王升啟

·導(dǎo)向與述評(píng)·

分子診斷技術(shù)在傳染病病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

王升啟

傳染病病原體的準(zhǔn)確檢測(cè)是傳染病有效防控的前提，也是合理用藥的基礎(chǔ)。然而，傳統(tǒng)的病原體分離、培養(yǎng)等診斷方法不能完全滿足臨床治療和疾病控制的需要。新發(fā)展的傳染病分子診斷技術(shù)可有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足。本文就新一代測(cè)序、核酸擴(kuò)增、生物芯片和生物傳感等傳染病分子診斷新技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

分子診斷技術(shù)；基因擴(kuò)增；高通量核苷酸測(cè)序；微點(diǎn)陣分析；生物傳感技術(shù)；傳染病

本文對(duì)新一代測(cè)序、生物芯片、核酸擴(kuò)增和生物傳感四類分子診斷技術(shù)進(jìn)行綜述。

1 新一代測(cè)序技術(shù)

1.1 病原體培養(yǎng)物樣本的基因組測(cè)序獲得病原體整個(gè)基因組，是最精確的病原體確證手段。從感染病例分離培養(yǎng)的病原體經(jīng)過核酸提取、文庫構(gòu)建以及定量質(zhì)控后，通過新一代測(cè)序技術(shù)可以快速得到病原體基因組，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的精確鑒定，快速發(fā)現(xiàn)基因組標(biāo)志物用于檢測(cè)試劑盒的研發(fā)，非常有利于突發(fā)疫情的快速反應(yīng)。同時(shí)，通過病原體基因組信息可實(shí)現(xiàn)溯源分析和耐藥/毒力基因分析，深入解析疫情傳播機(jī)制。2011年5月，德國出現(xiàn)出血性大腸桿菌O104:H4疫情。華大基因在獲得培養(yǎng)菌株的核酸后，3 d完成了7次二代測(cè)序?qū)嶒?yàn)，5 d后O104:H4菌株的基因組草圖就在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫公布?；谠摂?shù)據(jù)2 d后便研發(fā)出了診斷試劑盒，并在2周內(nèi)由全球研究人員發(fā)布了24篇研究報(bào)告（毒力、耐藥、進(jìn)化等），極大促進(jìn)了該疫情的防控[1]。同年7月，荷蘭暴發(fā)由超級(jí)耐藥肺炎克雷伯菌Oxa48株導(dǎo)致的疫情，德國明斯特大學(xué)獲得樣本2 d后，便完成2株細(xì)菌的全基因組測(cè)序，并迅速發(fā)現(xiàn)特異序列用于臨床排查試劑盒的開發(fā)。Science雜志對(duì)新一代測(cè)序技術(shù)在這兩場(chǎng)疫情中發(fā)揮的作用給出了高度評(píng)價(jià)，指出新一代測(cè)序技術(shù)已成為基因組時(shí)代應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件的主流技術(shù)[2]。然而，由于新一代測(cè)序技術(shù)的高成本和復(fù)雜度，目前還不能在一線臨床機(jī)構(gòu)如醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行推廣。如今，各測(cè)序儀廠商都在積極進(jìn)行臨床申報(bào)，但是自動(dòng)化建庫工作站和數(shù)據(jù)分析軟件等配套系統(tǒng)都亟待完善。高通量測(cè)序全面用于臨床病原體確認(rèn)還需要一定的時(shí)間。

