李春梅，鄭超，喬敏敏，呂建新，李偉

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

血清miR-146a/b實(shí)時(shí)熒光定量分析及其作為分子標(biāo)志物的初步評(píng)價(jià)

李春梅1，鄭超2，喬敏敏1，呂建新1，李偉1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 溫州 325027）

目的：以特異性調(diào)節(jié)Toll樣受體信號(hào)通路的miR-146a/b為檢測(cè)靶標(biāo)，建立血清miRNAs分子熒光定量檢測(cè)方法，并對(duì)其作為血清炎癥分子標(biāo)志物的潛在價(jià)值進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。方法：采集正常體質(zhì)量?jī)和?0例（對(duì)照組）、超重兒童血清20例（超重組）、肥胖兒童血清20例（肥胖組）及健康成年人血清50例（健康成人組），酚-氯仿法提取血清總RNAs，SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)定量檢測(cè)血清中miR-146a/ b拷貝數(shù)， Graphpad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖。結(jié)果：對(duì)照組血清中miR-146a的拷貝數(shù)顯著低于超重組（P=0.0061）和肥胖組（P=0.0262），超重組和肥胖組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0656）。miR-146a表達(dá)量的受試者工作特征曲線下面積（AUC）分析顯示：對(duì)照組vs超重組AUC=0.8475，P=0.0002；對(duì)照組vs肥胖組AUC=0.6050，P=0.2560；超重組vs肥胖組AUC=0.5475，P=0.6073。miR-146b與miR-146a呈不同表達(dá)趨勢(shì)，超重組兒童血清miR-146b拷貝數(shù)顯著高于對(duì)照組（P=0.0090）和肥胖組兒童（P=0.0023），肥胖組兒童血清中miR-146b的拷貝數(shù)均值雖略低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.1556）。miR-146b表達(dá)量的AUC分析顯示：正常組vs超重組AUC=0.7425，P=0.0087；正常組vs肥胖組AUC=0.6325，P=0.1517；超重組vs肥胖組AUC=0.7825，P=0.0023。miR-146a/b拷貝數(shù)值變異系數(shù)（CV）大：對(duì)照組、超重組和肥胖組兒童血清中miR-146a拷貝數(shù)的CV值分別為80.94%、110.94%、175.88%；miR-146b拷貝數(shù)的CV值分別為164.11%、189.72%、152.00%。在健康成人血清中miR-146a/b呈現(xiàn)相近表達(dá)模式，miR-146a和miR-146b的CV值分別是37.86%、74.82%。結(jié)論：miR-146a在對(duì)照組、超重組和肥胖組的表達(dá)量變化顯示其與兒童肥胖具有一定相關(guān)性，可以從整體水平說(shuō)明miR-146a與體內(nèi)炎癥水平呈正相關(guān)關(guān)系，但是由于其在血清中拷貝數(shù)值變異較大且各組間無(wú)明確分界，不能確定其參考值范圍。因此，血清miR-146a/b拷貝數(shù)差異不足以用于臨床個(gè)體化診斷，血清miR-146a/b作為炎癥相關(guān)分子標(biāo)志物的價(jià)值尚需進(jìn)一步探討。

兒童肥胖；炎癥；循環(huán)miRNAs；分子標(biāo)志物

成熟miRNAs是一類短鏈（19～25 nt）、非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于各物種中并高度保守。由細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)錄后經(jīng)核糖核酸酶III（Dorsha）剪切形成初級(jí)miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA進(jìn)入胞質(zhì)后可被Dicer酶進(jìn)一步剪切成雙鏈miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA中的一條單鏈可與RNA沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合形成成熟miRNA并參與mRNA表達(dá)的調(diào)控。此外，成熟miRNA還可與HDL結(jié)合或被囊泡包裹釋放至胞外，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)，這一類miRNA發(fā)揮著細(xì)胞間信號(hào)傳遞的作用，稱為循環(huán)miRNA[1]。釋放miRNA主要包括兩種機(jī)制：囊泡包裹和非囊泡包裹。囊泡包裹主要有外核體（exosomes）和微粒體（microvesicles）；非囊泡包裹是miRNA與RNA結(jié)合蛋白（Ago2，NPM1）或高密度脂蛋白（HDL）結(jié)合后被釋放至胞外[2]。由于存在囊泡和蛋白的保護(hù)，血清、唾液、尿液等體液中的miRNA非常穩(wěn)定，能常溫保存24 h，-20 ℃保存72 h，-80 ℃長(zhǎng)期保存，且能耐受酸堿環(huán)境，不易被RNase或DNase降解[3]。miRNAs因這些特征符合臨床檢驗(yàn)分子標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)[4-5]，而日益受到關(guān)注。

