崔海忠， 肖 娜， 張永平， 陳大貴， 唐一通, 趙雪紅, 邵金輝

(1. 湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院 棗陽(yáng)臨床學(xué)院, 棗陽(yáng) 441200； 2. 湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院 分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 襄陽(yáng) 441053)

單核苷酸的多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是最為常見的一種遺傳多態(tài)性，占現(xiàn)有多態(tài)性的的90%以上?，F(xiàn)有公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)報(bào)道了超過(guò)900萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)[1]。開展SNP研究對(duì)醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與合理用藥、遺傳學(xué)、臨床診斷等的發(fā)展均有非常重要的意義[2]。SNP分型檢測(cè)工作，已成為當(dāng)前國(guó)際上研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，SNP檢測(cè)方法和相關(guān)儀器的研發(fā)進(jìn)展很快。目前，有20余種的SNP分型方法，如直接測(cè)序，PCR-RFLP[3-4]，PCR-SSCP[5], Real-Time PCR[6-7], TaqMan PCR[8], Allele-Specific Extension[9-10], Pyrosequencing[11-12], Mass Spectrometry[13-14], Ligase Detection Reaction[15-17]等。其中，直接測(cè)序法是傳統(tǒng)的序列測(cè)定的方法，但是由于檢測(cè)靈敏度較低，在對(duì)不均一樣本進(jìn)行突變等位基因測(cè)定時(shí)具有較大局限性。雖然焦磷酸測(cè)序、熒光定量PCR以及質(zhì)譜等方法具有較高的檢測(cè)靈敏度，但是由于這些方法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)條件要求很高，因此很少應(yīng)用于一般實(shí)驗(yàn)條件下的常規(guī)臨床檢測(cè)。本研究中建立了一種基于連接酶-ELISA的SNP分型新方法，并以在非小細(xì)胞肺癌酪氨酸激酶抑制劑藥物個(gè)體化治療中的生物標(biāo)記基因表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)有較高突變頻率的EGFR基因外顯子21和18的EGFR, c.2573T>G(L858R), EGFR, c.2582T>A(L861Q) 和 EGFR, c.2155 G>T(G719C)3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒模板：攜帶有野生型和突變型等位基因的EGFR, c.2573T>G(L858R), EGFR, c.2582T>A(L861Q) 和 EGFR, c.2155 G>T(G719C)3個(gè)SNP位點(diǎn)的質(zhì)粒DNA。以黃杰[18]定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建。

圖1 檢測(cè)探針設(shè)計(jì)示意圖?！癏1”, “H2”, “Tag1”, “Tag2”代表探針的不同組成部分。

寡核苷酸檢測(cè)探針：探針設(shè)計(jì)方法如圖1所示，利用3條寡核苷酸探針對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。3條探針?lè)謩e為上游的兩條特異性檢測(cè)探針和下游的一條公用探針，兩條特異性探針的5′端序列為一段通用擴(kuò)增引物序列Tag1，3′端序列與模板上SNP位點(diǎn)一側(cè)的序列互補(bǔ)，且3′端最后一個(gè)堿基與突變位點(diǎn)所在堿基對(duì)應(yīng)互補(bǔ)，與野生型等位基因互補(bǔ)的為野生型檢測(cè)探針(Wild Type-Probe)，與突變型等位基因互補(bǔ)的為突變型檢測(cè)探針(Mutation Type-Probe)，且特異性探針的5′端進(jìn)行生物素修飾。公用探針的5′端序列與SNP位點(diǎn)另一側(cè)序列互補(bǔ)，3′端序列為一段通用擴(kuò)增引物序列Tag2。 對(duì)EGFR, c.2573T>G(L858R), EGFR, c.2582T>A(L861Q) 和 EGFR, c.2155 G>T(G719C)3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的探針序列如表1所示。

表1 寡核苷酸檢測(cè)探針序列

實(shí)驗(yàn)試劑：2×PCR Mastermix購(gòu)自天根生化科技北京有限公司，Low MW DNA Marker-A購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司，TaqDNA ligase購(gòu)自New England BioLabs，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗地高辛抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，Streptavidin 磁珠購(gòu)自西安金磁納米生物技術(shù)有限公司。TaKaRaExTaq酶、TA 克隆試劑盒為寶生物工程( 大連) 有限公司產(chǎn)品。所有核酸序列均合成自上海生工生物有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 連接和擴(kuò)增反應(yīng)

