楊雅麗，李希斌，陳 徹，楚惠媛，耿廣琴，劉浩浩

(甘肅中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院甘肅中醫(yī)學(xué)院敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000)

隨著現(xiàn)代競(jìng)技運(yùn)動(dòng)水平的不斷提高，運(yùn)動(dòng)員在訓(xùn)練過(guò)程中出現(xiàn)過(guò)度訓(xùn)練的幾率也越來(lái)越高。長(zhǎng)期過(guò)度訓(xùn)練可引起機(jī)體肝組織自由基增多，進(jìn)而造成肝細(xì)胞損傷，影響運(yùn)動(dòng)能力［1-2］。敦煌固本方由敦煌古醫(yī)方《茯神湯》［3］加減化裁而來(lái)，全方補(bǔ)氣養(yǎng)血、助陽(yáng)益精，能全面提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)功能。敦煌固本方組方合理，結(jié)構(gòu)嚴(yán)謹(jǐn)，配方中所用藥物未見(jiàn)含有運(yùn)動(dòng)員違禁成分的相關(guān)報(bào)道。筆者已經(jīng)研究證實(shí)該方有抗疲勞的功效［4］，但其抗疲勞的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)建立小鼠游泳運(yùn)動(dòng)疲勞模型，探討敦煌固本方對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞小鼠肝組織自由基代謝及超微結(jié)構(gòu)的影響，從而找尋該方消除運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用機(jī)制，為該方應(yīng)用于體育實(shí)踐提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

健康雄性清潔級(jí)昆明種小鼠60 只，體質(zhì)量為(20 ±2)g、由甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為SCXK(甘)-2011 -0001。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22 ± 2)℃，濕度(50 ± 10)%，自由攝食，飲水。

1.2 藥品、試劑與儀器

敦煌固本方由人參、黃芪、白術(shù)、岷當(dāng)歸、陳皮、馬鹿茸等組成，由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房提供。將藥材置于藥量5 ～7 倍的蒸餾水中浸泡1 ～2 h，煮沸30 min，過(guò)濾，為1 煎;藥渣加3 ～4 倍蒸餾水繼續(xù)煮沸20 min，過(guò)濾，為2 煎;將1 煎和2 煎藥液合并后，濃縮至37.5 mL，即配制成2 g 生藥/ mL 溶液，備用。丙二醛(MDA)測(cè)試盒(批號(hào)20120317)、谷胱甘肽- 過(guò)氧化物酶(GSH-PX)測(cè)試盒(批號(hào)20120414)、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒(批號(hào)20120413)、T-AOC 測(cè)試盒(批號(hào)20120320)、考馬斯亮藍(lán)測(cè)試盒(批號(hào)20120516)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。BS224S 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;XYJ80 -20型離心機(jī)，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品;VIS -723N 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司產(chǎn)品;DG3022 型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，華東電子管廠產(chǎn)品;JEOL -1230 透射電子顯微鏡，日本電子公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組與處理

購(gòu)進(jìn)小鼠后，先適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，然后按照體質(zhì)量隨機(jī)分為6 組，分別為安靜對(duì)照組(control，C)、安靜給藥組(experiment，E)、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(training control，TC)、運(yùn)動(dòng)給藥組(training experiment，TE)，后兩組又各分為力竭運(yùn)動(dòng)后即刻組和力竭運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)24 h 組，即TC0、TC24、TE0、TE24。見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物分組與處理

對(duì)照組每日灌胃生理鹽水0.4 mL，給藥組每日灌胃敦煌固本方0.4 mL，基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)。運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行6 周的游泳訓(xùn)練，水溫(30 ±2)℃，水深35 cm，于灌胃后1 h 開(kāi)始運(yùn)動(dòng)，每周游6 d，每周一、周四稱量體質(zhì)量。第1 周游泳40 min/d，以后每周遞加10 min，至第6 周游泳90 min/d。處死動(dòng)物前稱量其體質(zhì)量，進(jìn)行最后一次無(wú)負(fù)重的力竭性游泳，記錄游泳時(shí)間。力竭判斷的標(biāo)準(zhǔn)為:小鼠沉入水中超過(guò)10 s，且放在平面上無(wú)法完成翻正反射［5］。

力竭運(yùn)動(dòng)后運(yùn)動(dòng)組分為運(yùn)動(dòng)后即刻組和運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)24 h 組，運(yùn)動(dòng)后即刻組在力竭運(yùn)動(dòng)后即刻處死，運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)24 h 組于力竭運(yùn)動(dòng)后24 h 處死。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

各組小鼠處死后立即取出肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈血污，濾紙吸干，然后用勻漿介質(zhì)低溫勻漿制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)100 g/L 肝勻漿液，0 ～4 ℃下，5 000 r/min離心25 min，取上清液，-20 ℃保存，待測(cè)。同時(shí)，迅速取肝組織1 mm ×1 mm ×1 mm 左右大小分別放置磷酸緩沖液配制的體積分?jǐn)?shù)3%戊二醛固定液中，進(jìn)行電鏡樣品的前固定。