兒童肥胖正在全世界范圍流行，已成為重要的公共健康問(wèn)題。兒童肥胖可引起一系列如胰島素抵抗、高血壓、脂代謝紊亂、高胰島素血癥等嚴(yán)重并發(fā)癥，并增加了成人患病和死亡的風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。肥胖誘導(dǎo)的慢性低度炎癥是導(dǎo)致肥胖患者發(fā)生胰島素抵抗、糖尿病、心血管疾病的主要原因，但具體機(jī)制尚不明確。其中，Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路是機(jī)體慢性低度炎癥相關(guān)信號(hào)通路中的重要組成部分。TLR4炎癥信號(hào)通路中的白介素-1受體相關(guān)激酶（interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK1）和TNF相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor，TRAF6）是miR-146a/b的調(diào)節(jié)靶標(biāo)并參與肥胖誘導(dǎo)炎癥促進(jìn)胰島素抵抗和血管病變的過(guò)程[8-9]。因此，本研究采用SYBR實(shí)時(shí)熒光定量法，比較肥胖、超重和對(duì)照組兒童血清中miR-146a/b表達(dá)量的差異，建立適用于檢測(cè)血清miRNAs表達(dá)量的方法，尋找可以評(píng)估肥胖兒童炎癥水平的血清分子標(biāo)志物。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象選取2011年7月至2011年8月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院6～14歲體檢兒童血清樣本60例，其中對(duì)照組、超重組、肥胖組各20例。超重與肥胖的判斷依據(jù)：脫外衣和鞋帽后測(cè)量身高、體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)[BMI，即體質(zhì)量（kg）/身高2（m2）]，參照《中國(guó)學(xué)齡兒童青少年超重、肥胖篩查體重指數(shù)值分類標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行分組[10]，所有診斷肥胖的病例均為單純性肥胖。健康成年人血清標(biāo)本（50例）來(lái)源于2012年1月溫州市體檢中心體檢人群。所有樣本均排除急性感染、腫瘤、應(yīng)激及其他免疫性疾病，既往無(wú)高血壓、糖尿病、心血管病史。取空腹靜脈血2 mL至血清分離管，3500 g離心5 min，分離新鮮血清，-80 ℃保存，備用。本研究采用病例對(duì)照研究，并通過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有兒童組研究對(duì)象由監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書，健康成年人研究對(duì)象由本人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 miRNA提取[3]：所有耗材均為RNAase-free耗材（美國(guó)Axygen）。血清冰上融解，取1.5 mL EP管，先后加入300μL DEPC水、100μL血清，充分混勻，加入200μL酸性酚（美國(guó)sigma-aldrich，P4682），充分混勻，加入200μL氯仿（分析純），充分混勻后16000 g室溫離心15 min，取上清至已加入800μL異丙醇的新1.5 mL EP管中，再加入40μL 3 mol/L醋酸鈉（pH 5.2，自備），混勻后-20 ℃靜置1 h，16000 g 4 ℃離心20 min，棄上清，加入1 mL 70%乙醇（4 ℃預(yù)冷），顛倒三次，16000 g 4 ℃離心20 min，棄上清，室溫干燥，20μL DEPC水溶解，-80 ℃保存，備用。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量模板濃度的優(yōu)化：使用Prime-Script?RT reagent Kit（Perfect Real Time）（大連寶生物公司）和miRNA-specific stem loop RT primers（廣州銳博生物公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。分別取待測(cè)樣本的RNA 1μL、2μL、3μL做反轉(zhuǎn)錄，0.2μL RT-Pirmer（5μmol/L），5×RT-Buffer 2μL，RT-Enzyme 0.5μL，RNase-free H2O補(bǔ)至10 μL，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。SYBR?Premix Ex TaqTMII（Perfect Real Time）（大連寶生物公司）和miRNA-specific primers（廣州銳博生物公司）用于檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中相應(yīng)miRNA的表達(dá)量。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5μL做PCR，正反向特異性引物（5 μmol/L）各1.5μL，SYBR Premix Ex TaqTMII（2 ×）12.5μL，ROX Reference Dye（50×）0.5μL，RNase-free H2O補(bǔ)至25μL。