王波，汲坤，張麗艷，尚德志，李璞宸，劉璐璐

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院病理科，內(nèi)蒙古民族大學(xué)分子病理學(xué)研究所，內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古牙克石022150；2.沈陽醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽110034；3.沈陽醫(yī)學(xué)院頜面外科，沈陽110034；4.沈陽醫(yī)學(xué)院2011級(jí)醫(yī)學(xué)影像學(xué)，沈陽110034）

高鋅抑制鼠前列腺癌細(xì)胞RM?1侵襲與誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

王波1，汲坤2，張麗艷2，尚德志3，李璞宸4，劉璐璐4

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院病理科，內(nèi)蒙古民族大學(xué)分子病理學(xué)研究所，內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古牙克石022150；2.沈陽醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽110034；3.沈陽醫(yī)學(xué)院頜面外科，沈陽110034；4.沈陽醫(yī)學(xué)院2011級(jí)醫(yī)學(xué)影像學(xué)，沈陽110034）

目的探討鋅對(duì)鼠前列腺癌細(xì)胞RM?1侵襲能力和凋亡的影響。方法將RM?1細(xì)胞培養(yǎng)于含Zn2+的培養(yǎng)基中，Zn2+終濃度分別為0 μmol/L（control）、100 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L、300 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，MTT檢測(cè)鋅對(duì)RM?1細(xì)胞增殖的影響；RT?PCR檢測(cè)腫瘤侵襲和凋亡相關(guān)基因mmp?2、mmp?9、bax和bcl?2mRNA表達(dá)。結(jié)果MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，不同濃度鋅對(duì)RM?1細(xì)胞增殖抑制率明顯增加（P＜0.05）；與100 μmol/L組、200 μmol/L組比較，250 μmol/L組、300 μmol/L組細(xì)胞增殖抑制率明顯增加（P＜0.01）。RT?PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，250 μmol/L、300 μmol/L組mmp?2和mmp?9mRNA及bcl?2mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；baxmRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。結(jié)論高鋅可以降低RM?1細(xì)胞的增殖和侵襲能力，誘導(dǎo)RM?1細(xì)胞的凋亡。

鋅；前列腺癌；基質(zhì)金屬蛋白酶；凋亡

前列腺癌（prostate carcinoma，PCa）是男性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)［1］。正常人前列腺組織中鋅的含量遠(yuǎn)較其他組織高，前列腺癌組織中鋅的濃度明顯低于正常前列腺組織和前列腺增生組織［2］。在前列腺癌篩查中，鋅可作為輔助診斷的指標(biāo)之一［3］。目前鋅在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到關(guān)注，但具體的作用機(jī)制還不明確。本研究應(yīng)用鋅作用于鼠前列腺癌RM?1細(xì)胞株，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力以及凋亡的影響，為深入研究鋅在前列腺癌及前列腺癌發(fā)病相關(guān)基因中的作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠前列腺癌細(xì)胞株RM?1購自上海細(xì)胞所。IMDM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自Hyclone公司，胎牛血清和Trizol購自Invitrogen公司，MTT和DMSO購自Sigma公司，M?MuLV和dNTP購自Promega公司。TaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司，ZnSO4·7H2O為國產(chǎn)AR級(jí)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠前列腺癌細(xì)胞株RM?1培養(yǎng)于含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中，置于5%的CO2、37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長達(dá)到80%融合時(shí)，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化，傳代，更換新鮮的含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，傳代比率為1∶2或1∶3。

1.2.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力：取對(duì)數(shù)生長期的RM?1細(xì)胞，以每孔4×104細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積200 μL，放入培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每組加入含不同濃度Zn2+培養(yǎng)液200 μL。每組6復(fù)孔，鋅的終濃度分別為0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L、300 μmol/L，培養(yǎng)20 h后每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，出現(xiàn)藍(lán)色結(jié)晶后棄孔內(nèi)液體，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長570 nm時(shí)各孔的吸光度值，每組6孔數(shù)據(jù)取平均值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組光密度值/對(duì)照組光密度值×100%

