黃潔,盛祖龍,姚玉宇

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210009)

近年來(lái),心血管疾病已成為威脅人類健康的首要因素?！吨袊?guó)心血管病報(bào)告2012》于2013年8月9日公布,報(bào)告指出我國(guó)心血管病患者人數(shù)約為2.9億,每10 s就有1人死于心血管疾病。因心肌梗死(MI)、心功能不全導(dǎo)致的死亡占心血管病死亡人數(shù)的50%以上。這類疾病的共同特征是心肌供血不足、心肌細(xì)胞數(shù)量減少?gòu)亩鴮?dǎo)致心功能低下。由于心肌細(xì)胞是終末細(xì)胞,壞死后無(wú)法再生,因此若病人心臟收縮功能持續(xù)降低,最終將演變?yōu)榻K末期心臟病。目前,國(guó)際上對(duì)終末期心臟病沒(méi)有很好的治療手段,主要原因是缺乏針對(duì)終末期心臟病病理改變的有效方法[1]。

1 MI的干細(xì)胞治療方法

梗死后的心肌因缺乏增殖分化能力,心肌細(xì)胞無(wú)法再生,只能由成纖維細(xì)胞填充,最終被瘢痕組織替代并且逐步發(fā)生心室的重構(gòu)。現(xiàn)有的治療包括藥物治療、冠脈介入治療,這些治療雖然可以減輕患者的癥狀,但無(wú)法從根本上改變患者心肌細(xì)胞數(shù)量缺乏的問(wèn)題,心臟的功能恢復(fù)也受到阻礙。近年來(lái),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床初期研究表明,通過(guò)移植干細(xì)胞可以取代受損心肌細(xì)胞,并建立新的血管通路而恢復(fù)血供,這已成為MI治療的熱點(diǎn)方法。

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的細(xì)胞,既可以產(chǎn)生和自己完全相同的子代干細(xì)胞,也可以在一定條件下分化成為各種其他功能的細(xì)胞。已有多種干細(xì)胞被嘗試用于心肌細(xì)胞的再生,涉及的干細(xì)胞可分兩大類,胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞雖可以分化成為心肌細(xì)胞參與對(duì)心肌的修復(fù)，但是存在不易獲取以及倫理學(xué)方面的相關(guān)問(wèn)題,此外它們?cè)谂R床上使用的安全性還有待檢驗(yàn)。成體干細(xì)胞作為自體細(xì)胞,雖然在分化潛能上不如胚胎干細(xì)胞,但是卻是一種非常適合移植的細(xì)胞。現(xiàn)已被證明能夠誘導(dǎo)心肌修復(fù)的成體干細(xì)胞有骨髓干細(xì)胞[2]、骨骼肌成肌細(xì)胞、心肌干細(xì)胞和心臟祖細(xì)胞。

2 干細(xì)胞療法面臨的問(wèn)題

盡管已經(jīng)有了這些適合的移植細(xì)胞以供選擇,干細(xì)胞移植在治療MI方面也顯示了傳統(tǒng)療法不可以比擬的優(yōu)越性,但在干細(xì)胞治療MI的進(jìn)程中還存在諸多需要解決的問(wèn)題。比如：心臟組織特異性干細(xì)胞的尋找以及分離培養(yǎng)的技術(shù)問(wèn)題;經(jīng)過(guò)體外分離培養(yǎng)的干細(xì)胞是一類具有多向分化能力的細(xì)胞,它們是否存在基因突變,植入機(jī)體后是否有發(fā)生癌變的可能性等。

此外將干細(xì)胞移植入梗死心肌,還面臨著移植細(xì)胞大量死亡的問(wèn)題。研究顯示,移植1周后的細(xì)胞存活率低于10%,這大大降低了細(xì)胞治療的預(yù)期效果。造成移植后細(xì)胞死亡的原因是多方面的,如宿主炎癥反應(yīng)、機(jī)械損傷、適應(yīng)不良、缺血或缺血再灌注損傷、細(xì)胞凋亡以及干細(xì)胞來(lái)源和質(zhì)量等[3]。因此,針對(duì)這一難題,我們對(duì)提高干細(xì)胞在移植后的缺血環(huán)境中生存的方法進(jìn)行了深入的探討。

3 促移植干細(xì)胞存活的策略

3.1 缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)

