葛均青， 龔 暉， 陳 超(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所， 福建 福州 350003)

水生動物雙RNA病毒(Aquabirnavirus，ABV)隸屬雙RNA病毒科Birnaviridae，病毒粒子呈二十面 體球形對稱，直徑約60nm，無囊膜。傳染性胰腺壞死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus，IPNV)是ABV的代表種，由Wolf等在1960年首次從河鱒病魚中分離，可引起多種水產(chǎn)動物爆發(fā)急性傳染性疾病，其流行范圍遍及亞、歐、美各國，導(dǎo)致了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失。IPNV也是我國口岸魚類病害的第一類檢疫對象(張奇亞和桂建芳，2008)。ABV的功能基因、診斷檢測及其免疫預(yù)防等一直是國際上魚類病毒病研究的熱點(diǎn)，Dobos and Roberts(1983)和Bernard and Bremont(1995)曾分別就IPNV的分子生物學(xué)的研究作了綜述。而我國也開展了包括IPNV、海洋雙RNA病毒(Marine Birnavirus,MABV)等的分離、鑒定、基因的表達(dá)(林建國，2006;徐海君等，2006;趙麗麗等，2010;胡曉利等，2012;王健楠等，2012)等研究工作。本文結(jié)合IPNV及MABV的最新研究進(jìn)展，對ABV的功能基因、檢測及免疫防治等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ABV的復(fù)制

ABV的基因組以負(fù)鏈RNA為模板進(jìn)行基因組復(fù)制(Cortez-San Martinetal.,2009)，編碼5種成熟的蛋白，在病毒的侵染過程中，還形成多種蛋白前體；IPNV在感染細(xì)胞后6 h，編碼蛋白的合成量增加，在 6-9 h達(dá)到最高峰，隨后減少。IPNV在感染宿主細(xì)胞8-10 h后，病毒RNA的合成量達(dá)到最大，在感染細(xì)胞14 h后，RNA合成量減少。病毒的組裝過程中，IPNV首先被包裝成病毒前體，通過進(jìn)一步裂解成為成熟的病毒粒子。ABV需要在低溫條件下才能繁殖，這是因?yàn)椴《镜慕M裝形成與溫度有關(guān)。如IPNV在28 ℃以下才能在細(xì)胞中繁殖。IPNV能夠進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞，但是不能復(fù)制(Orpetveitetal.,2012)。

2 ABV的編碼蛋白

ABV的基因組由線性雙股、雙節(jié)段的RNA組成，片段A 編碼一個(gè)大的多聚蛋白，包括VP2、VP3、VP4、VP5，并通過間隔的ORF編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白VP5；片段B編碼一個(gè)依賴于RNA的RNA聚合酶。

2.1 VP1蛋白

VP1基因編碼一個(gè)94kD的蛋白，具有RNA聚合酶活性，與病毒RNA轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制有關(guān)(Grahametal.,2011)。VP1可與病毒基因組通過共價(jià)鍵牢固結(jié)合，形成復(fù)合體，介導(dǎo)基因組的復(fù)制。

2.2 VP2蛋白

VP2是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在與宿主細(xì)胞膜受體的互作及進(jìn)入細(xì)胞方面發(fā)揮重要作用(Coulibalyetal.,2010)。IPNV的Sp型VP2的Thr217和Ala221決定了IPNV的毒力(Songetal.,2005)。VP2含有與誘導(dǎo)病毒中和抗體有關(guān)的抗原決定簇，因此它經(jīng)常用于不同種或者新分離病毒的疫苗設(shè)計(jì)、診斷和血清型分類。

2.3 VP3蛋白

VP3是ABV主要的病毒粒子裝配者(Pedersenetal.,2007)，VP3可與VP1結(jié)合且具有強(qiáng)的自我結(jié)合能力，且VP3的自我互作功能域在N末端，而與VP1的互作結(jié)構(gòu)域在C末端；另外，VP3可以特異性結(jié)合dsRNA，而且C末端在dsRNA的結(jié)合能力方面發(fā)揮關(guān)鍵作用；動力學(xué)分析表明VP1-VP3復(fù)合物的存在優(yōu)先于形成成熟的病毒粒子，這表明其可能在裝配過程中發(fā)揮重要作用(Baharetal.,2013)。另外，VP3可通過上調(diào)Bad的表達(dá)及破壞線粒體并激活下游caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(Chiuetal.,2010)。

