎo)細胞凋亡、調(diào)節(jié)化療敏感性等方面發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。近年來有研究表明，p53基因突變導(dǎo)致了其正常功能的喪失，參與了腫瘤化療耐藥的形成，導(dǎo)致化療失敗[7,8，15，16]。乳腺癌患者中20%～35%存在p53基因突變[9]，在不同的分子亞型中有著明顯的差異，其中基底樣乳腺癌患者中p53基因突變明顯高于其他亞型[13]，這嚴重制約了乳腺癌治療中化療藥物效能的發(fā)揮及患者的預(yù)后[14]?；趯53基因的認識，筆者通過構(gòu)建表達突變型p53的人乳腺癌MCF-7/ADR裸鼠耐藥模型，以其為研究對象，應(yīng)用重組腺病毒介導(dǎo)的野生型p53基因?qū)ζ溥M行轉(zhuǎn)染，并聯(lián)合阿霉素進行治療，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長明顯受到抑制，且聯(lián)合組較Ad-p53及阿霉素單獨用藥組對腫瘤的生長抑制作用更為顯著。

P-gp是由多藥耐藥基因1(MDR1)基因編碼的一種170 ku的跨膜蛋白，它是一種ATP依賴性轉(zhuǎn)運排出泵，通過ATP提供能量將已進入細胞內(nèi)的藥物從胞內(nèi)泵出胞外，使腫瘤細胞內(nèi)藥物濃度降低，從而減弱藥物的細胞毒作用，產(chǎn)生耐藥性[11]。有研究表明，突變型p53與Ets-1協(xié)同作用于MDR1啟動子的Ets結(jié)合位點，從而促進內(nèi)源性MDR1的轉(zhuǎn)錄及P-gp的表達[12,13]。本研究在向MCF-7/ADR移植瘤轉(zhuǎn)染了Ad-p53后，對移植瘤組織中的MDR1基因所表達的P-gp蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入野生型p53基因后P-gp表達有所下降，而野生型p53聯(lián)合阿霉素可使P-gp表達下降更為而顯著，可見Ad-p53通過影響MCF-7/ADR裸鼠移植瘤中的P-gp蛋白表達可以在裸鼠體內(nèi)逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR移植瘤的MDR。

總之,p53基因和P-gp與腫瘤耐藥性有密切聯(lián)系,本研究結(jié)果表明Ad-p53可以通過下調(diào)P-gp的表達,逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR裸鼠移植瘤的耐藥性,為臨床上解決乳腺癌化療耐藥問題提供了體內(nèi)實驗依據(jù)，對乳腺癌的治療具有一定的指導(dǎo)意義。

[1] 沈鎮(zhèn)宙. 乳腺腫瘤學(xué)[M].上海: 科技出版社, 2005: 228-234.

[2] Petitjean A, Mathe E, Kato S,etal. Impact of mutant p53 functional properties on TP53 mutation patterns and tumor phenotype: lessons from recent developments in the IARC TP53 database [J]. Hum Mutat, 2007, 28: 622-629.

[3] Geisler S,L?nning P E,Aas T,etal. Influence of TP53 gene alterations and c-erbB-2 expression on the response to treatment with doxorubicin in locally advanced breast cancer[J].Cancer Res,2001,61:2505-2512.

[4] Lowe S W, Bodis S, McClatchey A,etal. p53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo[J]. Science,1994, 266: 807-810.

[5] Linn S C,Honkoop A H,Hoekman K,etal. p53 and P-glycoprotein are often co-expressed and are associated with poor prognosis in breast cancer [J]. Br J Cancer, 1996, 74(1): 63-68.

[6] Leonessa F，Clarke R. ATP binding cassette transporters and drug resistance in breast cancer [J]. Endocr Relat Cancer, 2003, 10(1): 43-73.