肝組織勻漿SOD、GSH-Px 活性、T-AOC、MDA含量的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。透射電鏡制樣及觀察:樣品用體積分?jǐn)?shù)3%戊二醛固定液固定2 h 以上，磷酸緩沖液漂洗3 次(10 min/次)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 g/L 的鋨酸固定1.5 h，磷酸緩沖液漂洗3 次(10 min/次)，500，700，800，900，1 000 g/L 乙醇梯度脫水(10 min/次)，1 000 g/L 丙酮脫水2 次(10 min/次)，1 000 g/L 丙酮與EPON-812 環(huán)氧樹(shù)脂混合液浸透，EPON-812 環(huán)氧樹(shù)脂包埋，35 ℃、45 ℃、65 ℃聚合，半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡下定位，超薄切片，枸櫞酸鉛和飽和醋酸鈾雙染，JEOL-1230 透射電子顯微鏡觀察、拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)(x-)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，進(jìn)行單因素方差分析。以P ＜0.05 為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠游泳至力竭時(shí)間對(duì)比

運(yùn)動(dòng)對(duì)照組小鼠游泳至力竭時(shí)間平均為(193.45 ±8.69)min，運(yùn)動(dòng)給藥組小鼠游泳至力竭時(shí)間平均為(263.37 ±19.45)min，給藥組小鼠游泳至力竭時(shí)間比對(duì)照組延長(zhǎng)36.14%。

2.2 各組小鼠肝組織MDA、SOD、GSH-Px 和TAOC 活性對(duì)比

在安靜狀態(tài)下，給藥組(E)與對(duì)照組(C)對(duì)比，肝組織MDA 含量降低，肝組織GSH-Px、SOD 活性和TAOC 升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。運(yùn)動(dòng)后即刻，小鼠肝組織MDA 含量、SOD、GSH-Px 和T-AOC 的活性都高于安靜組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);TE0組與TC0組對(duì)比，小鼠肝組織MDA 含量下降，GSH-Px、SOD 和T-AOC 升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)24 h 組，大部分指標(biāo)值有所下降，但仍沒(méi)有恢復(fù)到安靜時(shí)水平;TE24組小鼠肝組織SOD、GSH-Px 活性和T-AOC 恢復(fù)的程度、MDA 下降的程度均高于TC24組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠肝組織MDA、SOD、GSH-Px 和T-AOC 活性對(duì)比 n=10±s

表2 各組小鼠肝組織MDA、SOD、GSH-Px 和T-AOC 活性對(duì)比 n=10±s

注:與C 組對(duì)比，* P ＜0.05;與TC0 組對(duì)比，# P ＜0.05;與TC24 組對(duì)比，△P ＜0.05。

組 別 MDA/(nmol·mgprot -1) SOD/(U·mgprot -1) GSH-Px/(U·mgprot -1) T-AOC/(U·mgprot -1)安靜組 對(duì)照組(C) 7.11±0.17 89.82±1.33 536.62±22.50 6.65±0.15給藥組(E) 6.75±0.08* 94.62±2.11* 649.35±24.21* 8.63±0.19*運(yùn)動(dòng)后即刻組 對(duì)照組(TC0) 14.22±0.15* 118.97±2.05* 736.41±29.80* 12.42±0.21*給藥組(TE0) 12.71±0.21# 131.37±4.65# 854.09±27.11# 16.91±0.20#b運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)24 h 組 對(duì)照組(TC24) 9.05±0.23* # 92.22±1.83# 661.65±28.29* # 11.33±0.38* #給藥組(TE24) 8.40±0.12△ 115.88±2.16△ 780.12±36.97△ 14.57±0.23△

2.3 各組小鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)對(duì)比

透射電子顯微鏡下:C 組、E 組肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)基本正常。TC0組超微結(jié)構(gòu)損傷最重，以肝細(xì)胞細(xì)胞器腫脹、溶解、消失，以及肝血竇血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹為主要超微結(jié)構(gòu)改變。TE0組小鼠肝組織橫切面的上述結(jié)構(gòu)變化基本與TC0組相似，只是程度明顯減輕。TC24組肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷輕于TC0組，尤其是肝細(xì)胞胞質(zhì)細(xì)胞器腫脹程度輕于TC0組。TE0與TE24相比后者超微結(jié)構(gòu)損傷輕與前者，但未完全恢復(fù)正常水平。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(5 000 ×)