2.4 VP4蛋白

VP4是ABV的非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural Polypeptide,NS)，具蛋白酶活性。在它的作用下，將片段A編碼的多聚蛋白NH(2)-pVP2-VP4-VP3-COOH剪切加工為pVP2和VP3，pVP2進(jìn)一步剪切為核衣殼蛋白VP2。結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析表明，VP4的裂解位點(diǎn)形成Ser/Lys二聯(lián)體?；鞍酌笍?fù)合物(Leeetal.,2007)。

2.5 VP5蛋白

VP5是Bcl-2家族的抗凋亡基因，可調(diào)控Mcl-1和病毒蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)感病細(xì)胞產(chǎn)生非典型性細(xì)胞凋亡(Hongetal.,2002)。VP5不是病毒在體內(nèi)復(fù)制所必需的，VP5的缺失并不改變病毒的毒力及在宿主上建立持續(xù)穩(wěn)定的侵染(Santietal.,2005)。

3 ABV的侵染機(jī)制

ABV具有很廣的宿主域，可以侵染多種物種。IPNV可以特異性地與CHSE-214，SHK-1和ASK細(xì)胞膜上一個(gè)大約220 kDa的膜蛋白結(jié)合，然而與非鮭魚細(xì)胞株BF-2細(xì)胞膜上的結(jié)合的蛋白大小約190 kDa(Orpetveitetal.,2008)。流式細(xì)胞試驗(yàn)可以直接檢測到IPNV的結(jié)合和侵染，在IPNV單獨(dú)或與IHNV共同感染宿主細(xì)胞時(shí)，IPNV可以結(jié)合88%的細(xì)胞，然而IHNV在其它病毒存在時(shí)，其結(jié)合效率總是較低，但是VHSV的結(jié)合不受影響。對宿主進(jìn)行抗病毒藥物的處理，不影響IPNV和VHSV對細(xì)胞的結(jié)合，但是降低了IHNV的結(jié)合。IPNV可以進(jìn)入通過受體介導(dǎo)的途徑進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞，但是不能復(fù)制(Orpetveitetal.,2012)。當(dāng)IHNV、VHSV和IPNV同時(shí)感染宿主細(xì)胞時(shí)，其效率明顯低于IPNV(de las Herasetal.,2008)。Mx蛋白對IPNV有抗病毒作用，其表達(dá)可以明顯降低IPNV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制病毒蛋白的合成(Larsenetal.,2004)。IPNV通過調(diào)控大西洋鮭魚炎癥因子的表達(dá)建立持續(xù)感染(Reyes-Cerpaetal.,2012)，而疾病的爆發(fā)和死亡率取決于宿主的防御與信號通路的級聯(lián)調(diào)控和病毒基因組特性間的微妙平衡(Skjesoletal.,2011)。

4 ABV的診斷

ABV引起魚類致病性感染或者潛伏在魚體內(nèi)、發(fā)病期間流行性傳染，最終導(dǎo)致漁業(yè)生產(chǎn)的重大損失。ABV的檢測方法有多種，而提高靈敏度和去除假陽性是檢測方法發(fā)展的趨勢。免疫學(xué)檢測是應(yīng)用較早的IPNV檢測方法。但是，IPNV抗體檢測常缺乏實(shí)際意義，一方面由于曾經(jīng)感染IPNV的虹鱒血清內(nèi)的抗體可持續(xù)數(shù)年，另一方面IPNV攜帶者不含或只含滴度很低的抗體。此外，正常虹鱒血清中還存在非特異的抗病毒成分，所以大多數(shù)情況下難以判斷抗體的水平及其意義。近年來，開展的基于RT-PCR的檢測方法，為IPNV 的檢測和疫情監(jiān)測提供了可靠依據(jù)，如RT-PCR-ELISA(Milneetal.,2006)，定量RT-PCR(Bowersetal.,2008;Liuetal.,2008)和RT-LAMP(Solimanetal.,2009)等。

5 ABV的危害

IPNV可感染多種魚類、牡蠣等淡水和海水水生動物，以進(jìn)行垂直傳播和水平傳播。苗期及在環(huán)境脅迫條件下容易發(fā)病，并引起10%-90%的死亡率(Ronnesethetal.,2013)。病毒感染除可直接導(dǎo)致較高的死亡率外，還可以引起免疫抑制，使得容易感染其它病原(Johansen and Sommer,2001)。染病后存活的魚類成為無癥狀的病毒攜帶者，可將病毒粒子釋放到環(huán)境中去。

