柳中洋，齊瑩，郭鑫，蔣樹(shù)娟，黃郁晶，邵耀中，阮強(qiáng)

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒研究室，沈陽(yáng)110004）

·論著·

人巨細(xì)胞病毒微小RNA miR?UL70?5P靶向抑制人即刻早期反應(yīng)蛋白3的表達(dá)

柳中洋，齊瑩，郭鑫，蔣樹(shù)娟，黃郁晶，邵耀中，阮強(qiáng)

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒研究室，沈陽(yáng)110004）

目的尋找人巨細(xì)胞病毒微小RNA miR?UL70?5P調(diào)控的靶mRNA，檢測(cè)miR?UL70?5P對(duì)靶mRNA蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。方法采用Hybrid?PCR方法從人巨細(xì)胞病毒感染的人胚肺成纖維細(xì)胞總RNA中篩選候選靶mRNA；采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR?UL70?5p與候選靶mRNA的結(jié)合能力；采用Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR?UL70?5P對(duì)部分靶mRNA蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果篩選并鑒定了人即刻早期反應(yīng)蛋白3（IER3）等7種靶mRNA可與miR?UL70?5P特異性結(jié)合；在293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的IER3可以被轉(zhuǎn)染的miR?UL70?5P下調(diào)30%。結(jié)論人巨細(xì)胞病毒表達(dá)的miR?UL70?5P在病毒感染宿主過(guò)程中具備抑制IER3蛋白質(zhì)表達(dá)的能力。

人巨細(xì)胞病毒；微小RNAs；人即刻早期反應(yīng)蛋白3

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一類長(zhǎng)度為22個(gè)堿基的核糖核酸，雖然不能夠翻譯表達(dá)蛋白質(zhì)，但可以通過(guò)與信使RNA反向互補(bǔ)結(jié)合，阻礙其翻譯過(guò)程［1］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)miRNAs在生命活動(dòng)的各個(gè)方面發(fā)揮著精細(xì)的調(diào)節(jié)作用［2］。miRNAs在病毒中也有表達(dá)。人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是人群感染率高達(dá)90%以上的DNA病毒。依據(jù)miRBase提供的資料，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HCMV表達(dá)包括miR?UL70?5P在內(nèi)的26種miRNAs。但是，miR?UL70?5P的生物學(xué)功能目前尚不清楚。本研究擬尋找HCMV miR?UL70?5P調(diào)控的靶mRNA，檢測(cè)miR?UL70?5P對(duì)靶mRNA蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

HCMV H株（本實(shí)驗(yàn)室保存的臨床分離株）；人胚肺成纖維細(xì)胞（human embryonic lung fibroblasts，HELF）（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所）。pcr2.1載體（invi?trogen公司，美國(guó)）；Top10感受態(tài)細(xì)菌（北京天根生化科技有限公司）；熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（appliedbio?systems公司，美國(guó)）；熒光素酶活性檢測(cè)試劑（Pro?mega公司，美國(guó)）；pBI?CMV2（Clontech公司，美國(guó)）；蛋白質(zhì)提取和檢測(cè)試劑（Thermo公司，美國(guó)）；抗體（Abcam公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 使用hybrid?PCR篩選miR?UL70?5P的候選靶mRNA：用含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)HELF，密度為100%時(shí)接種HCMV H株。部分細(xì)胞在接種病毒前1 h用終濃度為100 μg/mL的放線菌酮處理，接毒后24 h使用Trizol法提取HCMV感染即刻早期（IE）總RNA；未經(jīng)過(guò)放線菌酮處理的細(xì)胞在接毒后72 h，用Trizol法提取HCMV感染晚期（L）總RNA。使用TaKaRa公司的3′Full RACE試劑盒中的oligodT引物及逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)并使用miR?UL70?5P的反向互補(bǔ)序列“TCTGGRCGRG?GCCGRGRCGC（R=A/G）”作為上游引物，oligodT引入的通用引物“ACCGTCGTTCCACTAGTGATTT”作為下游引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由北京invitrogen公司合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后（A9280，Promega公司，美國(guó)），用TA克隆的方法連接到pcr2.1載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)NCBI的blast軟件比對(duì)得到同源mRNA序列，作為備選的靶mRNA。

