梁 杰， 武子涵， 黃 蓓

(安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 230601)

目前，有害藻類(lèi)引起的水體富營(yíng)養(yǎng)化、水華已成為國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注的環(huán)境問(wèn)題，其中微囊藻水華是淡水水體中危害最嚴(yán)重的一類(lèi)[1-2]。殺蟲(chóng)劑在農(nóng)林病蟲(chóng)害防治方面發(fā)揮重要作用，但是由于化學(xué)農(nóng)藥本身的限制及不合理使用，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染[3-5]。光活化殺蟲(chóng)劑是最近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新型農(nóng)藥，它具有高效、低毒等特點(diǎn)[6-8]。目前，比較有效的光敏劑有染料類(lèi)如赤蘚紅B，噻吩類(lèi)如α-三噻吩4，卟啉類(lèi)如血卟啉甲醚，生物堿類(lèi)如呋喃喹啉堿等[9]。其中用于光活化殺蟲(chóng)劑研究的光敏劑主要有卟啉類(lèi)、咕噸染料、植物源光毒素等[10]。MC-PBP提取自微囊藻，其主要功能是輔助色素能提高光合作用的電子傳遞效率。MC-PBP在光照后能產(chǎn)生活性氧等自由基，產(chǎn)生光活化作用，是一種潛在的光敏劑[11-12]。

本文探討了MC-PBP光活化作用對(duì)果蠅(Drosophilamelanogaster)的半數(shù)致死濃度和致死劑量；通過(guò)研究MC-PBP對(duì)草地夜蛾卵巢細(xì)胞SpodopteaFrugiperda21 (SF21)的增殖抑制率、細(xì)胞內(nèi)丙二醛(malondialdehyde, MDA)的生成量、細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH) 水平變化的影響，研究MC-PBP光敏殺蟲(chóng)劑的作用和機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

草地夜蛾卵巢細(xì)胞SpodopteaFrugiperda21 (SF21)由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)蔡剛實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。果蠅(Drosophilamelanogaster)由安徽大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供。

MTT(溴化二甲噻唑二苯四氮唑)購(gòu)于美國(guó)sigma公司；吖啶橙、異丙醇、甲醇、酵母粉、玉米粉、瓊脂、蔗糖、硫代巴比妥酸(TBA)、5，5′-二硫代雙-(2-硝基)苯甲酸( DTNB)、血卟啉甲醚(HMME)等購(gòu)于合肥博美生物公司。

溶劑A 的配制：稱(chēng)取3 g SDS 溶于100 mL 異丙醇中, 用1 mol/L HCl 調(diào)pH 值至4.5, 置4℃ 冰箱中待用。

TBA-TCA-HCl溶液：用0.125 mol/L 鹽酸配制16.8% TCA 溶液，將41.6 mg 硫代巴比妥酸(TBA) 溶于10 mL TCA-HCl溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MC-PBP的提取

采集自巢湖的微囊藻，曬干粉碎過(guò)350目篩后低溫干燥保存。稱(chēng)取一定量的干藻粉破壁、離心、重懸、硫酸銨沉淀、PBS透析，通過(guò)光譜和色譜檢測(cè)其純度。

1.2.2 MC-PBP對(duì)果蠅的光活化毒殺作用

試驗(yàn)設(shè)置A組 (實(shí)驗(yàn)組)和B組 (對(duì)照組)，每組MC-PBP濃度為0～4000 μg/mL。同時(shí)選取已報(bào)道的光敏劑HMME做為對(duì)照試驗(yàn)，設(shè)置C組(實(shí)驗(yàn)組)，D組(對(duì)照組)，濃度梯度同上。每管接入20只羽化4 d的果蠅，黑暗條件下，25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

果蠅培養(yǎng)48 h之后，將A組和C組置于自然光下平均光照強(qiáng)度47.5 klux光照累計(jì)時(shí)間90 min。B組和D組對(duì)照組在黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，光照后計(jì)數(shù)A、 B、C和D組每孔線蟲(chóng)存活的個(gè)體數(shù)，移入黑暗處24 h后再次計(jì)數(shù)。計(jì)算死亡率和半數(shù)致死濃度LC50。