6 ABV的免疫防治

免疫防治是對IPNV進(jìn)行有效防治的重要措施。IPNV疫苗在控制IPNV的侵染過程中發(fā)揮了重要作用(McBeathetal.,2007)。利用桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)的IPNV Sp株的A片段可在昆蟲細(xì)胞內(nèi)自我組裝形成病毒樣顆粒(VLPs)；利用浸泡和免疫注射的方法測定了VLP的免疫原性，表明免疫效果與免疫方法和免疫劑量均有關(guān)系(Shivappaetal.,2005)。VP2蛋白的糖基化在引起IPNV感染的細(xì)胞的免疫反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用(Fridholmetal.,2007)。用在細(xì)菌、酵母、魚及哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的VP2蛋白免疫鮭魚，都能夠產(chǎn)生抗體(Labusetal.,2001)。在酵母中表達(dá)的VP2蛋白可以自我組裝成約20 nm的亞病毒顆粒，注射純的VP2亞病毒顆粒(rVP2-SVP)或喂食表達(dá)重組蛋白的酵母的虹鱒魚都可以檢測到IPNV抗體；口服或者注射rVP2-SVPs都可以引起魚的特異性免疫反應(yīng)，降低IPNV的侵染(Allnuttetal.,2007)。VP2還是開發(fā)DNA疫苗的良好候選基因(de Las Herasetal.,2009)，用基于VP2基因的DNA疫苗口服免疫鮭魚，可有效激活鮭魚的免疫系統(tǒng)，攻毒結(jié)果顯示魚的存活率大大提高(de las Herasetal.,2010;Ballesterosetal.,2014)。VP3蛋白也是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白。用在大腸桿菌中表達(dá)的VP2和VP3免疫虹鱒魚，可誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生抗體，但是免疫VP3魚體內(nèi)的抗體水平明顯高于免疫VP2魚體內(nèi)的抗體水平(Moonetal.,2004)。開發(fā)基于IPNV結(jié)構(gòu)蛋白的多聯(lián)亞單位疫苗是防控IPNV的重要手段(Dharetal.,2010)。研究表明，在病毒裝配過程中的病毒前體可激活魚體的免疫系統(tǒng)(Rivas-Aravenaetal.,2012)，而獲得性免疫在免疫保護(hù)過程中發(fā)揮重要作用(Munang'anduetal.,2014)。但有些疫苗雖然能刺激機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，但并不能產(chǎn)生有效的保護(hù)作用，而在試驗(yàn)階段具保護(hù)作用的免疫制劑往往在生產(chǎn)中并不能真正起到保護(hù)作用，這就亟待開發(fā)疫苗免疫效果的評價(jià)體系。

胡曉利,李偉,肇慧君，吳斌.2012.虹鱒魚傳染性胰臟壞死病病毒的分離與鑒定.中國動物檢疫,29(3):27-30.

林建國.2006.MABV Y-6 VP2、VP3和VP5基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及VP2、VP3和VP5基因特性分析.浙江大學(xué),博士學(xué)位論文.

王健楠,趙麗麗,劉立月,連科迅,李一經(jīng),葛俊偉,劉敏.2012.傳染性胰腺壞死病病毒分離株VP2基因抗原表位區(qū)融合表達(dá)及免疫特性的分析.水產(chǎn)學(xué)報(bào),36(11):1770-1775.

徐海君,楊章女,林建國，張傳溪.2006.海洋雙RNA病毒(MABV)vp2e和vp3基因在昆蟲細(xì)胞中的高效表達(dá).農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),14(4):612-617.

張奇亞，桂建芳.2008.水生病毒學(xué).高等教育出版社.

趙麗麗,劉敏,哈卓,劉巍巍,趙永欣,葛俊偉,喬薪瑗，李一經(jīng).2010.傳染性胰腺壞死病毒VP3蛋白的原核表達(dá)及抗原性分析.水產(chǎn)學(xué)報(bào),34(4):604-610.

Allnutt FC,Bowers RM,Rowe CG,Vakharia VN,LaPatra SE,Dhar AK.2007.Antigenicity of infectious pancreatic necrosis virus VP2 subviral particles expressed in yeast.Vaccine,25(26):4880-4888.