StepOne plus System熒光定量檢測(cè)儀（ABI）進(jìn)行定量測(cè)定miRNA表達(dá)量，95 ℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min；取Ct值在18～35的樣本量為最適樣本量。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及miRNA拷貝數(shù)計(jì)算：取已知miRNA拷貝數(shù)為6.02×1011的樣本為標(biāo)準(zhǔn)品，按10倍濃度稀釋，將梯度2～10的樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，以確定其線性范圍。最后取Ct值在18～35范圍的5個(gè)梯度（6.02 ×108，6.02×107，6.02×106，6.02×105，6.02 ×104）的標(biāo)準(zhǔn)品作為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣本。取各梯度標(biāo)準(zhǔn)品1μL，RT-Pirmer（5μmol/L）0.2μL，5 ×RT-Buffer 2μL，RT-Enzyme 0.5μL， RNase-free H2O補(bǔ)足10μL， 42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min 。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做10倍稀釋后用于熒光定量檢測(cè)，稀釋后反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5μL，正反向特異性引物（5μmol/L）各1.5μL，SYBR Premix Ex TaqTMII（2×）12.5 μL，ROX Reference Dye（50×）0.5μL，RNasefree H2O補(bǔ)足25μL，95 ℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)：95℃ 5 s，60 ℃ 1 min ；溶解曲線分析：95 ℃ 15 s，70 ℃ 1 min 0.4 ℃/s，95 ℃ 15 s。將各梯度標(biāo)準(zhǔn)品的已知拷貝數(shù)和相應(yīng)Ct值作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的位置獲得相應(yīng)樣本的cDNA拷貝數(shù)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，每一批實(shí)驗(yàn)均有未進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的空白對(duì)照，以確保PCR產(chǎn)物不是來(lái)源于DNA?？瞻讓?duì)照孔在實(shí)驗(yàn)中均沒(méi)有檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)。并用StepOne Software v2.1定量分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。因所有受試者的臨床基本資料（年齡、體質(zhì)量指數(shù)、空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、HDL、LDL、空腹胰島素）除性別外均呈近似正態(tài)分布，以“±SEM”表示，組間差異比較采用單因素方差分析及多重比較分析。miRNAs拷貝數(shù)經(jīng)對(duì)數(shù)變換后為正態(tài)或近似正態(tài)分布，組間差異采用非配對(duì)t檢驗(yàn)和Mann-Whitney檢驗(yàn)分析，并計(jì)算各組miRNAs拷貝數(shù)變異系數(shù)（CV值）。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象臨床基本資料60例兒童血清樣本來(lái)源于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院體檢兒童，50例健康成人樣本來(lái)源于溫州市體檢中心體檢人群。血清處理方式按照醫(yī)院常規(guī)進(jìn)行，全自動(dòng)生化分析儀（雅培c8000）測(cè)得空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、HDL、LDL和空腹胰島素水平。超重組和肥胖組的體質(zhì)量指數(shù)較對(duì)照組均有顯著升高（P＜0.01），肥胖組較超重組有顯著升高（P＜0.05），符合分組標(biāo)準(zhǔn)；LDL檢測(cè)結(jié)果顯示超重組和肥胖組較對(duì)照組有顯著升高（P＜0.05），而超重組和肥胖組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肥胖組的空腹胰島素水平顯著高于對(duì)照組和超重組（P＜0.05），對(duì)照組和超重組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示肥胖組兒童有發(fā)生胰島素抵抗的趨勢(shì)（見(jiàn)表1）。

