山 鷹， 張 瑋, 2， 王麗卿， 徐玉萍

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2.上海水生環(huán)境工程有限公司, 上海 200090)

六價(jià)鉻(Cr6+)為工業(yè)“五毒”之一，是一種毒性大、致畸、致突變的重金屬；六價(jià)鉻可直接侵入生物體內(nèi)，造成生物體代謝損傷，甚至死亡；也可通過食物鏈的富集，引發(fā)復(fù)雜的毒害問題；因此，如何監(jiān)測環(huán)境中的六價(jià)鉻污染，并研究其對(duì)不同生物的影響，對(duì)受污染環(huán)境的及時(shí)監(jiān)測和治理具有重要意義[1-3]。

在水域生態(tài)系統(tǒng)中，藻類是重要的初級(jí)生產(chǎn)者，常常作為一個(gè)食物鏈的開端，具有重要的生態(tài)地位。故利用一些生態(tài)習(xí)性特殊、較敏感的藻類作為污染指示種，可監(jiān)測水體的重金屬污染程度和估測水生態(tài)的受損程度。然而，目前關(guān)于六價(jià)鉻(Cr6+)對(duì)淡水藻類毒性的研究僅有有限的報(bào)道。Corradi等研究認(rèn)為，柵藻的分泌物具有降低Cr6+毒性的作用；陳海柳等比較了6種微藻對(duì)Cr6+的耐受性，發(fā)現(xiàn)四尾柵藻>羊角月牙藻>鈍頂螺旋藻>極大螺旋藻>聚球藻>蛋白核小球藻[4-6]。本文以水綿(Spirogyrasp.)為研究對(duì)象，從淡水藻類的生長以及細(xì)胞氧化損傷的角度出發(fā)，探討了六價(jià)鉻(Cr6+)對(duì)水綿的毒性作用，以期為淡水絲狀綠藻對(duì)六價(jià)鉻毒性響應(yīng)機(jī)理的研究及六價(jià)鉻在水環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)積累科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品采集及分離

實(shí)驗(yàn)藻種于2013年3月15日采自上海海洋大學(xué)校園水系，采集時(shí)水溫為14.6℃。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離后，純化培養(yǎng)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基篩選結(jié)果，從水生4號(hào)、朱氏10號(hào)、BG11液體培養(yǎng)基中選取實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基為BG11液體培養(yǎng)基，pH值控制在7.5～8.0，溫度為25℃、光照強(qiáng)度3000 Lx、光暗比14 h∶10 h。

1.2 馴化培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)前向每個(gè)實(shí)驗(yàn)容器(長55 cm×寬40 cm×高30 cm)的透明玻璃缸內(nèi)加入曝氣24 h的上海海洋大學(xué)校園水系水至20 cm。培養(yǎng)條件為濕度66%，明暗周期12 h，溫度25℃，光照強(qiáng)度8000 Lx。每個(gè)容器內(nèi)加入前期大量培養(yǎng)制備的15 g(鮮重)水綿進(jìn)行5 d的適應(yīng)。

1.3 六價(jià)鉻對(duì)水綿的EC50值測定

取20 g鮮重的藻體分裝于500 mL錐形瓶中。培養(yǎng)3 d后, 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果, 設(shè)置5個(gè)暴露組和1個(gè)空白對(duì)照組, 每組3個(gè)平行, 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用重鉻酸鉀(K2Cr2O7，優(yōu)級(jí)純)配制六價(jià)鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液[7]，六價(jià)鉻在藻液中的終濃度分別為4、6、8、10和12 mg/L, 測定六價(jià)鉻對(duì)水綿的毒性。每隔24 h取樣, 稱取等量鮮重水綿后測定藻細(xì)胞中葉綠素a的含量(μg/g), 葉綠素a(Chla)采用丙酮萃取-分光光度法，具體步驟參照《水和廢水監(jiān)測分析方法進(jìn)行》[7]。

用概率單位-濃度對(duì)數(shù)法[8], 分別計(jì)算出24、48、72和96 h的半效應(yīng)濃度EC50值。

1.4 膜脂過氧化作用的測定

實(shí)驗(yàn)96 h后測定1次丙二醛含量和細(xì)胞膜透性。

丙二醛(MDA)含量的測定采用TBA比色法，參照李合生等[9]的方法。細(xì)胞膜透性采用電導(dǎo)儀測定[10]。在20℃環(huán)境下在實(shí)驗(yàn)96 h后測定。取培養(yǎng)中的藻體，用吸水紙吸干外部的水分，稱取1 g±0.2 g，用自來水洗凈后，再用去離子水洗4次，放入40 mL燒杯中，將上述藻體剪碎研磨并加入去離子水至40 mL，連續(xù)振蕩2 h后，用電導(dǎo)儀測定浸出液的電導(dǎo)率。