1.2.2 熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR?UL70?5P與候選靶mRNA的結(jié)合能力：使用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法擴(kuò)增候選靶mRNA與miR?UL70?5p結(jié)合位點(diǎn)附近約300～500 bp左右的序列。在擴(kuò)增引物的5′末端分別加入了BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)序列。純化PCR產(chǎn)物，進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切。將酶切產(chǎn)物連接到pMIR report載體上熒光素酶基因的3′非翻譯區(qū)（3′UTR區(qū)）的相應(yīng)位點(diǎn)，得到“pMIR?靶mRNA”表達(dá)載體。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)293T細(xì)胞，采用lip2000共轉(zhuǎn)染pMIR?靶mRNA、海腎熒光素酶質(zhì)粒（TK）以及miR?UL70?5P的成熟體（銳博公司，廣州）到293T細(xì)胞。每個(gè)候選靶mRNA做3個(gè)復(fù)孔。使用線蟲(chóng)的一種非特異性靶向miRNA作為陰性對(duì)照。使用pMIR空載體作為系統(tǒng)誤差對(duì)照。貼壁細(xì)胞通過(guò)裂解釋放熒光素酶（Dual?Luciferase? Reporter Assay E1960，Promega公司，美國(guó)），進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)（LB9507，Berthhold Technologies公司，德國(guó)）。先檢測(cè)每一樣本的螢火蟲(chóng)熒光素酶熒光強(qiáng)度，后檢測(cè)海腎熒光素酶熒光強(qiáng)度。用“螢火蟲(chóng)熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值”得到消除了組內(nèi)轉(zhuǎn)染誤差的終數(shù)據(jù)。以每個(gè)樣本的3個(gè)復(fù)孔所測(cè)終數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2.3 Western blot分析miR?UL70?5P對(duì)候選靶mRNA蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)控作用：根據(jù)與HCMV感染相關(guān)性及實(shí)驗(yàn)可行性，選取人即刻早期反應(yīng)蛋白3（immediate early response 3，IER3）進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)分析。將IER3mRNA全序列構(gòu)建到pBI?CMV2蛋白質(zhì)表達(dá)載體中，得到pBI?CMV2?IER3表達(dá)載體。共轉(zhuǎn)染pBI?CMV2?IER3和miR?UL70?5P成熟體至293T細(xì)胞中。使用線蟲(chóng)的一種非特異性靶向miRNA成熟體作為miRNA陰性對(duì)照，使用pBI?CMV2自身表達(dá)的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作為組內(nèi)對(duì)照消除轉(zhuǎn)染誤差。轉(zhuǎn)染24 h后收集蛋白質(zhì)（M?PER?Mammalian Protein Extrac?tion Reagent，PIERCE公司，美國(guó)）進(jìn)行Western blot檢測(cè)。依次使用兔源多克隆抗體（Abcam公司，英國(guó)）和山羊抗兔的二抗（中杉金橋公司，北京）進(jìn)行反應(yīng)。使用ChemiDoc?MP System（Biorad，美國(guó)）進(jìn)行成像，使用儀器配套軟件image lab進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果灰度分析處理。

2 結(jié)果

2.1 Hybrid?PCR篩選結(jié)果（表1）

表1 Hybrid?PCR篩選獲得的HCMV miR?UL70?5P候選靶mRNAsTab.1 Candidate target mRNAs of HCMV miR?UL70?5p obtained by Hybrid?PCR screening

共篩選獲得10種miR?UL70?5P的候選靶mRNA序列，8種來(lái)源于宿主細(xì)胞，2種來(lái)源于HCMV。其中，NQO2是一種黃素蛋白，功能是催化氧化還原反應(yīng)；PP150是HCMV重要的衣殼蛋白，具有免疫原性，可引起宿主的體液免疫應(yīng)答；核糖體蛋白L35構(gòu)成核糖體亞基，參與蛋白質(zhì)的合成；HCMV UL70是DNA復(fù)制引發(fā)酶，與HCMV的基因組復(fù)制有關(guān)；IER3是即刻早期反應(yīng)蛋白，在輻射、感染等條件下迅速提高表達(dá)量，參與應(yīng)激反應(yīng)，并參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。這些靶基因涉及到細(xì)胞凋亡、HCMV感染與復(fù)制、細(xì)胞能量代謝、生物大分子合成等。

2.2 熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

miR?UL70?5P的轉(zhuǎn)染未造成PMIR空質(zhì)粒螢火蟲(chóng)熒光素?zé)晒鈴?qiáng)度發(fā)生明顯改變（圖1）。除RO?MO1外，含有其它候選靶mRNA 3′UTR序列質(zhì)粒的相對(duì)熒光值均表現(xiàn)為下調(diào)，說(shuō)明候選靶mRNA與miR?UL70?5P確實(shí)存在結(jié)合關(guān)系。

圖1 熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Result of Luciferase assay

2.3 Western blot結(jié)果

與作為miRNA參照的線蟲(chóng)miRNA成熟體作用效果相比，載體內(nèi)參照蛋白GFP的表達(dá)沒(méi)有受到轉(zhuǎn)染的miR?UL70?5P的影響；而載體中IER3的蛋白質(zhì)表達(dá)量被miR?UL70?5P下調(diào)了36.4%（圖2）。

圖2 免疫印跡結(jié)果Fig.2 Result of Western blot

3 討論

HCMV的miRNA編碼區(qū)分散于病毒整個(gè)基因組中。已經(jīng)進(jìn)行功能研究的miRNA包括miR?UL112［3～7］、miR?UL148D［8］、miR?US4?5P［9］、miR?US5?1［10］、miR?US5?2［10］、miR?US25?1［11］、miR?US25?2?3P［12］和miR?US33［13］等。它們的主要功能在于影響病毒復(fù)制，為病毒建立免疫逃避和潛伏感染狀態(tài)創(chuàng)造有利條件。