表1 各組血清樣本臨床基本資料（±SEM）

表1 各組血清樣本臨床基本資料（±SEM）

與對(duì)照組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與超重組比：cP＜0.05

組別對(duì)照組超重組肥胖組健康成人組年齡（歲）9.20±0.44 9.50±0.41 8.75±0.46 49.22±1.40體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）16.05±0.40ac20.82±0.41bc23.27±0.80ac21.61±0.34ac總膽固醇（mmol/L）3.98±0.18 4.30±0.22 4.62±0.12 4.38±0.09男16 18 17 26女4 2 3 2 4性別n 20 20 20 50空腹血糖（mmol/L）5.12±0.07 5.12±0.07 4.95±0.07 5.23±0.95甘油三酯（mmol/L）1.09±0.10 1.15±0.22 1.65±0.39 0.93±0.04 LDL（mmol/L）2.07±0.19d2.60±0.20a2.70±0.12a2.21±0.08dHDL（mmol/L）1.45±0.05 1.26±0.04 1.33±0.07 1.54±0.04胰島素抵抗指數(shù)1.63±0.17b2.15±0.26b2.59±0.26b-空腹胰島素（mU/L）7.10±0.72 9.85±0.99c14.44±2.13bc-

2.2 miR-146a/b實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)取Ct值范圍為18～35的5個(gè)已稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品（6.02×108，6.02× 107，6.02×106，6.02×105，6.02×104）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量檢測(cè)，以各梯度標(biāo)準(zhǔn)品的已知初始拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使所有點(diǎn)都在同一直線上。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的位置得出斜率，R2值及擴(kuò)增效率。標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足斜率為-3～-3.5，R2值在0.99以上，擴(kuò)增效率為90%～120%時(shí)，認(rèn)為此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。根據(jù)樣品Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的位置獲得相應(yīng)cDNA的初始拷貝數(shù)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，取其平均拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)變換值用于統(tǒng)計(jì)分析，并計(jì)算各組miRNAs拷貝數(shù)CV值，結(jié)果見(jiàn)表2?？截悢?shù)平均值做對(duì)數(shù)變換后符合正態(tài)或近似正態(tài)分布，用Graphpad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)照組血清中miR-146a的拷貝數(shù)顯著低于超重組（P=0.0061）和肥胖組（P=0.0262），超重組和肥胖組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0656）（見(jiàn)圖1）。miR-146a表達(dá)量的受試者工作特征曲線下面積（AUC）分析顯示：對(duì)照組vs超重組AUC= 0.8475，P=0.0002；對(duì)照組vs肥胖組AUC=0.6050，P=0.2560；超重組vs肥胖組AUC=0.5475，P=0.6073。miR-146b與miR-146a呈不同表達(dá)趨勢(shì)，超重組兒童血清miR-146b拷貝數(shù)顯著高于對(duì)照組（P=0.0090）和肥胖組兒童（P=0.0023），肥胖組兒童血清中miR-146b的拷貝數(shù)均值雖略低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.1556）（見(jiàn)圖1）。miR-146b表達(dá)量的AUC分析顯示：對(duì)照組vs超重組AUC=0.7425，P= 0.0087；對(duì)照組vs肥胖組AUC=0.6325，P=0.1517；超重組vs肥胖組AUC=0.7825，P=0.0023（見(jiàn)圖2）。

表2 血清miR-146a/b拷貝數(shù)均值及其CV值

圖1 兒童血清miR-146a/b表達(dá)量

此外，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)miR-146a/b拷貝數(shù)CV大：對(duì)照組、超重組和肥胖組兒童血清中miR-146a拷貝數(shù)的CV值分別為80.94%、110.94%、175.88%；miR-146b拷貝數(shù)的CV值分別為164.11%、189.72%、152.00%。健康成人組血清中miR-146a/b的表達(dá)也較分散，miR-146a和miR-146b的CV值分別是37.86%、74.82%（見(jiàn)表2）。我們同時(shí)用相同方法檢測(cè)了健康成人血清中miR-301a的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量的CV值為13.31%。因此，我們認(rèn)為血清中miR-146a/b的表達(dá)量分布范圍廣是由于其個(gè)體表達(dá)量差異大所致。

圖2 兒童血清miR-146a/b表達(dá)量AUC分析

3 討論

自miRNAs被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，對(duì)于其功能及作用機(jī)制的研究日益深入。近幾年將其作為特異組織或疾病的生物標(biāo)志物的研究越來(lái)越多，尤其是發(fā)現(xiàn)它們能穩(wěn)定存在于血清/血漿中后，已成為生物標(biāo)志物的研究熱點(diǎn)。血清中miRNAs的變化與多種人類疾病如急性心肌梗死[11]、充血性心衰[12]、藥物性肝損傷[13]及多種腫瘤[14-17]相關(guān)，其表達(dá)的上調(diào)或降低具有協(xié)助疾病診斷的潛在價(jià)值。