研究發(fā)現(xiàn)對(duì)心臟進(jìn)行短暫缺血再灌注能夠減輕心肌細(xì)胞損傷,提高心肌細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)時(shí)間缺血損傷的抵御能力,具有細(xì)胞保護(hù)效果。對(duì)心肌重復(fù)進(jìn)行每5 min1個(gè)周期的間歇性缺血再灌注能夠顯著縮減心肌梗死面積,并且能夠激活細(xì)胞內(nèi)的生存信號(hào),此方法被稱為IPC。通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行IPC而促進(jìn)細(xì)胞存活已成為一種很有潛力的細(xì)胞保護(hù)策略[4]。

雖然IPC對(duì)心肌的保護(hù)作用已得到廣泛的認(rèn)可,但是它的機(jī)制仍未被完全闡明。目前認(rèn)為,此機(jī)制的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程包括“觸發(fā)物質(zhì)(內(nèi)源性活性物質(zhì))- 中介物質(zhì)(蛋白激酶)- 效應(yīng)子(離子通道和保護(hù)蛋白)”3個(gè)環(huán)節(jié)。

首先缺血刺激可誘導(dǎo)機(jī)體釋放大量的內(nèi)源性活性物質(zhì),如腺苷、兒茶酚胺物質(zhì)、緩激肽[5]、罌粟堿以及一氧化氮(NO)。這些物質(zhì)的表達(dá)水平與預(yù)適應(yīng)刺激的強(qiáng)度以及持續(xù)時(shí)間有關(guān),它們可以作為觸發(fā)因子引起后續(xù)一系列的反應(yīng)。隨之,活性物質(zhì)與受體結(jié)合后活化的蛋白激酶發(fā)揮中介效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C(PKC)[6]是一種重要的調(diào)節(jié)激酶,在IPC細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮作用。另外,其它多種蛋白激酶,包括酪氨酸蛋白激酶(Src)、磷脂酰肌醇3- 激酶(PI3K)、P38 絲裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)和Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK /STAT)通路也可作為中介物質(zhì)參與到IPC過(guò)程中[7]。

最后整個(gè)信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路終止于能夠產(chǎn)生終末效應(yīng)的離子通道。心肌纖維膜上的ATP依賴鉀離子(KATP)通道就是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中終末效應(yīng)物質(zhì)之一,在預(yù)適應(yīng)的急性時(shí)相中發(fā)揮作用[8]。近期研究也顯示,在IPC或者化學(xué)藥物誘導(dǎo)的預(yù)適應(yīng)中,線粒體的KATP通道不僅可以作為終末效應(yīng)子,還能作為中介物質(zhì)發(fā)揮作用[9]。

此外,IPC的延遲保護(hù)作用與新生蛋白質(zhì)的合成有關(guān),誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)與這一保護(hù)作用關(guān)系密切。后續(xù)的研究也已表明,IPC能夠動(dòng)員起內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)出一系列的有潛在心肌保護(hù)作用的細(xì)胞因子,NOS就是這些細(xì)胞因子中的一員[10]。同時(shí),IPC能夠顯著提高細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抵御能力和細(xì)胞移植的植入水平[11]。

預(yù)適應(yīng)細(xì)胞提高了細(xì)胞分化潛能和旁分泌活力,多數(shù)研究認(rèn)為細(xì)胞缺氧和低氧預(yù)適應(yīng)能夠提高細(xì)胞的存活率,有利于MI后心臟修復(fù),因此在移植前對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行缺血預(yù)處理是一種提高干細(xì)胞療法有效性的措施[12]。

3.2 藥物預(yù)適應(yīng)

因?yàn)镮PC應(yīng)有一定創(chuàng)傷性,并存在一些潛在危險(xiǎn)因素，導(dǎo)致它難以在臨床上推廣使用。但其細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)還可以通過(guò)其他一些方式來(lái)模擬,如藥物預(yù)適應(yīng)。藥物預(yù)適應(yīng)是指預(yù)先用具有刺激作用或輕微損傷作用的藥物處理,激發(fā)或者模擬機(jī)體中的內(nèi)源性物質(zhì),如腺苷、緩激肽、前列環(huán)素(PGI2)、NO等,以調(diào)動(dòng)機(jī)體對(duì)后續(xù)長(zhǎng)期有害刺激(如缺血、缺氧等)的抵抗力。