1.5 分析方法與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel2003、SPSS 18.0軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 六價(jià)鉻對(duì)水綿的急性毒性

不同濃度六價(jià)鉻暴露下，水綿的生長曲線如圖1所示。從圖1可以看出, 24 h后，除4 mg/L組和6 mg/L組葉綠素a含量略有上升外(131.22 μg/g和103.59 μg/g)，各實(shí)驗(yàn)組藻類葉綠素a含量在96 h后都出現(xiàn)了下降；隨著暴露時(shí)間的推移，六價(jià)鉻在藻細(xì)胞內(nèi)積累，實(shí)驗(yàn)組葉綠素a含量雖然都有一定的上升，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照組葉綠素a的濃度。隨著六價(jià)鉻暴露濃度的增大, 葉綠素a含量逐漸下降, 顯示出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。鏡檢發(fā)現(xiàn), 隨著六價(jià)鉻濃度的增大和暴露時(shí)間的延長, 藻細(xì)胞體積縮小, 顏色明顯變黃變白，出現(xiàn)葉綠體分布不規(guī)則和解體現(xiàn)象。說明六價(jià)鉻對(duì)水綿的生長產(chǎn)生了一定的解偶聯(lián)作用(解偶聯(lián)作用即為所有破壞生物氧化與磷酸化相偶聯(lián)的作用。解偶聯(lián)劑使氧化和磷酸化脫偶聯(lián)，氧化仍可以進(jìn)行，而磷酸化不能進(jìn)行而導(dǎo)致無ATP生成，使氧化釋放出來的能量全部以熱的形式散發(fā)。本文中水綿在六價(jià)鉻脅迫作用下，出現(xiàn)了解偶聯(lián)的現(xiàn)象?？梢酝茢嗔鶅r(jià)鉻對(duì)水綿是一種生長解偶聯(lián)劑)。且與對(duì)照組相比，不同六價(jià)鉻濃度組對(duì)水綿細(xì)胞生長均呈現(xiàn)抑制作用，且高濃度比低濃度更明顯。

圖1 不同濃度六價(jià)鉻對(duì)水綿生長的影響

根據(jù)圖1的數(shù)據(jù), 采用黃國蘭等[8]介紹的方法得到不同時(shí)間的概率單位-濃度對(duì)數(shù)曲線方程, 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析, 確定各時(shí)間(24、48、72和96 h)的EC50及其95%置信區(qū)間, 如表1所示。

由表1可以看出, 各個(gè)時(shí)段的EC50值中, 24 h時(shí)最不敏感, 其EC50值最大(8.33 mg/L), 表明在短時(shí)間內(nèi), 水綿有一定自我恢復(fù)能力；隨著暴露天數(shù)的增加, EC50值減小且變化不大(7.02～7.53 mg/L), 表明六價(jià)鉻對(duì)水綿的毒性隨著時(shí)間的延長而增強(qiáng), 藻自身的抗性減小, 恢復(fù)減慢。此結(jié)果與暴露組水綿的抗逆性指標(biāo)變化是一致的。

表1 六價(jià)鉻對(duì)水綿的急性毒性

x為六價(jià)鉻濃度對(duì)數(shù)(以10為底)；y為抑制率概率單位(%)。

根據(jù)表1的數(shù)據(jù)，參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》[7]的毒性的分級(jí), 藻類以96 h EC50數(shù)值為判斷依據(jù)，<1 mg/L屬極高毒；1～10 mg/L為高毒；10～100 mg/L為中毒；>100 mg/L屬低毒。結(jié)果表明六價(jià)鉻對(duì)于水綿屬于高毒(96 h EC50為7.25 mg/L)。

2.2 水綿抗逆性指標(biāo)變化

暴露96 h后, 各實(shí)驗(yàn)組水綿細(xì)胞浸出液電導(dǎo)率的變化如圖2a所示。從圖中可以看出, 隨六價(jià)鉻暴露濃度的升高, 浸出液電導(dǎo)率變化呈逐漸遞增趨勢。而從圖2b 中也可以看出，MDA含量也呈現(xiàn)不斷累積的趨勢。