3 討 論

根據(jù)運(yùn)動(dòng)性疲勞的相關(guān)癥狀，中醫(yī)學(xué)可將其歸于“虛勞”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為:該病多與臟腑功能失調(diào)有關(guān);各種內(nèi)外病因均可導(dǎo)致五臟功能失調(diào)，繼而發(fā)為本病。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為:“肝主藏血、主疏泄、主筋，肝氣易于郁結(jié)，以條達(dá)為順為貴”?！端貑?wèn)·痿論》曰:“肝主身之筋膜?！薄饵S帝內(nèi)經(jīng)·素問(wèn)》指出:“動(dòng)作勞甚謂之罷，肝主筋。”《類經(jīng)·卷三》言:“人之運(yùn)動(dòng)，由乎筋力，運(yùn)動(dòng)過(guò)勞，筋必罷極?！爆F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為:肝臟是體內(nèi)重要貯血器官之一，與血液循環(huán)系統(tǒng)的功能有關(guān)。由于肝有貯藏血液精華和調(diào)節(jié)血量作用，所以人體臟腑組織(包括肌肉)各方面的活動(dòng)，都與肝有密切關(guān)系。隨著活動(dòng)量增加，機(jī)體對(duì)血液的需要量也增加，并由肝為之調(diào)節(jié)。血液充盛，則經(jīng)脈流通，筋骨強(qiáng)勁，關(guān)節(jié)活動(dòng)靈活。此外，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“久行傷筋”，而筋又主于肝。因此，長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)對(duì)肝臟會(huì)造成一定的影響。

自1978 年Dillard 將自由基理論引入運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)以來(lái)，大量的研究和試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，高強(qiáng)度或長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致人或動(dòng)物的自由基代謝增強(qiáng)［6-7］。肝臟是機(jī)體物質(zhì)代謝的重要器官，其中的自由基代謝及抗氧化酶變化較為明顯。肝臟和骨骼肌線粒體呼吸鏈電子傳遞中電子漏形成的超氧自由基是運(yùn)動(dòng)性內(nèi)源自由基的主要來(lái)源。氧自由基生成增多，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，構(gòu)成了對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的一系列損害。例如:細(xì)胞膜流動(dòng)性、完整性和通透性的下降;線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損傷，繼而影響電子的傳遞和偶聯(lián)磷酸化的進(jìn)行;電子漏引起質(zhì)子漏，影響線粒體電子的傳遞和氧化磷酸化的進(jìn)行等［8-9］。

MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物，是造成細(xì)胞膜損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷程度。耐力運(yùn)動(dòng)后機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化較安靜時(shí)加強(qiáng)，MDA 含量升高［10-11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此一致。生物體內(nèi)有產(chǎn)生自由基的體系，也有清除自由基的體系。目前研究得較為清楚的自由基清除體系有酶促與非酶促兩個(gè)體系。酶促系統(tǒng)的酶存在于生物體內(nèi)，是最有效、最專一的自由基清除體系，主要有GSH-PX和SOD。GSH-PX是體內(nèi)催化H2O2分解的重要酶，它特異催化GSH 對(duì)H2O2的還原反應(yīng)，而且可以使脂質(zhì)過(guò)氧化物變成無(wú)毒的羥化物，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。SOD 則是機(jī)體直接清除自由基的抗氧化酶，可以分解H2O2和脂質(zhì)過(guò)氧化物，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷［12］。體內(nèi)SOD、GSH-PX的協(xié)同作用可特異地清除運(yùn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量自由基，有效地阻止脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)肝臟組織免受過(guò)度損傷。在本實(shí)驗(yàn)中，灌服6 周敦煌固本方的小鼠肝組織的脂質(zhì)過(guò)氧化水平明顯下降，抗氧化酶SOD、GSH-PX活性顯著升高，這可能是敦煌固本方抗疲勞的機(jī)制之一。

機(jī)體防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在著密切聯(lián)系。影響防御體系的因素很多，如饑餓、碳水化合物供應(yīng)不足、微量元素的吸收量、激素水平等，而過(guò)度疲勞也是一個(gè)重要的影響因素。抗氧化能力水平對(duì)反映機(jī)體的健康狀況具有重要的意義。因此，本實(shí)驗(yàn)從這一角度出發(fā)，觀察敦煌固本方對(duì)小鼠肝組織總抗氧化能力的影響。在本實(shí)驗(yàn)中，灌服敦煌固本方各組小鼠總抗氧化能力顯著高于相應(yīng)對(duì)照組，說(shuō)明敦煌固本方在維護(hù)機(jī)體健康，提高機(jī)體的防御體系，進(jìn)而防止運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體損傷方面有良好的效果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:力竭運(yùn)動(dòng)使自由基異常增多，引起肝組織超微結(jié)構(gòu)的損傷，使線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器被過(guò)度消耗而溶解、斷裂，糖原顆粒大量消耗，肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡化。肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷在灌服敦煌固本方后明顯減輕。運(yùn)動(dòng)恢復(fù)24 h 后，肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷有所恢復(fù)，但灌服敦煌固本方組小鼠恢復(fù)效果優(yōu)于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了敦煌固本方有抗自由基氧化功能，且對(duì)肝細(xì)胞線粒體、高爾基體等超微結(jié)構(gòu)的損傷具有保護(hù)效果。電鏡檢查結(jié)果與生化檢查結(jié)果可相互印證。

綜上所述，敦煌固本方可顯著提高小鼠運(yùn)動(dòng)能力，這與該方能提高肝組織抗自由基氧化的功能，同時(shí)，還對(duì)運(yùn)動(dòng)造成的肝組織超微結(jié)構(gòu)的損傷有明顯的保護(hù)作用有關(guān)。此為敦煌固本方的深度開(kāi)發(fā)、利用提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。

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