[7] Kudo I, Esumi M, Kida A,etal. p53 mutation, but not in vitro predictor genes of therapeutic efficacy of cisplatin, is clinically relevant in comparing partial and complete responder cases of maxillary squamous cell carcinoma [J]. Oncol Rep, 2010, 24(4): 851-856.

[8] Berge E O, Huun J, Lillehaug J R,etal. Functional characterisation of p53 mutants identified in breast cancers with suboptimal responses to anthracyclines or mitomycin [J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1830(3): 2790-2797.

[9] Turpin E, Bieche I, Bertheau P,etal. Increased incidence of ERBB2 overexpression and TP53 mutation in inflammatory breast cancer [J]. Oncogene, 2002, 21(49): 7593-7597.

[10] Tan B, Piwnica-Worms D, Ratner L. Multidrug resistance transporters and modulation[J]. Curr Opin Oncol, 2000, 12(5): 450-458.

[11] Do P M, Varanasi L, Fan S,etal. Mutant p53 cooperates with ETS2 to promote etoposide resistance [J]. Genes Dev, 2012, 26(8): 830-845.

[12] Sampath J, Sun D, Kidd V J,etal. Mutant p53 cooperates with ETS and selectively up-regulates human MDR1 not MRP1[J]. J Biol Chem, 2001, 276(42): 39359-39367.

[13] Bertheau P, Lehmann-Che J, Varna M,etal. P53 in breast cancer subtypes and new insights into response to chemotherapy [J]. Breast, 2013, 22(2): S27-29.

[14] He S Z, Qi X D, Zhang X M, Wang Y.Experimental study of adenovirus-mudiated p53 gene on the reversal of multidrug resistance in breast cancer[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2007,87(41):2935-2937.

[15] Dalmases A, Gonzalez l, Menendez S,etal. Deficiency in p53 is required for doxorubicin induced transcriptional activation of NF-кB target genes in human breast cancer[J].Oncotarget,2014,5(1):196-210.

[16] Kandioler-Eckersberger D, Ludwig C, Rudas M,etal. TP53 mutation and p53 overexpression for prediction of response to neoadjuvant treatment in breast cancer patients[J].Clin Cancer Res,2000,6(1):50-56.

(2013-11-18收稿 2014-01-20修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

Effectofadenovirus-mediatedp53genetherapyonreversingmultidrugresistanceinbreastcancerinvivoanditseffectonexpressionofP-gp

JI Nan, DONG Yi, TANG Xin, LIU Aihui, and WANG Gangyue. Department of Breast, Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital, Capital Medical University, Beijing 100026, China

ObjectiveTo study the effect of recombinant adenovirus mediated p53 gene on reversing multidrug resistance and expression of P-gp in MCF-7/ADR human breast cancer xenografts.MethodsMCF-7/ADR human breast cancer cells were injected into nude mice. The experimental mice with xenografts were randomized into groups of control, rAd-p53, adriamycin, rAd-p53+adriamycin. The growth of tumor was observed. Expression of P-gp in several groups was assessed by Western blotting.ResultsThe inhibitory rate after administration of rAd-p53, adriamycin, and rAd-p53+adriamycin were 42.05%，49.21%， and 69.97%, respectively. There was significant difference between all treatment groups and control group (P<0.05). And inhibition in group rAd-p53+adriamycin was more significant than inhibition in group rAd-p53 and group adriamycin. The expression of P-gp in groups of control, rAd-p53, adriamycin, rAd-p53+adriamycin were (0.5964±0.0806), (0.5506±0.0127), (0.5641±0.0055), and (0.4652±0.0982), respectively it was decreased significantly in group rAd-p53+Adriamycin.ConclusionsrAd-p53 can effectively reverse the multidrug resistance of MCF-7/ADR xenografts in nude mice. And it can inhibit the expression of P-gp.

breast cancer; P53 gene; multidrug resistance; P-glycoprotein

紀 楠，碩士，住院醫(yī)師，E-mail:vessica828@sina.com

100026，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院乳腺科

王鋼樂，E-mail: gangyue_wang@163.com

R737.9