1.2.3 RT?PCR檢測(cè)RM?1細(xì)胞中mmp?2、mmp?9、bax和bcl?2mRNA的表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長期的RM?1細(xì)胞，Zn2+分為0 μmol/L、250 μmol/L、300 μmol/L 3組，于作用24 h后收集細(xì)胞。加入Trizol抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，分別用mmp?2、mmp?9、bax、bcl?2及GAPDH的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，采用天能凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列如表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 The sequence of primers for PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度鋅對(duì)RM?1細(xì)胞增殖活力的影響

MTT結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，100 μmol/L Zn2+作用后RM?1細(xì)胞增殖抑制率增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，200 μmol/L、250 μmol/L、300 μmol/L作用后RM?1細(xì)胞增殖抑制率明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與100 μmol/L、200 μmol/L Zn2+組比較，250 μmol/L、300 μmol/L Zn2+作用后RM?1細(xì)胞增殖抑制率明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表2 MTT法檢測(cè)不同劑量鋅對(duì)RM?1細(xì)胞增殖的影響（n=6± s）Tab.2 The survival rate of RM?1 cells after treated with different concentration of zinc（n=6±s）

表2 MTT法檢測(cè)不同劑量鋅對(duì)RM?1細(xì)胞增殖的影響（n=6± s）Tab.2 The survival rate of RM?1 cells after treated with different concentration of zinc（n=6±s）

1）P＜0.05；2）P＜0.01 vs control group.3）P＜0.01 vs 100 μmol/L and 200 μmol/L Zn2+group.

?

2.2 鋅作用后RM?1細(xì)胞中腫瘤侵襲相關(guān)基因mmp?2和mmp?9mRNA表達(dá)的變化

與對(duì)照組比較，250 μmol/L、300 μmol/L Zn2+作用后RM?1細(xì)胞中mmp?2和mmp?9mRNA的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1和表3。

圖1 鋅作用后RM?1細(xì)胞中mmp?2和mmp?9mRNA的表達(dá)Fig.1 The expression of mmp?2 and mmp?9 mRNA in RM?1 cells after zinc treatment

2.3 鋅作用后RM?1細(xì)胞中腫瘤凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl?2mRNA的表達(dá)的變化

表3 各組RM?1細(xì)胞中mmp?2和mmp?9mRNA的表達(dá)水平（n= 3Tab.3 The expression levels of mmp?2 and mmp?9 mRNA in RM?1 cells of different groups（n=3

表3 各組RM?1細(xì)胞中mmp?2和mmp?9mRNA的表達(dá)水平（n= 3Tab.3 The expression levels of mmp?2 and mmp?9 mRNA in RM?1 cells of different groups（n=3

1）P＜0.01 vs control group.

與對(duì)照組比較，250 μmol/L、300 μmol/L Zn2+作用后RM?1細(xì)胞中BaxmRNA表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與對(duì)照組比較，250 μmol/L、300 μmol/L Zn2+作用后RM?1細(xì)胞中Bcl?2mRNA表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2和表4。

圖2 鋅作用后RM?1細(xì)胞中Bax和Bcl?2mRNA的表達(dá)水平Fig.2 The expression of Bax and Bcl?2mRNA in RM?1 cells after zinc treatment

表4 各組RM?1細(xì)胞中Bax和Bcl?2mRNA的表達(dá)水平（n=3，Tab.4 The expression levels of Bax and Bcl?2 mRNA in RM?1 cells of different groups（n=3

表4 各組RM?1細(xì)胞中Bax和Bcl?2mRNA的表達(dá)水平（n=3，Tab.4 The expression levels of Bax and Bcl?2 mRNA in RM?1 cells of different groups（n=3

1）P＜0.01 vs control group

3 討論

在美國前列腺癌占男性惡性腫瘤的首位，死亡率居第二位［4］。在中國近年來也呈逐年上升趨勢(shì)，上海市市區(qū)前列腺癌發(fā)病率1989年至2009年20年間前列腺癌發(fā)病率增長10余倍；北京市前列腺癌發(fā)病率由2001年的5.53/10萬上升至2010年的16.62/ 10萬；吉林大學(xué)前列腺疾病防治中心進(jìn)行的長春50歲以上男性前列腺癌集團(tuán)篩查也證實(shí)前列腺癌發(fā)病率的上升趨勢(shì)［5］。

