孫冰玉，劉琳琳，張 光，石彥國

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院/黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱 150076）

高溫高濕對大豆分離蛋白二級結(jié)構(gòu)及乳化性的影響*

孫冰玉，劉琳琳，張 光，石彥國**

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院/黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱 150076）

被廣泛應用于食品工業(yè)的大豆分離蛋白在貯運過程中，其功能特性可能會發(fā)生變化。研究采用不同包裝形式（100%氮氣鋁箔包裝、80%氮氣：20%二氧化碳鋁箔包裝、60%氮氣：40%二氧化碳鋁箔包裝、真空鋁箔包裝、實際工廠包裝：白板紙塑/HDPE和PE包裝）將大豆分離蛋白（SPI）包裝后在高溫高濕環(huán)境（RH 80%、30℃）條件下貯藏12個月。研究貯藏環(huán)境、時間、包裝條件對SPI的二級結(jié)構(gòu)及乳化性的影響。通過對酰胺Ⅰ帶1600～1700cm-1波段的圖譜進行分析發(fā)現(xiàn)，PE包裝中SPI的β-折疊與對照樣相比顯著下降（p＜0.05），通過對各包裝中SPI功能特性的比較得出包裝材質(zhì)對溫濕度的阻隔性：鋁箔包裝＞工廠包裝＞PE。通過相關(guān)性分析得出，大豆分離蛋白的乳化性與β-折疊含量呈負相關(guān)（-0.675）。

大豆分離蛋白；二級結(jié)構(gòu)；乳化性；儲藏

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是一種機能特性較強、應用很廣泛的蛋白質(zhì)。大豆分離蛋白除營養(yǎng)價值外，還具有許多重要的功能性質(zhì)，如起泡性、乳化性、溶解性、膠凝性等，這些特性可有效地改善食品的口感，增加食品的彈性、保水性、吸油性，提高貯存性等[1-2]。SPI以低溫變性脫脂大豆粉為原料，經(jīng)堿提酸沉等工序而制得，組分較為均一，蛋白質(zhì)純度要求在90%以上[3]。近年來國內(nèi)外對大豆分離蛋白組成和結(jié)構(gòu)的研究比較關(guān)注，因為蛋白的組成和結(jié)構(gòu)是影響功能特性的一個重要的因素。研究人員采用了X-射線衍射、近（遠）紫外、圓二色譜法[4-6]、DSC法[7-8]、熒光光譜分析[9-10]、傅立葉變換紅外光譜法[11]、電泳技術(shù)等技術(shù)手段來研究大豆蛋白的構(gòu)效關(guān)系。然而早期研究人員將改善大豆分離蛋白功能特性的焦點放在大豆育種及制取工藝上，而忽略了貯藏過程中環(huán)境等因素對功能特性的影響。關(guān)于SPI功能特性在不同貯藏條件（環(huán)境條件和包裝條件）中產(chǎn)生變化的研究國內(nèi)外尚少。蛋白質(zhì)在加工和貯藏過程中，SPI功能性質(zhì)除受蛋白制備條件和蛋白本身組成結(jié)構(gòu)影響外，同時也受環(huán)境因素的影響。然而隨著食品行業(yè)的發(fā)展，現(xiàn)代食品加工對大豆分離蛋白的功能特性要求越來越高，因此，對在不同貯藏條件（環(huán)境條件和包裝條件）下的SPI功能特性發(fā)生變化進行研究，對SPI的貯藏及應用具有現(xiàn)實的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白凝膠型：哈爾濱高科技大豆食品有限責任公司提供（蛋白質(zhì)含量87.12%，水分5.73%，脂肪0.82%，灰分4.91%，NSI值是68.62%）；鋁箔袋，PE拉鏈封口袋，復合袋（內(nèi)襯袋材質(zhì)：LDPE；外包裝袋材質(zhì)：白板紙塑）；氮氣、二氧化碳：市售；所用化學試劑均為分析純。

79-1磁力加熱攪拌器：江蘇金壇市中大儀器廠；KDN-F自動定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；DQS-700N呼吸式氣調(diào)包裝機：上海輕葩食品包裝機械有限公司；Anke TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 大豆分離蛋白的包裝

實際工廠包裝：使用哈爾濱高科技大豆食品有限責任公司提供的雙層包裝袋（外包裝袋：白板紙塑，內(nèi)襯袋：高壓低密度聚乙烯（HDPE）進行包裝[12-13]。氣調(diào)包裝：選擇4種氣體混合比例：a.真空；b.100%N2；c.80%N2：20%CO2；d.60%N2：40%CO2。使用DQS-700N呼吸式氣調(diào)包裝機抽真空后將預先混合的不同比例氣體充入鋁箔包裝袋內(nèi)，最后熱封封口。普通包裝：使用PE拉鏈封口袋包裝。

1.2.2 大豆分離蛋白的貯藏

經(jīng)包裝的大豆分離蛋白在5種環(huán)境條件下貯藏于高溫高濕環(huán)境（RH為80%，30℃）貯藏時間為5個月，以每30d為一個監(jiān)測周期。