Hybrid?PCR方法是本課題組建立的篩選miRNA靶mRNA的研究方法［14］，具有快速、靈活等優(yōu)點(diǎn)。用此方法可以對(duì)特定組織細(xì)胞、特定時(shí)間的mRNA樣本進(jìn)行篩選。本研究中，對(duì)HCMV感染HELF細(xì)胞的即刻早期及晚期RNA進(jìn)行了miR?UL70?5P候選靶mRNA的篩選，得到的靶mRNA來(lái)源包括宿主和病毒自身基因組，靶mRNA編碼蛋白質(zhì)的功能涉及到能量代謝、細(xì)胞凋亡、病毒復(fù)制、病毒衣殼形成等各個(gè)方面，提示miR?UL70?5P可能通過(guò)以上相關(guān)機(jī)制影響病毒的感染狀態(tài)。

本研究只對(duì)HELF中miR?UL70?5p的靶mRNA進(jìn)行了檢測(cè)。因?yàn)榻M織分化的原因，某些蛋白質(zhì)在肺組織中并不表達(dá)，所以本研究結(jié)果只能反映肺組織受到HCMV感染時(shí)miR?UL70?5P與宿主及病毒自身基因相互作用的情況。在HCMV敏感的其它組織細(xì)胞中進(jìn)行hybrid?PCR的篩選，將有利于揭示miR?UL70?5P在特定組織細(xì)胞中對(duì)HCMV感染調(diào)控的機(jī)理。

本研究對(duì)初篩得到的所有10個(gè)候選靶mRNA進(jìn)行了熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。不同的靶mRNA與miR?UL70?5p的結(jié)合能力并不相同。一般來(lái)說(shuō)，miRNA與靶mRNA結(jié)合的自由能越高，miRNA發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的作用越顯著，但是mRNA的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的空間占位效應(yīng)可能會(huì)隱蔽起miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致篩選得到的部分候選靶mRNA的3′UTR沒(méi)有對(duì)熒光素酶表達(dá)產(chǎn)生影響。熒光素酶實(shí)驗(yàn)只可以驗(yàn)證miRNA與相應(yīng)mRNA靶位點(diǎn)之間的結(jié)合性，并不能反映其與完整靶mRNA發(fā)生的相互作用。使用Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證miRNA對(duì)靶mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用十分必要。

靶mRNA IER3編碼產(chǎn)物是一種即刻早期反應(yīng)蛋白質(zhì)，在感染、輻射、缺血等應(yīng)激狀態(tài)下，表達(dá)值可以在15 min內(nèi)迅速升高。研究發(fā)現(xiàn)，IER3蛋白在凋亡—抗凋亡過(guò)程中發(fā)揮雙向作用。在培養(yǎng)條件惡劣的情況下，高表達(dá)的IER3可促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生；而在培養(yǎng)條件優(yōu)越的情況下，IER3則可抑制凋亡［15］。本研究通過(guò)Western blot方法證實(shí)了miR?UL70?5P對(duì)IER3蛋白質(zhì)表達(dá)具有明顯的抑制作用。推測(cè)在HCMV感染肺組織過(guò)程中，miR?UL70?5P可能通過(guò)抑制病毒感染引起的IER3蛋白質(zhì)表達(dá)來(lái)阻礙其誘導(dǎo)感染細(xì)胞的調(diào)亡，創(chuàng)造有利于病毒復(fù)制的微環(huán)境，從而確保病毒在宿主體內(nèi)生存。

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（編輯 王又冬）

Human Cytomegalovirus microRNA miR?UL70?5P Suppresses the Expression of Immediate Early Response 3

LIU Zhong?yang，QI Ying，GUO Xin，JIANG Shu?juan，HUANG Yu?jing，SHAO Yao?zhong，RUAN Qiang
（Virus Laboratory，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo find the target message RNAs（mRNAs）of human cytomegalovirus（HCMV）microRNA（miRNA）miR?UL70?5P，and to detect regulation effects of miR?UL70?5p on protein expression of these target mRNAs.MethodsHybrid?PCR was used to screen the poten?tial target mRNAs in the pool of human embryo lung fibroblast（HELF）total RNAs.Luciferase report assay was used to identify the specific banding of miR?UL70?5P to the target mRNAs.Western blot was performed to validate the regulation effects of miR?UL70?5P on the protein expression of the target mRNAs.ResultsSeven mRNAs，including immediate early response 3（IER3），were identified as the targets of miR?UL70?5P.Over?ex?pressed IER3 in 293T cells could be down?regulated up to 30%by co?transfection of miR?UL70?5P.ConclusionHCMV miR?UL70?5p can sup?press the protein expression of its target mRNA，IER3，during infection.

cytomegalovirus；microRNAs；immediate early response 3

R373.9

A

0258-4646（2014）07-0577-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81171580）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20112104110012）

柳中洋（1985-），男，研究實(shí)習(xí)員，碩士.

阮強(qiáng)，E-mail：ruanq@sj?hospital.org

2014-04-14

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：