1.2 非培養(yǎng)樣本病原體的檢測(cè)新一代測(cè)序技術(shù)還可用于非培養(yǎng)樣本病原體的檢測(cè)。由于新一代技術(shù)不需要對(duì)病原體有預(yù)先假設(shè)，非常適合非培養(yǎng)樣本中“未知”病原體的檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)其他技術(shù)無法克服的檢測(cè)難題。但是，樣本中絕大部分為宿主和正常菌群的核酸背景，病原體信噪比極低，須要依賴先進(jìn)的樣本處理和生物信息學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)大海撈針式的病原體檢測(cè)工作，具有較大的挑戰(zhàn)性。2008年，瑞典斯德哥爾摩Karolinska醫(yī)學(xué)院的醫(yī)生和研究者遇到1例疑難病例，3例接受了來自同一供者器官的移植手術(shù)患者，在手術(shù)后4～6周均持續(xù)發(fā)熱并相繼死亡，而且并無明顯的免疫反應(yīng)。采用常規(guī)細(xì)菌和病毒培養(yǎng)、多種病原體PCR檢測(cè)試劑盒以及病毒和細(xì)菌病原體微陣列芯片都未發(fā)現(xiàn)可疑病原體。于是，研究者從2例患者組織中提取了RNA，采用454測(cè)序儀進(jìn)行新一代測(cè)序，經(jīng)一系列生物信息學(xué)過濾和分析后，最后發(fā)現(xiàn)14條組裝片段同舊世界沙粒病毒（old world arenaviruses）序列同源（約80%同源性），后經(jīng)多種生物實(shí)驗(yàn)手段驗(yàn)證后，確證了該病毒病原體在3例患者體內(nèi)廣泛存在[3]，該項(xiàng)工作也成為新一代測(cè)序技術(shù)鑒定“未知”病原體的開山之作[4-5]。之后，多家機(jī)構(gòu)采用該研究思路，也發(fā)現(xiàn)或確證了多種傳染病病原體[6-9]。新一代測(cè)序技術(shù)還被用于疑似病例的病原體排查。如2012年，斯坦福大學(xué)研究者對(duì)烏干達(dá)123例疑似登革熱患者血清進(jìn)行新一代測(cè)序并最終確證37%的陽性患者（登革熱病毒占僅總樣品量的0.002%～2.800%）[10]。然而，這類工作目前還主要停留在從非培養(yǎng)樣本中得到病原體的基因組片段，而從非培養(yǎng)樣本中直接得到病原體整個(gè)基因組還存在較大的挑戰(zhàn)[11]。由于技術(shù)的挑戰(zhàn)性，新一代測(cè)序全面用于臨床非培養(yǎng)樣本檢測(cè)的可能性較小。但是，通過一線臨床工作者和研究人員密切合作，利用新一代測(cè)序解決疑難感染病例問題，具有較高的可行性。

2 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)是指通過微加工技術(shù)在平方厘米大小的固相介質(zhì)表面或液相介質(zhì)中構(gòu)建微型分析系統(tǒng)，根據(jù)分子間特異性相互作用的原理，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)、核酸等分子的準(zhǔn)確、快速、高通量、平行化和自動(dòng)化檢測(cè)[12]。基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和芯片實(shí)驗(yàn)室都屬于生物芯片的范疇[13]。與傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)相比，生物芯片具有準(zhǔn)確、快速、高通量的優(yōu)勢(shì)，在病原微生物感染鑒別診斷、基因分型及耐藥檢測(cè)等傳染病分子診斷領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[14]，目前已有多種生物芯片產(chǎn)品獲批應(yīng)用于臨床診斷。

2.1 病原微生物感染鑒別診斷病原微生物種類眾多，臨床和疾病控制中心都存在感染鑒別診斷的需求。生物芯片技術(shù)具備高通量的優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)標(biāo)志物，篩查多種病原體，目前已有多種產(chǎn)品問世[15]。丙型肝炎分片段抗體檢測(cè)蛋白芯片，選取HCV核心抗原NS3/NS4/NS5為檢測(cè)探針，經(jīng)過3家單位臨床考核證明與ELISA法符合率達(dá)99%，且準(zhǔn)確性高于ELISA法，與RIBA試劑符合率為98%，可用于HCV的感染確證[16]。這是國際上第一個(gè)基于硅基材料的獲得注冊(cè)證書的市場(chǎng)準(zhǔn)入生物芯片產(chǎn)品。

2.2 病原微生物基因分型同種病原微生物不同基因型可導(dǎo)致疾病及預(yù)后的進(jìn)展不同[17]，因此，針對(duì)型特異性核酸序列利用生物芯片技術(shù)進(jìn)行基因分型具有重要意義。如HBV基因分型檢測(cè)試劑盒（基因芯片法），可區(qū)分A～G共8個(gè)基因型別[18]，可用于人血清或血漿樣本中HBV的基因分型檢測(cè)。盡管分子分型中基因測(cè)序是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但基因芯片技術(shù)與測(cè)序技術(shù)相比的優(yōu)勢(shì)在于靈敏度高，如一些含量較低的微生物，從原始標(biāo)本中直接擴(kuò)增出可滿足測(cè)序要求的基因片段有較大困難，但應(yīng)用了信號(hào)放大的基因芯片技術(shù)可以完成低拷貝數(shù)模板的檢測(cè)。