1.2.3 7S/11S比值測定方法

采用SDS-PAGE方法，加樣量20μL，分離膠濃度12.5%，電流25mA。

1.2.4 二級結(jié)構(gòu)的測定方法

（1）圖譜采集取待測樣品1～2mg，采用溴化鉀壓片。加入變溫ATR中，到指定溫度后，平衡5min，以相同溫度下的1mL水作為背景，均用紅外光譜儀掃描，測定波段為400～4000cm-1，掃描次數(shù)為32次，室溫20℃。

（2）圖譜處理用PeakFit v4.12軟件對酰胺Ⅰ帶1600～1700cm-1波段的圖譜進行分析。先校正基線，然后用Gaussian去卷積。再由二階導數(shù)擬合，多次擬合使殘差最小。根據(jù)峰面積計算各二級結(jié)構(gòu)的比率。各子峰與二級結(jié)構(gòu)對應關(guān)系的指認為：1618～1640cm-1和1670～1690cm-1為β-折疊；1650～1660cm-1為α-螺旋；1640～1650cm-1為無規(guī)則卷曲；1660～1700cm-1為β-轉(zhuǎn)角[14]。

1.2.5 乳化性的測定方法

乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）采用濁度法測定[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫高濕環(huán)境對SPI二級結(jié)構(gòu)的影響

大豆分離蛋白在貯藏前的紅外光譜酰胺Ⅳ帶的擬合曲線如圖1所示，從圖中可以發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白在貯藏前結(jié)構(gòu)是以β-折疊為主的，如表1所示，其比例占到了46.36%，1648cm-1的峰被指認為無規(guī)則卷曲，所占的比例為22.79%，排在第二位；1660cm-1的峰為α-螺旋，含量為15.5%；所占比例最小的為轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，僅為9.29%。Fukushima對7S和11S球蛋白進行了研究[16]，發(fā)現(xiàn)2種球蛋白分子內(nèi)部的主要結(jié)構(gòu)是β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。由于大豆蛋白的主要成分是7S和11S球蛋白，所以研究的結(jié)果與Fukushima的結(jié)果基本吻合。

圖1 大豆分離蛋白貯藏前酰胺Ⅳ帶的擬合曲線

表1 大豆分離蛋白貯藏前酰胺Ⅳ帶

結(jié)合蛋白質(zhì)化學性質(zhì)，當?shù)鞍踪|(zhì)二級構(gòu)象發(fā)生變化時，主要是β-折疊結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表2為在高溫高濕條件下貯藏12月后大豆分離蛋白的二級構(gòu)象變化數(shù)據(jù)，同樣證實了β-折疊結(jié)構(gòu)變化是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的主要特征，因此在此后的分析中，以β-折疊結(jié)構(gòu)變化代替大豆分離蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化。

表2 高溫高濕環(huán)境下貯藏12月后大豆分離蛋白酰胺Ⅳ帶

圖2為高溫高濕條件下大豆分離蛋白β-折疊含量變化，由圖2結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間的延長，不同包裝條件下大豆分離蛋白的β-折疊均呈逐漸遞減的趨勢，在開始的一段時間內(nèi)，蛋白質(zhì)二級構(gòu)象的變化較緩，此后蛋白質(zhì)二級構(gòu)象的變化加快，到最后蛋白質(zhì)二級構(gòu)象變化再度變緩。

圖2 高溫高濕條件下大豆分離蛋白β-折疊含量變化

高溫高濕貯藏環(huán)境對大豆分離蛋白的二級構(gòu)象影響較大。由于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的形成幾乎全是由于肽鏈骨架中的羰基上的氧原子和亞胺基上的氫原子之間的氫鍵所維系，雖然其他的作用力如配位鍵、范德華力也有一定作用，但蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的決定因子是肽鏈間氫鍵，所以某一肽段或某些肽段間的氫鍵越多，所形成的二級結(jié)構(gòu)就越穩(wěn)定，即二級結(jié)構(gòu)的形成有一種協(xié)同的趨勢。在大豆分離蛋白二級結(jié)構(gòu)中，β-折疊占主要地位，β-折疊是肽鏈主鏈較伸展的一種有規(guī)則的構(gòu)象，相鄰平行的肽鏈之間的-NH和C=O形成氫鍵。順向平行的氫鍵間隔一致但交錯傾斜，反向平行的氫鍵間隔有疏有密，這就決定了在高溫高濕環(huán)境下，水分含量較高，溫度較高，熱反應加大，水分子容易介入肽鏈之間，使得R側(cè)基相互反應增多，破壞原有的氫鍵，而使β-折疊含量減小，蛋白質(zhì)二級構(gòu)象改變。

