林森，陳崇喜，王春雷，廖志蘇

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325200；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

琥珀酸脫氫酶B和丙酮酸脫氫酶激酶1在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

林森1，陳崇喜1，王春雷1，廖志蘇2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325200；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325015）

目的：探討琥珀酸脫氫酶（SDH）B和丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）1在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法：采用免疫組化法檢測78例鼻咽癌組織及35例鼻咽黏膜慢性炎癥組織中SDHB和PDK1的表達(dá)情況，運(yùn)用x2檢驗(yàn)分析SDHB和PDK1表達(dá)與鼻咽癌患者臨床病理因素的關(guān)系，運(yùn)用Kaplan-Meter法分析其與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：SDHB和PDK1在鼻咽癌組織中陽性表達(dá)率分別為39.7%（31/78）和53.8%（42/ 78），而在鼻咽黏膜慢性炎癥組織中為62.9%（22/35）和20.0%（7/35），SDHB和PDK1表達(dá)均與鼻咽癌復(fù)發(fā)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），與患者性別、年齡等無顯著相關(guān)（P＞0.05）。K-M生存曲線提示SDHB陽性表達(dá)和PDK1陰性表達(dá)者的生存率分別高于SDHB陰性表達(dá)和PDK1陽性表達(dá)者，多因素Cox回歸分析顯示，T分級、臨床分期、復(fù)發(fā)是影響鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，SDHB和PDK1表達(dá)不能作為影響鼻咽癌預(yù)后的獨(dú)立因素。結(jié)論：SDHB和PDK1表達(dá)在鼻咽癌的發(fā)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)中起著重要作用，并可能對預(yù)后有影響，但SDHB和PDK1表達(dá)不是影響預(yù)后的獨(dú)立因素。

鼻咽腫瘤；琥珀酸脫氫酶B；丙酮酸脫氫酶激酶1；臨床病理；預(yù)后

盡管放化療技術(shù)不斷發(fā)展，但鼻咽癌的病死率仍位居耳鼻咽喉頭頸外科之首，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時常已有頸部淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，確診時已是第I I I期或第IV期。近些年來由于腫瘤細(xì)胞的糖代謝特異性重新引起人們的高度重視，探索通過靶向糖代謝途徑治療惡性腫瘤的策略正備受關(guān)注，然而對惡性腫瘤的糖代謝過程中關(guān)鍵酶的選擇是一個很關(guān)鍵的問題。琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase subunit，SDH）B位于線粒體內(nèi)膜，是線粒體呼吸鏈的組成部分，丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）1是細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵限速酶丙酮酸脫氫酶的調(diào)節(jié)酶，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化技術(shù)分析SDHB和PDK1在鼻咽癌以及鼻咽黏膜慢性炎癥組織中的表達(dá)情況及其臨床意義，探討了SDHB和PDK1在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料收集2007年1月至2010年6月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科具有完整隨訪資料的鼻咽癌活檢標(biāo)本78例，其中男53例，女25例，年齡35～79歲，中位年齡45歲。于2010年1月至2012年1月進(jìn)行隨訪，生存期計(jì)算從病理確診到隨訪截止日期，或由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期。按WHO國際組織分類標(biāo)準(zhǔn)分類：角化性鱗狀細(xì)胞癌8例，分化型非角化21例，未分化型非角化性癌49例；按國際抗癌聯(lián)盟（UICC）臨床TNM分期：I～I(xiàn) I期50例，I I I～I(xiàn)V期28例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例。另取35例鼻咽黏膜慢性炎癥組織標(biāo)本作為對照組。

1.2 主要試劑及檢測方法SDHB和PDK1單克隆抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品，相關(guān)試劑盒購自上海長島生物技術(shù)有限公司，采用PV-6000二步法檢測，操作步驟按說明書進(jìn)行，以PBS代替一抗作陰性對照。SDHB和PDK1陽性反應(yīng)均多定位于胞漿，偶見于胞膜和胞核；表現(xiàn)為呈淺棕到棕色顆粒。隨機(jī)觀察10個高倍鏡視野，按每視野陽性細(xì)胞數(shù)百分比記分：陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，5l%～75%為3分，＞75%為4分。按著色強(qiáng)度記分：染色呈淡黃色者記為1分，染色呈黃色者記為2分，染色呈棕黃色者記為3分。兩種記分的乘積即為陽性強(qiáng)度：0分為陰（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。本研究在進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時，以陰性（-）、弱陽性（+）作為陰性組，以中度陽性（++）、強(qiáng)陽性（+++）作為陽性組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。SDHB和PDK1表達(dá)與臨床分期、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)率、顱神經(jīng)侵犯等的比較采用x2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并以Log rank法進(jìn)行檢驗(yàn)，Cox風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行獨(dú)立預(yù)后因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SDHB和PDK1在鼻咽癌組織和鼻咽黏膜慢性炎癥組織中的表達(dá)情況經(jīng)統(tǒng)計(jì)，SDHB和PDK1在鼻咽癌組織中陽性表達(dá)率分別為39.7%（31/78）和53.8%（42/78），在鼻咽黏膜慢性炎癥組織中陽性表達(dá)率分別為62.9%（22/35）和20.0%（7/35），陽性表達(dá)主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，亦可見細(xì)胞核（見圖1-4），不同組織SDHB和PDK1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別x2=5.183，P＜0.05；x2=11.269，P＜0.05）。