Bahar MW,Sarin LP,Graham SC,Pang J,Bamford DH,Stuart DI,Grimes JM.2013.Structure of a VP1-VP3 complex suggests how birnaviruses package the VP1 polymerase.Journal of Virology,87(6):3229-3236.

Ballesteros NA,Rodriguez Saint-Jean S,Perez-Prieto SI.2014.Food pellets as an effective delivery method for a DNA vaccine against infectious pancreatic necrosis virus in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss,Walbaum).Fish Shellfish Immunol,37(2):220-228.

Bernard J,Bremont M.1995.Molecular biology of fish viruses:a review.Veterinary Research,26(5-6):341-351.

Bowers RM,Lapatra SE,Dhar AK.2008.Detection and quantitation of infectious pancreatic necrosis virus by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction using lethal and non-lethal tissue sampling.Journal of Virology Methods,147(2):226-234.

Chiu CL,Wu JL,Her GM,Chou YL,Hong JR.2010.Aquatic birnavirus capsid protein,VP3,induces apoptosis via the Bad-mediated mitochondria pathway in fish and mouse cells.Apoptosis,15(6):653-668.

Cortez-San Martin M,Villanueva RA,Jashes M,Sandino AM.2009.Molecular characterization of IPNV RNA replication intermediates during the viral infective cycle.Virus Research,144(1-2):344-349.

Coulibaly F,Chevalier C,Delmas B,Rey FA.2010.Crystal Structure of an Aquabirnavirus Particle:Insights into Antigenic Diversity and Virulence Determinism.Journal of Virology,84(4):1792-1799.

de Las Heras AI,Perez Prieto SI,Rodriguez Saint-Jean S.2009.In vitro and in vivo immune responses induced by a DNA vaccine encoding the VP2 gene of the infectious pancreatic necrosis virus.Fish and Shellfish Immunology,27(2):120-129.

de las Heras AI,Rodriguez Saint-Jean S,Perez-Prieto SI.2008.Salmonid fish viruses and cell interactions at early steps of the infective cycle.Journal of Fish Diseases,31(7):535-546.

de las Heras AI,Rodriguez Saint-Jean S,Perez-Prieto SI.2010.Immunogenic and protective effects of an oral DNA vaccine against infectious pancreatic necrosis virus in fish.Fish and Shellfish Immunology,28(4):562-570.

Dhar AK,Bowers RM,Rowe CG,Allnutt FCT.2010.Expression of a foreign epitope on infectious pancreatic necrosis virus VP2 capsid protein subviral particle (SVP) and immunogenicity in rainbow trout.Antiviral Research,85(3):525-531.

Dobos P,Roberts TE.1983.The molecular biology of infectious pancreatic necrosis virus:a review.Canadian Journal of Microbiology,29(4):377-384.

Fridholm H,Eliasson L,Everitt E.2007.Immunogenicity properties of authentic and heterologously synthesized structural protein VP2 of infectious pancreatic necrosis virus.Viral Immunology,20(4):635-648.

Graham SC,Sarin LP,Bahar MW,Myers RA,Stuart DI,Bamford DH,Grimes JM.2011.The N-terminus of the RNA polymerase from infectious pancreatic necrosis virus is the determinant of genome attachment.PLoS Pathogens,7(6):e1002085.doi:1002010.1001371/journal.ppat.1002085.

Hong JR,Gong HY,Wu JL.2002.IPNV VP5,a novel anti-apoptosis gene of the Bcl-2 family,regulates Mcl-1 and viral protein expression.Virology,295(2):217-229.

Johansen LH,Sommer AI.2001.Infectious pancreatic necrosis virus infection in Atlantic salmon Salmo salar post-smolts affects the outcome of secondary infections with infectious salmon anaemia virus or Vibrio salmonicida.Dis Aquat Organ,47(2):109-117.

Labus MB,Breeman S,Ellis AE,Smail DA,Kervick M,Melvin WT.2001.Antigenic comparison of a truncated form of VP2 of infectious pancreatic necrosis (IPN) virus expressed in four different cell types.Fish and Shellfish Immunology,11(3):203-216.

Larsen R,Rokenes TP,Robertsen B.2004.Inhibition of infectious pancreatic necrosis virus replication by atlantic salmon Mx1 protein.Journal of Virology,78(15):7938-7944.

Lee J,Feldman AR,Delmas B,Paetzel M.2007.Crystal structure of the VP4 protease from infectious pancreatic necrosis virus reveals the acyl-enzyme complex for an intermolecular self-cleavage reaction.Journal of Biology Chemistry,282(34):24928-24937.