慢性低度炎癥是導(dǎo)致肥胖患者發(fā)生胰島素抵抗的主要原因，通過(guò)抑制炎癥治療可以改善肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗[18-19]。其中，TLR4功能性缺失能避免小鼠產(chǎn)生肥胖誘導(dǎo)的炎癥和胰島素抵抗[20]。TLR4介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路是機(jī)體產(chǎn)生慢性低度炎癥相關(guān)信號(hào)通路中的重要組成部分，而且已有研究證實(shí)TLR4信號(hào)通路下游的關(guān)鍵分子IRAK1和TRAF6是miR-146a/b的調(diào)節(jié)靶標(biāo)。因此，循環(huán)miR-146a/b表達(dá)量的變化具有反映體內(nèi)炎癥水平的潛在價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-146a在對(duì)照組、超重組和肥胖組血清中的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，從整體水平上說(shuō)明miR-146a/b的表達(dá)量會(huì)隨炎癥狀態(tài)變遷而改變（見(jiàn)圖1）。此外，miR-146a/b表達(dá)量個(gè)體差異大，并且成人血清中miR-146a/b和miR-301a的表達(dá)模式（見(jiàn)圖2）也進(jìn)一步證實(shí)，miR146a/b不論是在成人還是兒童血清中個(gè)體差異均較大，組間無(wú)顯著上調(diào)或降低的表現(xiàn)。雖然ROC曲線發(fā)現(xiàn)miR-146a/b對(duì)區(qū)分對(duì)照組和超重組具有一定意義，但是考慮到樣本量較少，miR-146a/ b用于臨床個(gè)體化診斷分子標(biāo)志物的價(jià)值尚需進(jìn)一步探討。

在應(yīng)用miRNAs作為疾病診斷的生物標(biāo)志物前，需考慮不同樣本類型、不同檢測(cè)方法、個(gè)體差異、miRNA穩(wěn)定性和溶血因素的影響，否則即使檢測(cè)結(jié)果有顯著差異也不能用于臨床檢測(cè)。首先是樣本類型，我們選用血清作為檢測(cè)樣本，增加了檢測(cè)的可信度和穩(wěn)定性。雖然有報(bào)道稱血清與血漿中miRNA的含量無(wú)明顯差異[21]，但也有報(bào)道說(shuō)明血漿中miRNA含量高于血清[22]。由于紅細(xì)胞和血小板中含有大量miRNAs[23-25]，血漿中所檢測(cè)到的miRNA大部分是來(lái)源于血小板，將血漿中細(xì)胞碎片和血小板離心去除后，檢測(cè)結(jié)果和血清無(wú)明顯差異。同時(shí)，細(xì)胞碎片和血小板的存在會(huì)增加個(gè)體之間的差異使檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性差，并不能說(shuō)明miRNA表達(dá)量與疾病相關(guān)，相較而言血清的檢測(cè)結(jié)果更穩(wěn)定。其次是miRNA的檢測(cè)過(guò)程，包括miRNA的提取和RT-PCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是定量檢測(cè)基因表達(dá)的金標(biāo)準(zhǔn)，Stem-loop RT引物較傳統(tǒng)的線性引物具有更好的特異性和敏感性[26]。本研究采用miRNA-specific stem-loop RT primers進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行血清miRNA定量檢測(cè)，增加了檢測(cè)的靈敏度和特異性。第三是分析方法，由于血清中沒(méi)有miRNA合適的內(nèi)參基因，本研究采用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析方法。此前有研究使用miR-16作為內(nèi)參進(jìn)行miRNA表達(dá)量分析[27]，但后期研究發(fā)現(xiàn)血清miR-16含量易受溶血影響，并且在不同疾病狀態(tài)下miR-16含量亦有所變化[22，28]，因此miR-16不適于用作內(nèi)參基因。此外，我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA定量結(jié)果與Nanodrop2000（Thermo Scientific）所測(cè)miRNA濃度沒(méi)有相關(guān)性，所以本研究不再統(tǒng)一反轉(zhuǎn)錄模板中miRNA濃度，而換以體積比進(jìn)行比較，即提取miRNAs樣本量均為100μL，反轉(zhuǎn)錄體系中亦加入同體積模板。目前影響檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性的主要步驟是miRNAs的提取過(guò)程，本研究采用酚-氯仿法抽提血清miRNA，加入已知拷貝數(shù)的外源性miRNA后進(jìn)行miRNA提取和定量檢測(cè)，結(jié)果表明在技術(shù)員操作純熟的條件下可以將操作誤差降到最低，可以忽略其對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。miRNA檢測(cè)方法目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)，還需進(jìn)一步完善，但本實(shí)驗(yàn)為血清miRNA的檢測(cè)提供了一個(gè)可供參考的方法。