連接反應(yīng)：每個(gè)SNP檢測(cè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)兩個(gè)反應(yīng)管，分別標(biāo)記為WT、MT，分別加入5 fmol 的重組質(zhì)粒DNA模板序列、1 U的Taqligase和3 μL 10×連接反應(yīng)緩沖液，WT管中對(duì)應(yīng)加入50 fmol野生型特異性檢測(cè)探針和公用檢測(cè)探針，MT管中加入50 fmol突變型特異性檢測(cè)探針和公用檢測(cè)探針，去離子水補(bǔ)足30 μL。針對(duì)每個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)設(shè)定一對(duì)照管CT，對(duì)照管不加入模板序列，其它成分與檢測(cè)管相同。連接反應(yīng)條件為：94℃ 40 s，55℃ 5 min；5 cycles；95℃ 5 min。

通用擴(kuò)增反應(yīng)：取2×PCR Mastermix 15 μL，各管連接反應(yīng)產(chǎn)物2 μL，2 μM的通用擴(kuò)增引物Tag1 和CTag2，去離子水補(bǔ)足30 μL。95℃ 30 s；95℃ 25 s，60℃ 45 s，72℃ 20 s；20 cycles, 72℃ 1 min進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

1.2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：分別取各SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)WT管和MT管擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行3.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)WT管和MT管對(duì)應(yīng)泳道在目標(biāo)位置電泳條帶出現(xiàn)情況判定SNP位點(diǎn)基因型。如果只有WT管對(duì)應(yīng)泳道出現(xiàn)條帶，則該SNP位點(diǎn)為純合野生型；如果WT管和MT管對(duì)應(yīng)泳道均出現(xiàn)條帶，則該SNP位點(diǎn)為野生/突變型；如果只有MT管對(duì)應(yīng)泳道出現(xiàn)條帶，則檢測(cè)SNP為純合突變型。

圖2 連接酶-ELISA分型方法檢測(cè)流程圖?！啊?表示生物素標(biāo)記；

ELISA檢測(cè)：將擴(kuò)增產(chǎn)物移入96孔板對(duì)應(yīng)孔中，按照試劑盒操作說(shuō)明，用鏈親和素磁性微粒對(duì)各SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)各管擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。并用PBST清洗緩沖液清洗3次磁性微粒，地高辛標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后通過(guò)生物素結(jié)合至鏈親和素磁性微粒表面，將磁性微粒保存于20 μL 保存緩沖液(10 mM Tris-HCl, pH值7.5)中。各反應(yīng)孔中加入50 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗地高辛抗體溶液(20%胎牛血清1∶1000 稀釋)，室溫恒溫?fù)u床中70 r/min反應(yīng)30 min。磁性分離并用150 μL清洗緩沖液(1×PBST)清洗3次。加入100 μL的TMB底物緩沖液，25℃顯色 5 min。2 M H2SO4終止顯色反應(yīng)，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，背景波長(zhǎng)595 nm，酶標(biāo)儀(ELX 800 UV, BIO-TEK INSTRUMENTS, INC)測(cè)定各孔吸光度值。根據(jù)各SNP位點(diǎn)WT管和MT管對(duì)應(yīng)各孔顯色值判定所檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型，判定結(jié)果同瓊脂糖凝膠電泳方法。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)方法流程

圖2所示為對(duì)SNP(T/G)位點(diǎn)的野生純合子進(jìn)行檢測(cè)的示意圖，在連接反應(yīng)時(shí)，只有WT管中的特異性檢測(cè)探針和公用探針能完成連接，而MT管中特異性探針和公用探針不能連接，經(jīng)通用引物Tag1 和CTag2的通用擴(kuò)增和標(biāo)記，可分別在瓊脂糖凝膠電泳水平和ELISA水平進(jìn)行分型檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)觀察WT管和MT管對(duì)應(yīng)電泳泳道條帶的出現(xiàn)和顯色孔顯色值來(lái)判定。如示意圖中，只在WT管對(duì)應(yīng)泳道出現(xiàn)條帶，而MT管對(duì)應(yīng)泳道無(wú)條帶；同理，只在WT管對(duì)應(yīng)顯色孔有顯色值，而MT管對(duì)應(yīng)泳道無(wú)顯色值。