已知通過(guò)激活線粒體通道促進(jìn)細(xì)胞存活是一種內(nèi)源性反應(yīng),也是自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制的一部分[13]。這種效應(yīng)可通過(guò)藥理性干預(yù)模仿完成,從而提高移植細(xì)胞的存活率。研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用KATP通道開(kāi)放劑,如二氮嗪、吡那地爾,可以促進(jìn)鉀離子大量涌入KATP通道,激活自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)系統(tǒng),保護(hù)植入的細(xì)胞[14- 16]。

基于大鼠的缺血再灌注損傷研究顯示,用KATP開(kāi)放劑二氮嗪預(yù)處理心肌細(xì)胞能夠降低血清心肌酶含量、減少M(fèi)I面積、維護(hù)心功能,減輕損傷。其機(jī)制可能是二氮嗪作用于KATP并開(kāi)放通道,使鉀離子、水分子內(nèi)流,導(dǎo)致線粒體基質(zhì)腫脹,呼吸功能增強(qiáng),防止線粒體的鈣超載[17- 18]。相反,若使用KATP通道抑制劑5- hydroxydeeanoate(5- 羥葵酸鹽)可以去除二氮嗪對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[19],進(jìn)一步證實(shí)了二氮嗪對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用。

近期研究中,經(jīng)二氮嗪處理的間充質(zhì)干細(xì)胞能通過(guò)核因子-κB活化而提高細(xì)胞生存率,同時(shí)使得PI3Κ、 蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶- 3β(GSK3β)和核轉(zhuǎn)錄因子p65(NF-κB p65)的磷酸化作用增強(qiáng)[20]。使用Wortmannin(渥曼青霉素,PI3K特異性抑制劑)、小分子多肽(NEMO- binding domain,NBD)、或NF-κB p50 小干擾RNA(siRNA)可以去除NF-κB p65的激活導(dǎo)致細(xì)胞生存下降。

除了生存信號(hào)通道的激活,藥物預(yù)處理干細(xì)胞還能引起預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞以旁分泌方式釋放生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子,從而保護(hù)細(xì)胞、促進(jìn)新生血管生成。此現(xiàn)象進(jìn)一步支持了預(yù)處理誘導(dǎo)的信號(hào)通路中的“分泌假說(shuō)”。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)預(yù)處理的干細(xì)胞中,一些可溶性的生長(zhǎng)因子釋放顯著增多,比如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF- 1)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)及胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF- I)。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)研究中,通過(guò)對(duì)預(yù)適應(yīng)后的骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行以PCR(聚合酶鏈反應(yīng))為基礎(chǔ)的生長(zhǎng)因子分析顯示,預(yù)適應(yīng)能使骨骼肌細(xì)胞中的白介素11(IL- 11)以自分泌或者旁分泌形式產(chǎn)生,從而促進(jìn)細(xì)胞生存[21]。這些實(shí)驗(yàn)都清楚地表明用藥物適應(yīng)細(xì)胞后不僅能激活KATP通道,而且能啟動(dòng)多重分子機(jī)制,拮抗氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。

藥物預(yù)處理表現(xiàn)出較好的可控性和重復(fù)性,并且此種處理方式相對(duì)于缺血預(yù)處理顯示了更小的毒副作用。實(shí)驗(yàn)對(duì)象對(duì)這種預(yù)處理方式也表現(xiàn)出很好的耐受,因此藥物預(yù)適應(yīng)具有良好的臨床應(yīng)用前景,更易在臨床上進(jìn)行推廣。

3.3 基因修飾干細(xì)胞

基因修飾是利用分子克隆技術(shù)操作目的基因,并改變生物遺傳性狀的過(guò)程。即采用類似工程技術(shù)的方法在體外進(jìn)行基因重組,讓該宿主細(xì)胞具備過(guò)表達(dá)或者靜默表達(dá)某種基因的能力,從而改變宿主細(xì)胞原有的功能性狀?；蛐揎椫饕沟酶杉?xì)胞過(guò)表達(dá)相關(guān)蛋白,有助于提高細(xì)胞移植效率、保護(hù)心臟功能和協(xié)助體內(nèi)示蹤等。研究發(fā)現(xiàn)可以對(duì)細(xì)胞移植的各個(gè)階段開(kāi)展基因修飾,從而解決細(xì)胞移植治療難題,促進(jìn)細(xì)胞早期存活并快速有效地歸巢。

3.3.1 提高干細(xì)胞存活能力 B淋巴細(xì)胞瘤- 2(Bcl- 2)基因家族是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的一類蛋白質(zhì),它可以抑制細(xì)胞凋亡,延長(zhǎng)細(xì)胞生存時(shí)間。用Bcl- 2修飾過(guò)的干細(xì)胞在移植入梗死區(qū)域后存活率有顯著提高,心肌梗死面積減少,心功能明顯提高[22]。