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（本文編輯：吳健敏）

Analysis of serum miR-146a/b by real-time fluorescent quantitative PCR and its preliminarily evalua-tion as biomarker

LI Chunmei1, ZHENG Chao2, QIAO Minmin1, LV Jianxin1, LI Wei1.
1.School of Labo-ratory Medicine and Life Sciences, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Medical Genetics, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Endocrinology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To establish method for the quantitative fluorescence detection of serum miRNAs, and to preliminarily evaluate the potential value of miR-146a/b as serum inflammatory biomarkers. Using serum miR-146a/b, specifically regulating the Toll-like receptor signalling pathway, as the targets.Methods:Serum samples were collected from 20 cases of normal weight children (control group), 20 cases of overweight children (overweight), 20 cases of obese children (obese group) and 50 cases of healthy adults (healthy adult group). Serum total RNAs were extracted by phenol-chloroform extracting methods, copy numbers of serum miR-146a/b were analyzed by SYBR Green real-time fluorescent quantitative PCR techniques, followed by statistical analysis using Graphpad Prism5.0 software and graphics.Results:Copy numbers of serum miR-146a in control group were significantly lower than that in overweight (P=0.0061) and obese groups (P=0.0262), whereas no significantdifference was found between overweight group and obesity group (P=0.0656). Area under the ROC curves (AUC) of miR-146a expression in different groups showed as follows: control group vs overweight group AUC=0.8475, P=0.0002; control group vs obese group AUC=0.6050, P=0.2560; overweight group vs obese group AUC=0.5475, P=0.6073. Expression of miR-146b and miR-146a exhibited different trends, copy numbers of serum miR-146b in overweight children were significantly higher than that of normal weight children (P=0.0090) and obese children (P=0.0023); even though the copy numbers of serum miR-146b in obese children were slightly lower than that in control group, the difference had no statistically significant (P=0.1556). The area under the ROC curves (AUC) of miR-146b expression were analyzed as shown in following data: normal group vs overweight group AUC=0.7425, P=0.0087; normal group vs obese group AUC=0.6325, P=0.1517; overweight group vs obese group AUC=0.7825, P=0.0023. The coefficient of variation (CV) values of miR-146a/b copy numbers was largely diverse: CV values of miR-146a copy numbers in control, overweight and obese children were 80.94%, 110.94% and 175.88%, respectively; and that of miR-146b copy numbers were 164.11%, 189.72% and 152.00%, respectively. In healthy adults, the expression patterns of serum miR-146a/b were similar; CV values of miR-146a and miR-146b were 37.86% and 74.82%. Conlusion: The different expression levels of miR-146a in control, overweight and obese groups indicate that miR-146a is correlated with childhood obesity and positively correlated with levels of inflammation in the body. However, the reference range of miR-146a could not be determined on account of its widely varied serum copy numbers and no clear dividing line among different groups. Therefore, the difference of serum miR-146a/b copy number is insufficient to be used in clinical diagnosis, the values of serum miR-146a/b as biomarkers of inflammation still need to be explored further.

obese children; inflammation; circulation miRNAs; molecular biomarkers

R331

A

1000-2138（2014）01-0001-07

2013-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（H0713）；溫州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（Y20080120）。

李春梅（1986-），女，四川自貢人，碩士生。

李偉，副教授，碩士生導(dǎo)師，Email：liweigzh@gmail.com。