圖1 SDHB蛋白在鼻咽黏膜慢性炎癥組織中的表達(dá)情況（×200）

圖2 SDHB蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況（×200）

圖3 PDK1蛋白在鼻咽黏膜慢性炎癥組織中的表達(dá)情況（×200）

圖4 PDK1蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況（×200）

2.2 鼻咽癌組織中PDK1和SDHB蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系由表1可見，不同病理類型的鼻咽癌PDK1和SDHB蛋白的表達(dá)水平明顯不同，SDHB在鼻咽癌組織中呈低表達(dá)，I I I～I(xiàn)V期陽性表達(dá)率低于I～I(xiàn) I期，在復(fù)發(fā)鼻咽癌組織中表達(dá)低于初發(fā)鼻咽癌，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)低于無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05），而PDK1在鼻咽癌組織中呈高表達(dá)，在鼻咽癌復(fù)發(fā)、顱神經(jīng)侵犯、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中呈高表達(dá)（P＜0.05）。兩者與患者性別、年齡等無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

表1 鼻咽癌組織中SDHB和PDK1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PDK1和SDHB蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

圖5 SDHB蛋白陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組患者的生存曲線

圖6 PDK1蛋白陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組患者的生存曲線

生存分析（見圖5-6）顯示，SDHB陽性表達(dá)組患者的中位生存時間為59個月，陰性表達(dá)組為57個月，陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組3年、4年和5年生存率分別為96.8%、92.7%、38.2%和97.8%、71.5%、32.0%（P=0.018）；PDK1蛋白陽性表達(dá)組患者的中位生存時間為57個月，短于陰性表達(dá)組（60個月），3年、4年和5年生存率PDK1蛋白陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組分別為95.2%、80.1%、28.7%和97.2%、91.1%、42.4%（P=0.013）。多因素Cox回歸分析顯示，T分級（P=0.001）、臨床分期（P=0.023）、復(fù)發(fā)（P= 0.039）是影響鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，而SDHB（P=0.142）和PDK1（P=0.098）表達(dá)不能作為影響鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。

3 討論

SDH作為參與三羧酸循環(huán)的一個重要的催化酶，是反映線粒體功能的標(biāo)志酶之一。SDHB是SDH的催化亞基，其表達(dá)缺失可導(dǎo)致SDH活性的喪失，引起線粒體三羧酸循環(huán)功能障礙，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能量代謝紊亂。Fishbein等[1]在139例嗜鉻細(xì)胞瘤和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤惡變患者中發(fā)現(xiàn)有41%發(fā)生基因變異，最常見的突變基因就是SDHB。van Hulsteijn等[2]發(fā)現(xiàn)惡性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤患者中SDHB基因發(fā)生突變率要比SDHD高。Patterson等[3]應(yīng)用RT-PCR技術(shù)證明了SDHB基因突變可區(qū)分惡性和良性嗜鉻細(xì)胞瘤。Yang等[4]應(yīng)用RT-PCR技術(shù)和Western blot法通過檢測SDHB mRNA和蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)SDHB在嗜鉻細(xì)胞瘤和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。Matro等[5]發(fā)現(xiàn)SDHB可作為治療嗜鉻細(xì)胞瘤和家族性副神經(jīng)節(jié)瘤綜合征幾個有前景的靶基因之一，從非特異性治療模式轉(zhuǎn)向更具選擇性的分子靶向治療。