圖2 不同濃度六價(jià)鉻對(duì)水綿細(xì)胞浸出液電導(dǎo)率(a)和MDA(b)的變化

電導(dǎo)率是測定絲狀藻類細(xì)胞浸出液的導(dǎo)電能力，以反映其細(xì)胞膜透性的變化。當(dāng)實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，六價(jià)鉻還未能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。所以當(dāng)六價(jià)鉻濃度<4 mg/L, 細(xì)胞浸出液電導(dǎo)率變化不大, 僅比對(duì)照高出10.85%，表明六價(jià)鉻對(duì)藻具有一定的毒害作用, 藻體受到逆境脅迫, 導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)開始被破壞而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)流出，使得細(xì)胞浸出液電導(dǎo)率開始變大；當(dāng)六價(jià)鉻濃度>6 mg/L時(shí), 細(xì)胞浸出液電導(dǎo)率活性有較為明顯的上升, 與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05), 當(dāng)六價(jià)鉻濃度≥8 mg/L時(shí)，與對(duì)照組相比有極顯著性差異(P<0.01), 但與8和10 mg/L組無顯著性差異(P>0.05)。到濃度為12 mg/L時(shí)到達(dá)峰值，高出對(duì)照80.26%。表明由于高濃度六價(jià)鉻的脅迫, 藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)遭到破壞, 超過了藻自身的調(diào)節(jié)范圍, 從而導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)被幾乎完全破壞，電導(dǎo)率到達(dá)峰值。

2.3 水綿抗逆性指標(biāo)與六價(jià)鉻濃度的毒性響應(yīng)關(guān)系

當(dāng)六價(jià)鉻濃度≥4 mg/L時(shí)，MDA含量就有明顯升高，與對(duì)照組有極顯著性差異(P<0.01)。當(dāng)六價(jià)鉻濃度≥8 mg/L時(shí)，與6 mg/L相比，無顯著性差異(P>0.05)，這表明即使是低濃度的六價(jià)鉻也會(huì)對(duì)藻體細(xì)胞有嚴(yán)重的脅迫作用，且隨著六價(jià)鉻暴露濃度的增大，膜脂過氧化加劇，細(xì)胞傷害加重，其生長受到抑制。

圖3 水綿細(xì)胞浸出液電導(dǎo)率(a)和MDA(b)對(duì)不同濃度六價(jià)鉻的毒性響應(yīng)

從圖3a和圖3b可以看出，水綿細(xì)胞浸出液電導(dǎo)率與六價(jià)鉻濃度存在顯著正相關(guān)非線性關(guān)系(P<0.05，r=0.951)，在六價(jià)鉻濃度為12 mg/L時(shí)，水綿細(xì)胞浸出液電導(dǎo)率比對(duì)照組增加了80.53%；水綿MDA含量與六價(jià)鉻濃度存在極顯著正相關(guān)非線性關(guān)系(P<0.01，r=0.977)，在六價(jià)鉻濃度為12 mg/L時(shí)，水綿細(xì)胞MDA含量比對(duì)照組增加了77.32%。可以看出，水綿細(xì)胞浸出液電導(dǎo)率和水綿細(xì)胞MDA含量與六價(jià)鉻濃度存在一定的毒性響應(yīng)關(guān)系。其中水綿MDA含量比水綿細(xì)胞浸出液電導(dǎo)率能更好反應(yīng)六價(jià)鉻的脅迫程度(0.977>0.951)。

3 討論

大量研究表明，植物細(xì)胞應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)，細(xì)胞質(zhì)膜是最敏感的結(jié)構(gòu)部分[13]，脅迫會(huì)引起細(xì)胞脫水，細(xì)胞脫水和再度吸水又會(huì)造成對(duì)質(zhì)膜的機(jī)械傷害，最終導(dǎo)致質(zhì)膜結(jié)構(gòu)完整性的破壞[14]。MDA是生物膜系統(tǒng)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，其濃度表示脂質(zhì)過氧化強(qiáng)度和膜系統(tǒng)傷害程度。本實(shí)驗(yàn)中MDA含量的上升表明，隨著六價(jià)鉻暴露濃度的升高，活性氧的產(chǎn)生和清除間的平衡被破壞，水綿的膜脂質(zhì)過氧化加劇，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，細(xì)胞傷害加重。因此即使是較低濃度的六價(jià)鉻也會(huì)對(duì)水綿細(xì)胞液造成傷害，逐漸導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能完整性的喪失；且濃度越高，破壞越嚴(yán)重。以致完全喪失功能成為通透性的膜[15, 16]。

本實(shí)驗(yàn)中，低濃度的六價(jià)鉻暴露下，細(xì)胞浸出液電導(dǎo)率增加，但在4 mg/L濃度增加值(與對(duì)照組相比)比6 mg/L時(shí)低37.10%；而MDA指標(biāo)上，6 mg/L濃度組只比4 mg/L濃度組高1.85%。表明細(xì)胞內(nèi)部的膜體損傷程度比細(xì)胞膜嚴(yán)重，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了解體，但程度較輕。而高濃度六價(jià)鉻暴露下，細(xì)胞浸出液電導(dǎo)率明顯增加，氧自由基增多，膜質(zhì)過氧化加劇，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致細(xì)胞滲漏加劇。水綿細(xì)胞浸出液電導(dǎo)率與六價(jià)鉻濃度存在顯著正相關(guān)關(guān)系，從不同角度說明六價(jià)鉻抑制了藻細(xì)胞的生長和代謝。

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