2.3 病原微生物耐藥檢測(cè)生物芯片技術(shù)不僅可檢測(cè)特異性基因，還可用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性，已有多種微生物耐藥檢測(cè)產(chǎn)品問世[19]。如HBV核酸及YMDD變異檢測(cè)基因芯片試劑盒，可同時(shí)分析HBV多聚酶突變位點(diǎn)528、552及555突變，共檢測(cè)了2425例血液標(biāo)本，芯片結(jié)果與測(cè)序結(jié)果的符合率為98.1%，這是國際上第一個(gè)HBV耐藥檢測(cè)基因芯片，可為臨床醫(yī)師提供HBV感染者的抗病毒用藥參考[20]。結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒（DNA微陣列芯片法），可檢測(cè)利福平和異煙肼的3個(gè)耐藥相關(guān)基因rpoB基因、katG基因及inhA基因啟動(dòng)子的野生型及不同突變型，用于定性檢測(cè)來源于臨床疑似結(jié)核病患者經(jīng)過分離培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌分離株樣本中的核酸及藥物敏感性（藥敏）情況，在脊柱結(jié)核標(biāo)本檢測(cè)中，該芯片檢測(cè)利福平耐藥的靈敏度和特異度分別為88.9%和90.7%，檢測(cè)異煙肼耐藥的靈敏度和特異度分別為80.0%和91.0%[21]。該方法與傳統(tǒng)的結(jié)核菌培養(yǎng)和藥敏實(shí)驗(yàn)相比，可提前至少4周報(bào)告結(jié)果，對(duì)疑似結(jié)核病患者的早確診和早治療具有重要意義。

2.4 生物芯片信號(hào)檢測(cè)技術(shù)生物芯片技術(shù)在傳染病檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，但現(xiàn)有芯片技術(shù)靈敏度低和設(shè)備要求高是推廣應(yīng)用的瓶頸。在此背景下，芯片技術(shù)的信號(hào)檢測(cè)領(lǐng)域近年來也取得了一些研究進(jìn)展?；谟袡C(jī)熒光的芯片信號(hào)檢測(cè)方法成熟、簡便，能夠達(dá)到一般的檢測(cè)要求。但熒光芯片也存在缺點(diǎn)，如熒光易淬滅、檢測(cè)靈敏度不足，且信號(hào)檢測(cè)需要激光共聚焦掃描儀等特殊儀器。Wang課題組發(fā)明了一種新型納米金復(fù)合底物Nanogold-DAB，HRP，能夠直接催化此復(fù)合底物反應(yīng)使大量納米金特異沉積，再通過銀染色增強(qiáng)，建立起可視化生物芯片檢測(cè)方法[22]。該技術(shù)不僅提高了檢測(cè)靈敏度，而且也實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)儀器的低成本化、小型化，有利于生物芯片技術(shù)的推廣應(yīng)用，預(yù)計(jì)2015年會(huì)有系列可視化生物芯片產(chǎn)品獲準(zhǔn)上市。

3 核酸擴(kuò)增技術(shù)

3.1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，因其準(zhǔn)確、快速、靈敏等特點(diǎn)被國際公認(rèn)為傳染病相關(guān)病原微生物實(shí)驗(yàn)室確證的最有效手段，獲批產(chǎn)品眾多，近年來該技術(shù)在新突發(fā)疾病（嚴(yán)重急性呼吸綜合征、甲型H1N1流感等）的確證、常規(guī)病原體的檢測(cè)和診斷中均發(fā)揮了不可替代的作用[23-24]。

熒光PCR的化學(xué)原理可分為3個(gè)基本類型：DNA結(jié)合染料法、探針法和猝滅染料引物法[25]。前2種方法均可檢出引物二聚體等非特異反應(yīng)產(chǎn)物，特異性不強(qiáng)，因此在傳染病的臨床診斷中應(yīng)用極少。在傳染病的分子診斷中一般建議采用探針法。探針法依賴熒光共振能量遷移實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，包括TaqMan探針、分子信標(biāo)、蝎型探針和復(fù)合探針等，該法僅檢測(cè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，因此特異性強(qiáng)。目前應(yīng)用最廣泛的為TaqMan探針技術(shù)，WHO公布的甲型HIN1流感及人感染H7N9禽流感防控指南中推薦的熒光PCR檢測(cè)方法均采用的是TaqMan探針技術(shù)。復(fù)合探針技術(shù)是國內(nèi)惟一具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的熒光PCR方面的核心探針技術(shù)，具有噪聲信號(hào)低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，目前該課題組基于該技術(shù)已開發(fā)出了系列的傳染病診斷試劑。