2.2 特異性檢測(cè)

以擴(kuò)增反應(yīng)中的循環(huán)數(shù)對(duì)本方法的特異性進(jìn)行評(píng)估，分別對(duì)L861Q 和G719C兩個(gè)野生型等位基因模板和L858R野生/突變混合模板進(jìn)行檢測(cè)。分別擴(kuò)增18 和28個(gè)循環(huán)，將5 μL各擴(kuò)增產(chǎn)物做3.5%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖3所示。在兩個(gè)循環(huán)條件下，L858R位點(diǎn)的WT和MT管對(duì)應(yīng)泳道均出現(xiàn)明顯擴(kuò)增條帶，L861Q 和G719C兩個(gè)位點(diǎn)只在WT管對(duì)應(yīng)泳道出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，而MT泳道未有條帶擴(kuò)增。同時(shí)3個(gè)位點(diǎn)CT管對(duì)應(yīng)泳道均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。說(shuō)明此方法具有較高的擴(kuò)增容量和檢測(cè)特異性。

圖3 連接酶-ELISA分型方法特異性檢測(cè)

2.3 靈敏度檢測(cè)

選取L858R位點(diǎn)為檢測(cè)對(duì)象，突變等位基因在總檢測(cè)模板中所占比例分別設(shè)定為50%、25%、10%和5%。對(duì)不同比例的突變型等位基因進(jìn)行檢測(cè)。

圖 4 L858R位點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳水平敏感度檢測(cè)(突變等位基因在總檢測(cè)質(zhì)粒模板中所占比例分別設(shè)定為50%, 25%, 10%, 5%)

Fig 4 Sensitivity for the detection of L858R performed with 3.5% agarose gel electrophoresis (The proportions of mutated alleles in the total plasmid DNA were 50%, 25%, 10%, 5%)

結(jié)果如圖4所示，在MT和WT管對(duì)應(yīng)的泳道中均檢測(cè)出條帶，且隨著突變型等位基因含量的減少，MT管對(duì)應(yīng)條帶逐漸減弱。當(dāng)?shù)椭?%時(shí)條帶較為模糊。為了提高方法的靈敏度，將ELISA方法引入實(shí)驗(yàn)體系中，結(jié)果如表2所示。L858R, L861Q 和 G719C位點(diǎn)對(duì)應(yīng)WT管的450 nm處的光吸收值在1.68和1.89之間，MT管的450 nm處的光吸收值在0.71和1.86之間。L858R, L861Q和G719C 3個(gè)位點(diǎn)MT管在突變等位基因比例為5%時(shí)的光吸收值分別達(dá)到0.81、0.71 和0.76。而且，WT和MT管對(duì)應(yīng)光吸收與CT管對(duì)應(yīng)光吸收值的比值均大于5。因此，ELISA水平的檢測(cè)有著較高的靈敏度，能夠準(zhǔn)確的將5%的突變等位基因從混合模板中檢測(cè)出來(lái)，尤其適合于從不均一的樣本中進(jìn)行突變等位基因的檢測(cè)。

表2 L858R、L861Q和G719C位點(diǎn)ELISA水平敏感度檢測(cè)(突變等位基因在總檢測(cè)質(zhì)粒模板中所占比例分別設(shè)定為50%, 25%, 10%, 5%，各檢測(cè)值為三次檢測(cè)平均值± S.E)

Table 2 Sensitivity for the detection of L858R、L861Q and G719C in exon21 and 18 of EGFR with the ELISA (The proportion of mutated allele in the total plasmid DNA was 50%, 25%, 10%, 5% respectively, values of each reaction tube are means ± S.E. obtained from three independent experiments)