PDK是細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵限速酶丙酮酸脫氫酶（PDH）的調(diào)節(jié)酶，PDK1是PDK的一種同工酶。Fujiwara等[6]使用real-time PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)PDK1在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，表達(dá)程度與患者預(yù)后有關(guān)，抑制PDK1可以作為一種新的靶向治療手段。Hur等[7]認(rèn)為PDK-1可以作為胃癌患者預(yù)后不良的標(biāo)志物，此外，PDK抑制劑被認(rèn)為是治療PDK1高表達(dá)胃癌患者的另外選擇。Peifer等[8]認(rèn)為磷脂酰肌醇-3-羥激酶抑制劑、PDK同工酶抑制劑可能使抗乳腺癌藥物他莫昔芬有額外的效用，還討論了抑制PDK1通路有助于克服抗癌藥物產(chǎn)生耐藥的可能性。Wigfield等[9]利用RNAi下調(diào)PDK1，發(fā)現(xiàn)低氧16～48 h后的乳酸和丙酮酸排泄水平受到抑制，與不良預(yù)后密切相關(guān)（P＜0.005）。Yu等[10]用RT-PCR技術(shù)和Western blot法分析評估PDK1蛋白和mRNA的表達(dá)與下游Akt蛋白的磷酸化水平有關(guān)，PDK1可能與食管癌細(xì)胞凋亡、增殖和侵襲密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示SDHB在鼻咽癌組織中呈低表達(dá)，卻在鼻咽黏膜慢性炎癥組織中呈高表達(dá)。SDHB蛋白在復(fù)發(fā)鼻咽癌中的表達(dá)明顯低于初發(fā)鼻咽癌[11-12]；頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者低于無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，與患者性別、年齡等無顯著相關(guān)性。因此我們推測SDHB低表達(dá)不僅參與鼻咽癌的發(fā)展，還可能在腫瘤的復(fù)發(fā)中也發(fā)揮著重要作用。生存曲線顯示SDHB表達(dá)與鼻咽癌患者的生存時間有關(guān)，SDHB陽性表達(dá)組患者的中位生存時間為59個月，陰性表達(dá)組57個月，SDHB陽性表達(dá)生存率比SDHB陰性表達(dá)要高，因此可以認(rèn)為鼻咽癌患者SDHB低表達(dá)者預(yù)后較差。然而Cox回歸分析顯示，SDHB低表達(dá)不能作為影響鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)PDK1在鼻咽癌組織中呈高表達(dá)，PDK1蛋白在復(fù)發(fā)鼻咽癌中的表達(dá)明顯高于初發(fā)鼻咽癌；顱神經(jīng)麻痹表達(dá)陽性率明顯高于無顱神經(jīng)麻痹，頸部有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；與患者性別、年齡、臨床分期等無顯著相關(guān)性。生存時間分析結(jié)果顯示，PDK1蛋白陽性表達(dá)組患者的中位生存時間為57個月，短于陰性表達(dá)組的60個月，生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013）。Cox回歸分析顯示腫瘤T分級、臨床分期、復(fù)發(fā)是影響鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，PDK1高表達(dá)也不能作為影響鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。

近年來，能量代謝紊亂在腫瘤發(fā)生與演變過程中的作用及機(jī)制逐漸受到重視，通過干預(yù)能量代謝方式抑制腫瘤生長已經(jīng)成為腫瘤研究與治療的一個新的思路。我們分析，SDHB表達(dá)下調(diào)或PDK1表達(dá)上調(diào)，造成腫瘤細(xì)胞內(nèi)線粒體三羧酸循環(huán)的功能障礙及能量代謝發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致惡性腫瘤形成，同時還發(fā)現(xiàn)能量代謝紊亂可能與鼻咽癌預(yù)后有關(guān)。

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（本文編輯：胡苗苗）

Expressions of SDHB and PDK1 and their clinical significance in nasopharyngeal carcinoma

LIN Sen1,

CHEN Chongxi1, WANG Chunlei1, LIAO Zhisu2.1.Department of Otolaryngology, the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325200; 2.Department of Otolaryngology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To investigate the expressions of SDHB and PDK1 and their correlation with the clinicopathological factors and prognosis in nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods:Immunohistochemstry was employed to analyze the expressions of SDHB and PDK1 in 78 specimens of NPC and 35 specimens of chronic nasopharyngitis tissues (CNT). Retsults: SDHB expression detected in 39.7% of the cancer tissues was significantly lower than those in 62.9% of nasopharyngitis tissues (x2=5.183, P<0.05). While PDK1 expression detected in 53.8% of the cancer tissues was significantly higher than those in 20.0% of nasopharyngitis tissues (x2=11.269, P<0.05). SDHB and PDK1 expressions were significantly associated with lymph node metastasis, tumor recurrence, cranial nerve palsy. however, there was no significant association between the expression and gender, age. Kaplan-Meter survival analysis showed that the survival rates of positive SDHB expression and negative PDK1 expression were higher than that of negative SDHB expression and positive PDK1 expression. Multivariate Cox regression analysis showed that the development of NPC, lymph node metastasis and recurrence were independent prognostic factors for NPC, but the expressions of SDHB and PDK1 were not an independent factor.Conclusion:The expressions of SDHB and PDK1 play an important role in the development of NPC, lymph node metastasis and recurrence. SDHB and PDK1 expressions may have an impact on prognosis, but it was not independent factor affecting the prognosis in pafients with NPC.

nasopharyngeal neoplasms; succinate dehydrogenase subunit B; pyruvate dehydrogenase kinase 1; immunohistochemistry; prognosis

R766.3

A

1000-2138（2014）02-0091-04

2013-05-06

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20120022）；瑞安市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201203081）。

林森（1971-），男，浙江瑞安人，主治醫(yī)師，碩士。

廖志蘇，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：Liaozhisu111@163.com。