研究顯示Akt在調(diào)節(jié)各種生長(zhǎng)因子或者刺激其他因素誘導(dǎo)干細(xì)胞存活、增殖以及物質(zhì)代謝等方面發(fā)揮重要作用。用Akt基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)后,將其注入到梗死心肌模型內(nèi),發(fā)現(xiàn)Akt- MSCs比未修飾過(guò)的MSCs具有更強(qiáng)的抗凋亡能力,移植后的凋亡率下降了80%,分化為心肌樣細(xì)胞的數(shù)目明顯增多,梗死區(qū)面積顯著減小。由此可見(jiàn),Akt修飾干細(xì)胞,能有促細(xì)胞存活的功效[23]。

3.3.2 促進(jìn)新血管生成,改善生存環(huán)境 因?yàn)檠馨l(fā)生粥樣硬化從而引起心肌細(xì)胞的壞死,最終導(dǎo)致缺血性心臟病的發(fā)生。如果能夠促血管生成,提高血管密度,建立側(cè)支循環(huán),恢復(fù)血供,改善干細(xì)胞和周圍心肌細(xì)胞的微環(huán)境,便能大大減少細(xì)胞死亡,對(duì)治療MI也有極其重要的推動(dòng)作用。血管生長(zhǎng)因子可以通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移誘導(dǎo)血管生成,促進(jìn)相關(guān)組織的生長(zhǎng)和修復(fù)。VEGF是被廣泛研究的血管生長(zhǎng)因子中的一種。外源性VEGF可促進(jìn)血管生成、增加缺血區(qū)灌流、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)受損血管內(nèi)皮愈合、抑制其下的平滑肌層病理性增厚、促進(jìn)內(nèi)皮依賴的血管舒張并可減少心肌缺血再灌注損傷。研究發(fā)現(xiàn),如果將VEGF基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞可以提高干細(xì)胞治療缺血心肌的療效。過(guò)表達(dá)VEGF的單個(gè)核細(xì)胞在移植后能夠顯著增加側(cè)支血管及毛細(xì)血管的密度,并且顯著提高左心室功能[24]。目前,血管生成生長(zhǎng)因子通過(guò)促進(jìn)側(cè)支循環(huán)生長(zhǎng)治療缺血性心臟病,為不能選擇傳統(tǒng)血運(yùn)重建治療的患者提供幫助。

3.3.3 改善血管順應(yīng)性 NO在心血管疾病治療中起重要作用。NO具有調(diào)節(jié)血壓、擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集和白細(xì)胞黏附、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。NO是被NOS催化而成,共有3種不同的NOS如內(nèi)皮型eNOS、神經(jīng)型nNOS和誘生型iNOS，其作用也各不相同。eNOS主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞中,是鈣離子和鈣調(diào)素依賴性酶,但是其活性維持非常短暫,催化的NO量也較少。所以如果能對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行eNOS的基因修飾,成功表達(dá)eNOS重組蛋白,便可大大提高催化的NO量。

最新研究結(jié)果顯示,eNOS基因轉(zhuǎn)染MSC能安全有效地改善小型豬MI后心功能[25]。對(duì)其機(jī)制的研究認(rèn)為eNOS可增強(qiáng)血管順應(yīng)性,使得血管保持通暢[26]。同樣也發(fā)現(xiàn),若將eNOS轉(zhuǎn)染到內(nèi)皮祖細(xì)胞上可以起到幫助細(xì)胞遷移、促分化的作用[27]。NOS/NO系統(tǒng)在心血管疾病中有著重要地位,對(duì)NOS/NO的干預(yù)也成為了心血管疾病治療的新靶點(diǎn)。