2.2 高溫高濕環(huán)境對SPI乳化性的影響

由圖3和4可知，在高溫高濕環(huán)境下貯藏時，6種包裝中SPI的乳化性隨貯藏時間延長而下降。在貯藏初期，充氣包裝中SPI的乳化性增加，且氮氣比例越小，EAI值越大，可能是氮氣破壞了氫鍵等次級鍵作用，使原先包含在分子內(nèi)部的疏水基團暴露出來，增加了SPI的親油性，從而表現(xiàn)為乳化能力增加。在非充氣包裝中，以真空包裝中SPI的乳化性下降幅度最緩慢，原因可能是真空鋁箔包裝的隔熱阻濕性能較好，降低了溫度和濕度對SPI的影響，延緩其變性速度，使其在短期內(nèi)能夠保持相對較好的乳化性；而PE包裝中SPI的乳化性下降速度最快。6種包裝中SPI的乳化穩(wěn)定性總體上呈現(xiàn)下降的趨勢，其中以60%N2：40%CO2充氣鋁箔包裝中SPI的乳化穩(wěn)定性最相對保持較好，且在貯藏1月后ESI出現(xiàn)最高值，但隨貯藏時間的延長迅速下降，可能是適量的氮氣有利于蛋白質(zhì)在水油界面的擴散，降低了水油界面的張力，從而提高了SPI的乳化穩(wěn)定性，隨貯藏時間的延長，蛋白質(zhì)發(fā)生了聚合作用，使SPI的乳化穩(wěn)定性下降。

圖3 RH=80%，T=30℃條件下SPI乳化性變化

圖4 RH=80%，T=30℃條件下SPI的乳化穩(wěn)定性變化

2.3 高溫高濕環(huán)境下SPI乳化性與二級結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析

通過大豆分離蛋白在貯藏過程中乳化性及其β-折疊含量的監(jiān)測，獲得其相關(guān)變化趨勢圖，由圖5及其相關(guān)性分析可知，大豆分離蛋白的乳化性與β-折疊含量呈負相關(guān)（-0.675）。β-折疊是蛋白質(zhì)分子二級結(jié)構(gòu)中主要存在形式，含量越大表明肽鏈排列越有規(guī)律，越為緊密，疏水性基團會集聚在一起，形成疏水區(qū)域，與油脂之間的作用減弱，從而降低了乳化能力。

圖5 SPI乳化性與β-折疊含量變化

3 結(jié)論

在高溫高濕貯藏環(huán)境（RH 80%、30℃）下，針對不同包裝（100%氮氣鋁箔包裝、80%氮氣：20%二氧化碳鋁箔包裝、60%氮氣：40%二氧化碳鋁箔包裝、真空鋁箔包裝、實際工廠包裝：白板紙塑/HDPE和PE包裝）的SPI的二級結(jié)構(gòu)及乳化性的分析得知，不同包裝條件大豆分離蛋白的β-折疊均呈逐漸遞減的趨勢，其中以PE包裝的下降較為顯著，大豆分離蛋白的乳化性與β-折疊含量呈負相關(guān)（-0.675）。K.C.Chang等人研究了貯藏條件對大豆中提純的大豆球蛋白的結(jié)構(gòu)特性的影響[17]，研究發(fā)現(xiàn)在不利條件（RH 84%，30℃）下貯藏3月后的大豆中提純的大豆球蛋白與糖含量有明顯關(guān)聯(lián)并且表現(xiàn)為疏水作用下降，二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋的含量略微增加，但是β-折疊含量下降，與研究結(jié)果基本相同。貯藏條件對SPI乳化性產(chǎn)生影響的機理有待于進一步深入研究。

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Effect of High Temperature and Humidity on the Secondary Structure and Emulsibility of Soybean Protein Isolate

Sun Bingyu,Liu Linlin,Zhang Guang,Shi Yanguo
（Key Laboratory of Food Science and Engineering of Heilongjiang,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,Heilongjiang,China）

The SPI was applied in food industry widely,but its functionalities may change during storage.The effect of store temperature,time,RH and package material on emulsibility and the secondary structure of SPI were studied,when SPI was packaged in 100%N2and Al,80%N2：20%CO2and Al,60%N2：40%CO2and Al,vacuum and Al,white paper/plastic/HDPE and PE and then stored for 12 months in the conditions of RH 80%and 30 ℃.It was shown that the β-sheets of SPI only packaged in PE decreased significantly(p＜0.05)observed by 1 600～1 700 cm-1band of AmideⅠmaps.Comparing the functionalities of SPI with different packaging material,it was shown that the sequence of the barrier property of material to T and RH was Al packaging＞factory packaging＞PE packaging.Analyzed by relatedness,it was shown that the βsheets of SPI was negative(-0.675)correlation with emulsibility.

Soy protein isolate(SPI);The secondary structure;Emulsibility;Storage

TS201.2+1

B

1674-3547(2014)04-0026-06

2014-08-07

孫冰玉，女，博士，副教授，研究方向為大豆化學與技術(shù)加工，E-mail:sby0451@163.com

2012年黑龍江省研究生創(chuàng)新科研項目（YJSCX2012-128HLJ），2013年哈爾濱商業(yè)大學博士科研啟動項目（13DL016）

**通訊作者：石彥國，教授，研究方向為大豆蛋白加工技術(shù)研究，E-mail:yanguosh@163.com