Liu Z,Teng Y,Liu H,Jiang Y,Xie X,Li H,Lv J,Gao L,He J,Shi X,Tian F,Yang J,Xie C.2008.Simultaneous detection of three fish rhabdoviruses using multiplex real-time quantitative RT-PCR assay.Journal of Virology Methods,149(1):103-109.

McBeath AJ,Snow M,Secombes CJ,Ellis AE,Collet B.2007.Expression kinetics of interferon and interferon-induced genes in Atlantic salmon (Salmo salar) following infection with infectious pancreatic necrosis virus and infectious salmon anaemia virus.Fish and Shellfish Immunology,22(3):230-241.

Milne SA,Gallacher S,Cash P,Porter AJ.2006.A reliable RT-PCR-ELISA method for the detection of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) in farmed rainbow trout.Journal of Virology Methods,132(1-2):92-96.

Moon CH,Do JW,Cha SJ,Bang JD,Park MA,Yoo DJ,Lee JM,Kim HG,Chung DK,Park JW.2004.Comparison of the immunogenicity of recombinant VP2 and VP3 of infectious pancreatic necrosis virus and marine birnavirus.Archive of Virology,149(10):2059-2068.

Munang'andu HM,Mutoloki S,Evensen O.2014.Acquired immunity and vaccination against infectious pancreatic necrosis virus of salmon.Dev Comp Immunol,43(2):184-196.

Orpetveit I,Gjoen T,Sindre H,Dannevig BH.2008.Binding of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) to membrane proteins from different fish cell lines.Archive of Virology,153(3):485-493.

Orpetveit I,Kuntziger T,Sindre H,Rimstad E,Dannevig BH.2012.Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) from salmonid fish enters,but does not replicate in,mammalian cells.Virol J,9:228.

Orpetveit I,Kuntziger T,Sindre H,Rimstad E,Dannevig BH.2012.Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) from salmonid fish enters,but does not replicate in,mammalian cells.Virology Journal,9:228.

Pedersen T,Skjesol A,Jorgensen JB.2007.VP3,a structural protein of infectious pancreatic necrosis virus,interacts with RNA-dependent RNA polymerase VP1 and with double-stranded RNA.Journal of Virology,81(12):6652-6663.

Reyes-Cerpa S,Reyes-Lopez FE,Toro-Ascuy D,Ibanez J,Maisey K,Sandino AM,Imarai M.2012.IPNV modulation of pro and anti-inflammatory cytokine expression in Atlantic salmon might help the establishment of infection and persistence.Fish and Shellfish Immunology,32(2):291-300.

Rivas-Aravena A,Cortez-San Martin M,Galaz J,Imarai M,Miranda D,Spencer E,Sandino AM.2012.Evaluation of the immune response against immature viral particles of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV):a new model to develop an attenuated vaccine.Vaccine,30(34):5110-5117.

Ronneseth A,Haugland GT,Wergeland HI.2013.Flow cytometry detection of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) within subpopulations of Atlantic salmon (Salmo salar L.) leucocytes after vaccination and during the time course of experimental infection.Fish Shellfish Immunol,34(5):1294-1305.

Santi N,Song H,Vakharia VN,Evensen O.2005.Infectious pancreatic necrosis virus VP5 is dispensable for virulence and persistence.Journal of Virology,79(14):9206-9216.

Shivappa RB,McAllister PE,Edwards GH,Santi N,Evensen O,Vakharia VN.2005.Development of a subunit vaccine for infectious pancreatic necrosis virus using a baculovirus insect/larvae system.Developments in Biologicals (Basel),121:165-174.

Skjesol A,Skjaeveland I,Elnaes M,Timmerhaus G,Fredriksen BN,Jorgensen SM,Krasnov A, Jorgensen JB.2011.IPNV with high and low virulence:host immune responses and viral mutations during infection.Virology Journal,8:396.

Soliman H,Midtlyng PJ,El-Matbouli M.2009.Sensitive and rapid detection of infectious pancreatic necrosis virus by reverse transcription loop mediated isothermal amplification.Journal of Virology Methods,158(1-2):77-83.

Song H,Santi N,Evensen O,Vakharia VN.2005.Molecular determinants of infectious pancreatic necrosis virus virulence and cell culture adaptation.Journal of Virology,79(16):10289-10299.