3.3.4 增強(qiáng)干細(xì)胞趨化歸巢作用 許多生長(zhǎng)因子有促細(xì)胞向心肌歸巢的能力,不同的生長(zhǎng)因子能夠?qū)Σ煌愋偷母杉?xì)胞起動(dòng)員作用。比如SDF- 1可以動(dòng)員心臟干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及特異性表達(dá)趨化因子受體CXCR4的間充質(zhì)干細(xì)胞[28],而單核趨化因子3(MCP- 3)在MI后24 h升高達(dá)36倍,并在促進(jìn)多種干細(xì)胞動(dòng)員及歸巢中起重要作用[29- 30]。在急性MI發(fā)生后缺血區(qū)域生長(zhǎng)因子富集,從而動(dòng)員干細(xì)胞定位到損傷的心肌組織周圍進(jìn)行修復(fù),但是各種因子參與修復(fù)過(guò)程取決于即刻濃度、相互交錯(cuò)存在的多態(tài)性及協(xié)同和拮抗作用。由于這些因子的表達(dá)時(shí)間非常有限,所以可以通過(guò)基因修飾方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理,使得相應(yīng)的生長(zhǎng)因子在心肌組織內(nèi)過(guò)表達(dá)并且延長(zhǎng)其表達(dá)時(shí)間。SDF- 1α/CXCR4受體/配體系統(tǒng)廣泛分布于生物體內(nèi),參與細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、生存和抗凋亡以及遷移、轉(zhuǎn)錄活性。研究表明,通過(guò)基因修飾延長(zhǎng)SDF- 1在心肌組織中的表達(dá)時(shí)間,可以誘導(dǎo)移植細(xì)胞定位,提高血管密度,激活并動(dòng)員自體心臟干細(xì)胞,改善心功能。

同時(shí)也發(fā)現(xiàn)如果在移植前對(duì)MSC進(jìn)行處理,將細(xì)胞表面的CXCR4受體作為預(yù)適應(yīng)的靶點(diǎn),然后通過(guò)SDF- 1α/CXCR4受體/配體的相互作用可提高供體細(xì)胞的定位,具有改善心功能的效果[31]。因此,無(wú)論是對(duì)內(nèi)源性細(xì)胞過(guò)表達(dá)細(xì)胞因子,還是對(duì)外源性植入細(xì)胞進(jìn)行過(guò)表達(dá)相關(guān)細(xì)胞因子的受體,都可以起到定向動(dòng)員作用,從而提高治療效率。

3.3.5 多基因修飾干細(xì)胞 隨著基因修飾干細(xì)胞的研究不斷發(fā)展,為了進(jìn)一步提高干細(xì)胞的性狀,人們提出多基因修飾干細(xì)胞的設(shè)想。實(shí)際研究發(fā)現(xiàn),基因修飾干細(xì)胞聯(lián)合過(guò)表達(dá)一個(gè)或多個(gè)生存信號(hào)分子可以達(dá)成這一目標(biāo)。例如,血管生成素- 1(Ang- 1)是一種有效的血管發(fā)育調(diào)節(jié)基因,當(dāng)它與相關(guān)受體結(jié)合后可以激活A(yù)kt生存信號(hào)通路,預(yù)處理MSC可顯著提高其抗凋亡能力,從而顯著改善心功能[32]。如果在間充質(zhì)細(xì)胞上聯(lián)合過(guò)表達(dá)Ang- 1和Akt能使細(xì)胞在植入梗死大鼠心肌后更好存活,兩者的聯(lián)合效果要優(yōu)于獨(dú)自單一的過(guò)表達(dá)效果[33]。此外,Akt和Ang- 1共轉(zhuǎn)染MSC,能促使大鼠MI后毛細(xì)血管和小動(dòng)脈顯著增生并在3個(gè)月內(nèi)顯著改善心功能[34]。

4 總 結(jié)

干細(xì)胞移植治療是目前治療心血管疾病的熱點(diǎn),雖然相對(duì)于傳統(tǒng)方法它有著巨大優(yōu)勢(shì),但移植后的細(xì)胞大量的丟失是其面臨的最棘手的問(wèn)題。移植后嚴(yán)峻的微環(huán)境使細(xì)胞難以存活,大量的細(xì)胞死亡又進(jìn)一步激發(fā)免疫和炎癥反應(yīng)而加劇微環(huán)境的惡化,如此反復(fù)形成惡性循環(huán)。因此,當(dāng)務(wù)之急就是優(yōu)化細(xì)胞移植環(huán)境,并且在移植前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)來(lái)承受移植后的嚴(yán)峻考驗(yàn)?，F(xiàn)階段已有許多手段可以提高干細(xì)胞治療的效果,包括IPC、藥物預(yù)適應(yīng)、基因修飾干細(xì)胞。但它們各有其優(yōu)缺點(diǎn),所以我們需要對(duì)這些細(xì)胞保護(hù)方法進(jìn)行更深入的研究并應(yīng)用到臨床,從而提高干細(xì)胞治療心血管疾病的效果。

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