突變等位基因在總檢測(cè)質(zhì)粒模板中所占的比例50%25%10%5%WTL858R1.76±0.111.81±0.151.78±0.171.82±0.14G719C1.82±0.131.79±0.121.86±0.091.78±0.18L861Q1.83±0.161.68±0.211.89±0.111.79±0.08MTL858R1.85±0.091.44±0.161.01±0.180.81±0.09G719C1.72±0.121.68±0.111.09±0.20.76±0.2L861Q1.86±0.141.12±0.130.95±0.130.71±0.05CTL858R0.15±0.020.13±0.030.14±0.020.09±0.02G719C0.12±0.030.09±0.060.11±0.050.07±0.04L861Q0.14±0.020.07±0.070.08±0.040.08±0.02

3 討論

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，使得生物信息學(xué)資源獲得了爆炸性的積累，也極大地推動(dòng)了SNP突變檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。但是，雖然在許多技術(shù)上取得了進(jìn)展，SNP檢測(cè)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)成本、常規(guī)性和靈敏度等方面仍需要改進(jìn)。由于傳統(tǒng)的測(cè)序方法檢測(cè)靈敏度只有20%[19-20]，不適合對(duì)不均一樣本進(jìn)行突變檢測(cè)，雖然焦磷酸測(cè)序、定量PCR、質(zhì)譜等方法的檢測(cè)靈敏度較高，可分別達(dá)到5%和1%[20-21]，但是這些方法都要求昂貴的實(shí)驗(yàn)試劑和檢測(cè)設(shè)備，不利于在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測(cè)。

本研究中，建立了一種具有較高檢測(cè)靈敏度適合于對(duì)不均一樣本進(jìn)行SNP突變檢測(cè)而且能夠在一般實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行常規(guī)突變檢測(cè)的新方法：連接酶-凝膠-ELISA SNP分型方法。本方法基于連接酶反應(yīng)的原理，通過(guò)連接和擴(kuò)增反應(yīng)，利用瓊脂糖凝膠電泳和ELISA檢測(cè)手段進(jìn)行SNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)。與其它檢測(cè)方法如測(cè)序、熒光定量PCR反應(yīng)和質(zhì)譜檢測(cè)等相比，本方法操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴的試劑和實(shí)驗(yàn)儀器，只需借助PCR儀、凝膠電泳和酶標(biāo)儀等簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)條件下就能完成。

本方法具有較高的特異性和靈敏度。其特異性通過(guò)以下條件保證：1)高保真性Taqligase的識(shí)別能力；2)檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)方法，除依靠WT和MT探針3′端堿基與突變堿基的配對(duì)識(shí)別能力外，還在其3′端上游第3個(gè)堿基處引入一個(gè)錯(cuò)配堿基增強(qiáng)探針的識(shí)別能力；3)WT、MT探針和公用探針進(jìn)行連接反應(yīng)的H1和H2序列的Tm值與進(jìn)行通用擴(kuò)增反應(yīng)的Tag1和Tag2序列的Tm值相差7～8℃，以減少探針的連接反應(yīng)和后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)之間的影響。而本方法較高的檢測(cè)靈敏度則是通過(guò)在探針序列上設(shè)計(jì)通用擴(kuò)增序列Tag1和Tag2，完成連接酶反應(yīng)后，在瓊脂糖凝膠電泳水平檢測(cè)時(shí)，進(jìn)行了連接產(chǎn)物的二次擴(kuò)增反應(yīng)以增加檢測(cè)量；在ELISA水平檢測(cè)時(shí)，完成二次擴(kuò)增產(chǎn)物的固相純化后，利用顯色反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。

總之，本研究建立了一種SNP分型新方法，并對(duì)與酪氨酸激酶抑制劑用藥密切相關(guān)的表皮生長(zhǎng)因子基因EGFR中的3個(gè)常見SNP位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)。與現(xiàn)有方法相比，該方法具有較高檢測(cè)特異性和靈敏度，適合于在一般實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)不均一樣本進(jìn)行常規(guī)SNP分型檢測(cè)。但本方法不能對(duì)未知SNP位點(diǎn)進(jìn)行突變檢測(cè)，在檢測(cè)通量上有一定的局限，適合于進(jìn)行中低通量的檢測(cè)，而不利于進(jìn)行高通量的突變檢測(cè)。

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