鋅是人體必需的微量元素，參與人體內(nèi)多種酶的構(gòu)成，在核酸代謝、細(xì)胞復(fù)制、免疫活性、組織修復(fù)和生長方面起重要作用。流行病學(xué)調(diào)查顯示，前列腺癌與組織內(nèi)低鋅含量密切相關(guān)［6，7］，前列腺組織低鋅含量與PSA生化復(fù)發(fā)密切相關(guān)［8］。在前列腺癌診斷后，經(jīng)過中位周期6.4年的觀察，高鋅飲食攝入可以降低前列腺癌特異死亡率，但是與鋅有關(guān)的前列腺癌生存期延長的機(jī)制不明［9］。另有研究發(fā)現(xiàn)血清鋅含量在前列腺癌治療前后明顯不同。

侵襲與轉(zhuǎn)移是前列腺癌患者的致死原因之一，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能與其產(chǎn)生MMPs的能力密切相關(guān)。MMPs特別是mmp?2和mmp9的表達(dá)升高與前列腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)侵襲密切相關(guān)。在前列腺癌動(dòng)物模型中應(yīng)用MMPs合成抑制劑，可以減少腫瘤的生長和延長動(dòng)物的生存時(shí)間［10］。另有研究表明鋅可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的壞死和凋亡［11］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT檢測(cè)鋅作用后前列腺癌細(xì)胞的增殖活性結(jié)果表明鋅明顯抑制了前列腺癌細(xì)胞的增殖活性。RT?PCR結(jié)果顯示，鋅明顯抑制了腫瘤侵襲相關(guān)基因mmp?2和mmp?9mRNA的表達(dá)；鋅增強(qiáng)了凋亡相關(guān)基因Bax的表達(dá)，抑制了Bcl?2的表達(dá)。上述結(jié)果表明鋅可以抑制前列腺癌的增殖和侵襲以及誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡。因此只有理解鋅抗腫瘤的基礎(chǔ)機(jī)制后，才能正確和有效的將其運(yùn)用到腫瘤的治療中。我們將在后期研究中進(jìn)一步明確鋅在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為最終通過鋅制劑的干預(yù)來預(yù)防早期前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及減少手術(shù)后的前列腺癌患者復(fù)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（編輯 裘孝琦）

Zinc Inhibits Invasion and Induces Apoptosis of RM?1 Cells in vitro

WANG Bo1，JI Kun2，ZHANG Li?yan2，Shang De?zhi3，LI Pu?chen4，LIU Lu?lu4
（1.Department of Pathology，The Second Clinical Medical School of Inner Mongolia University for the Nationalities；Molecular Pathological Research Institute of Inner Mongolia University for Nationalities；Department of Pathology，Inner Mongolia Forestry General Hospital，Yakeshi 022150，China；2.Department of Pathophysiology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；3.Department of Maxillofacial Surgery，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；4.Grade 2011 medicalimaging，Shenyang MedicalCollege，Shenyang110034，China）

ObjectiveTo investigate the effects of zinc on the invasion and apoptosis of RM?1 cells.MethodsThe RM?1 cells were exposed to differentconcentration ofzinc for24 h.MTT was used to detectthe proliferation rate ofRM?1cells.RT?PCRwas used to detectthe mRNA expression of invasion and apoptosis?related genes includingmmp?2，mmp?9，baxandbcl?2.ResultsCompared with control group，the proliferation rates of RM?1 cells in different concentration of zinc groups were lower（P＜0.05）.Compared with 100 μmol/L and 200 μmol/L groups，the proliferation rates of RM?1 cells in 250 μmol/L and 300 μmol/L groups were significantly inhibited（P＜0.01）.Compared with control group，the expression ofmmp?2，mmp?9andbcl?2mRNAs were decreased and the expression ofbaxmRNA was significantly increased in 250 μmol/L and 300 μmol/L groups（P＜0.01）.ConclusionZinc can inhibit proliferation and invasion，and induce apoptosis of RM?1 cells.

zinc；prostate cancer；matrix metalloproteinase；apoptosis

R73

A

0258-4646（2014）07-0589-03

國家自然科學(xué)基金（81260310）；遼寧省博士科研啟動(dòng)基金（20111126）；沈陽醫(yī)學(xué)院科技發(fā)展基金（20113069）

王波（1976-），男，副主任醫(yī)師，博士.

汲坤，E-mail：jikun0629@gmail.com

2014-05-22

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：