1.2.3 MC-PBP對(duì)SF21細(xì)胞增殖的影響

本實(shí)驗(yàn)以MTT 法測(cè)定細(xì)胞活力。試驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，MC-PBP濃度為0～400 μg/mL，將實(shí)驗(yàn)組置于自然光下平均光照強(qiáng)度47.5 klux光照累計(jì)時(shí)間90 min，而對(duì)照組在黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)相同時(shí)間。實(shí)驗(yàn)組在光照90 min之后，與對(duì)照組在黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h之后, 每孔加入10 μL 5 mg/mL 的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入100 μL溶劑A, 酶標(biāo)儀上測(cè)定OD575值，求出細(xì)胞存活率。

1.2.4 MC-PBP處理后細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA) 生成量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)以TBA 法測(cè)定MDA生成量。實(shí)驗(yàn)分組、MC-PBP濃度和光照強(qiáng)度及時(shí)間同1.2.3。實(shí)驗(yàn)組在光照后，與對(duì)照組在黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h之后,加入2 mL TBA-TCA-HCl溶液，水浴、離心，取上清液在535 nm 處比色。計(jì)算MDA生成量。

1.2.5 MC-PBP處理后細(xì)胞內(nèi)GSH相對(duì)含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)以5，5′-二硫代雙-(2-硝基)苯甲酸( DTNB) 法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH 的相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)分組、MC-PBP濃度和光照強(qiáng)度及時(shí)間同1.2.3。實(shí)驗(yàn)組在光照后，與對(duì)照組在黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h之后，加入0.25 mL 的DTNB 溶液，10 min 后在420 nm 處比色。計(jì)算細(xì)胞內(nèi)GSH 的相對(duì)含量。

圖1 微囊藻藻膽蛋白光譜圖Fig 1 MC-PBP scanned with a full spectrum from 200 nm to 700 nm

圖2 微囊藻藻膽蛋白純度的檢測(cè)Fig 2 The purity of MC-PBP determined by HPLC

2 結(jié)果與分析

2.1 MC-PBP純度的檢測(cè)

MC-PBP在200～700 nm進(jìn)行光譜掃描，MC-PBP在620 nm處有一個(gè)吸收峰(圖1)，而且 A620 / A280的比率是1.6。為檢測(cè)提取的MC-PBP是否含有藻毒素，本實(shí)驗(yàn)用高效液相色譜的方法檢測(cè)。圖2所示，在238 nm處，標(biāo)準(zhǔn)品藻毒素出現(xiàn)峰值時(shí)間為3.332 min(紅色曲線)，而MC-PBP出現(xiàn)峰值時(shí)間是在4.477 min(藍(lán)色曲線)。由此可知本實(shí)驗(yàn)所用MC-PBP不含藻毒素。

2.2 MC-PBP對(duì)果蠅的光活化毒殺效果

本實(shí)驗(yàn)選取光敏劑HMME作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。HMME是國(guó)內(nèi)研發(fā)的第2代光敏劑，與第1代光敏劑photofrinⅡ(混合物，主要含血卟啉)[13]相比它的優(yōu)點(diǎn)是選擇性更高、效應(yīng)更強(qiáng)、毒性低而且避光時(shí)間更短[14]。目前，HMME主要作為光動(dòng)力藥物投入使用以治療人體腫瘤疾病[15-16]和用作殺蟲(chóng)劑[17-18]。如圖所示：與不光照的對(duì)照組(圖3，B組)相比，A組隨著MC-PBP濃度升高，其死亡率不斷升高，且果蠅的LC50為750 μg/mL，致死劑量為4000 μg/mL(圖3，A組)；與D組相比，C組在0～4000 μg/mL范圍內(nèi)，HMME對(duì)果蠅的毒殺作用與其濃度成正相關(guān)且果蠅的LC50為1000 μg/mL(圖3，C組)。與C組相比，A組即在相同濃度下，MC-PBP對(duì)果蠅的毒殺效果較HMME毒殺效果更好(圖3)。

圖3 微囊藻藻膽蛋白及血卟啉甲醚對(duì)果蠅光活化作用Fig 3 MC-PBP and HMME photoactivate for Drosophila melanogaster

2.3 MC-PBP對(duì)草地夜蛾卵巢細(xì)胞SF21的作用

在細(xì)胞及分子水平探討MC-PBP光敏劑的毒殺機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)選擇具代表性的害蟲(chóng)草地夜蛾的卵巢細(xì)胞SF21為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在自然光光照強(qiáng)度47.5 klux，光照時(shí)間90 min，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。圖4所示，在MC-PBP濃度0～400 μg/mL時(shí)，隨著MC-PBP濃度的升高，對(duì)細(xì)胞的殺傷率增加。光照處理后24 h，400 μg/mL的MC-PBP對(duì)細(xì)胞的抑制作用達(dá)到45%(圖4 A)； 48 h之后，400 μg/mL的MC-PBP對(duì)細(xì)胞的抑制作用達(dá)到65%(圖4 B)，有顯著性效果(*P<0.05)。

2.4 MC-PBP處理后SF21細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA) 生成量

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物之一， 其生成量反映了細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。本實(shí)驗(yàn)以TBA 法測(cè)定MDA生成量。

圖4 藻膽蛋白對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞SF21的作用Fig 4 Photoactivated toxicity of MC-PBP on SF21

圖5 藻膽蛋白光敏作用對(duì)SF21細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA) 生成量的影響Fig 5 Determination of malondialdehyde content in Sf21 cells

圖5可知, 在MC-PBP濃度0～400 μg/mL范圍內(nèi)， SF21細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯升高，且MDA的生成量與其濃度呈正相關(guān)。光照24 h之后，MC-PBP濃度在400 μg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)MDA含量為86.79 nmol/L (圖5 A)，光照48 h之后，細(xì)胞內(nèi)MDA含量達(dá)到137 nmol/L (圖5 B)，有顯著性效果。不同濃度MC-PBP處理細(xì)胞后, 對(duì)照組與光照組MDA生成量具有顯著性差異(**P<0.01)。

2.5 MC-PBP處理后細(xì)胞內(nèi)GSH相對(duì)含量

細(xì)胞內(nèi)的還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)具有中和自由基、抗氧化的特性，其含量能直接說(shuō)明細(xì)胞抗氧化損傷的能力。

圖6可知, 光活化后的MC-PBP處理SF21細(xì)胞能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)還原型GSH相對(duì)含量隨MC-PBP濃度升高而顯著降低。光照24 h之后，MC-PBP濃度在400 μg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)GSH相對(duì)含量降低42% (圖6 A), 光照48 h之后，細(xì)胞內(nèi)GSH相對(duì)含量則降低53% (圖6 B)。由圖可知隨藻膽蛋白濃度升高, 細(xì)胞的抗氧化能力逐漸減弱。MC-PBP濃度相同時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著性差異(*P<0.05)。

圖6 藻膽蛋白處理后，SF21細(xì)胞內(nèi)GSH相對(duì)含量Fig 6 Determination of GSH relative content in Sf21 cells

3 討論

藻膽蛋白是重要的捕光色素蛋白，在光照時(shí)下，當(dāng)存在合適的電子供體或電子受體，它能給出電子，產(chǎn)生自由基[19-21]。大量的自由基能夠影響脂質(zhì)的過(guò)氧化和GSH的抗氧化能力[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，光活化后的MC-PBP使細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯增加, 還原型GSH水平減少， 表明激發(fā)態(tài)的MC-PBP損傷SF21細(xì)胞是與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化和SF21細(xì)胞抗氧化損傷能力的減弱有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MC-PBP比HMME的效果要好，可能是因?yàn)镸C-PBP較血啉甲醚對(duì)光有更寬的吸收范圍[10]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MC-PBP對(duì)果蠅和SF21細(xì)胞光活化作用的研究，闡述了MC-PBP光敏殺蟲(chóng)劑的毒殺機(jī)制；MC-PBP提取自微囊藻，不僅能讓微囊藻變廢為寶，而且能減少淡水水體富營(yíng)養(yǎng)化和水華現(xiàn)象，還能克服化學(xué)農(nóng)藥帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題和耐藥性問(wèn)題。

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