3.2 核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，與PCR技術(shù)不同的是其擴(kuò)增反應(yīng)始終在一個(gè)溫度下進(jìn)行，無須控溫精密的實(shí)驗(yàn)儀器和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)程序，其操作簡便、反應(yīng)快速、檢測(cè)靈敏度高，在臨床和現(xiàn)場(chǎng)快速診斷中顯示了良好的應(yīng)用前景。目前已有的等溫技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）、依賴核酸序列等溫?cái)U(kuò)增（nuclear acid sequence-based amplification,NASBA）、鏈替代等溫?cái)U(kuò)增、滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增、依賴解旋酶等溫?cái)U(kuò)增、單引物等溫?cái)U(kuò)增和核酸快速等溫檢測(cè)放大等。在傳染病病原檢測(cè)方面應(yīng)用較多的有LAMP、NASBA等。LAMP目前已成功應(yīng)用于EV71、結(jié)核分枝桿菌、登革熱病毒、黃熱病毒等的檢測(cè)[26-27]，NASBA已應(yīng)用于細(xì)菌、病毒等多種病原微生物的檢測(cè)，包括HIV和HCV等[28-29]。LAMP用4條引物識(shí)別6個(gè)位點(diǎn)，特異性強(qiáng)，但引物設(shè)計(jì)要求較高，且擴(kuò)增產(chǎn)物不能用于克隆測(cè)序，易形成氣溶膠，造成假陽性影響檢測(cè)結(jié)果。NASBA反應(yīng)成分比較復(fù)雜，3種酶的使用增加了反應(yīng)成本，且不適合DNA類病原檢測(cè)。

4 生物傳感技術(shù)

生物傳感器是一種由生物感應(yīng)元件和信號(hào)處理元件組成，用于檢測(cè)各種生物和化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)。生物傳感器利用生物感應(yīng)元件與目標(biāo)檢測(cè)物之間相互作用產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào)，通過信號(hào)處理元件對(duì)響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行接收、加工、轉(zhuǎn)換和輸出，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的分析檢測(cè)[30-31]。近年來，基于功能納米材料的生物傳感器呈現(xiàn)出體積更小、檢測(cè)速度更快、靈敏度更高和可靠性更好等優(yōu)異性能，在傳染病臨床診斷等諸多領(lǐng)域有著十分廣闊的應(yīng)用前景。

表面增強(qiáng)拉曼散射（surface-enhancedRamanscattering,SERS）是一種特殊的表面光學(xué)現(xiàn)象，具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，可從分子水平檢測(cè)吸附在金屬表面的物質(zhì)并提供物質(zhì)獨(dú)特的指紋震動(dòng)峰，在很多領(lǐng)域都得到實(shí)際應(yīng)用。Wang課題組將一端帶有拉曼信號(hào)分子的“發(fā)卡環(huán)”結(jié)構(gòu)DNA分子探針固定在金納米球微陣列芯片表面，利用分子探針捕獲高致病性禽流感H5N1的RNA標(biāo)識(shí)物并發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，通過SERS的變化來實(shí)現(xiàn)RNA的定量檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)樣品RNA的非擴(kuò)增直接檢測(cè)[32]。

SERS技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于病理診斷，使傳染病病理不再局限于形態(tài)學(xué)觀察，而是深入到分子水平和遺傳水平研究疾病，實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)-功能的分析。而SERS技術(shù)與核酸雜交技術(shù)的結(jié)合，使分子雜交技術(shù)在定量化以及高通量等方面日趨完善。目前生物傳感器檢測(cè)傳染性病原體仍處于實(shí)驗(yàn)室探索研究階段，必須注意到它的若干不足，例如:①體積大、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)困難；②難以實(shí)現(xiàn)高通量和超靈敏度的同時(shí)檢測(cè)；③設(shè)備價(jià)格貴、使用成本高；④抗干擾能力差、可靠性低；⑤無法實(shí)現(xiàn)直接在原始生物樣品（如血清、水等）中的檢測(cè)。這都限制了生物傳感器在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用，因此至今尚無可靠的商業(yè)化傳感器走向市場(chǎng)。隨著現(xiàn)代電子學(xué)、微加工技術(shù)、生物技術(shù)和納米科學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展，為生物傳感器的發(fā)展提供了新的機(jī)遇和方向。傳感器的構(gòu)建使檢測(cè)方法將得到進(jìn)一步改善，可縮短檢測(cè)時(shí)間，提高靈敏度，降低檢測(cè)限，實(shí)現(xiàn)微型化及便攜，達(dá)到快速、靈敏、方便、成本低等實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用的要求。

5 總結(jié)與展望

目前，高通量測(cè)序應(yīng)用于病原體檢測(cè)的主要問題包括成本高、操作復(fù)雜以及后續(xù)分析軟件不完善，而解決這些問題也是高通量測(cè)序在該領(lǐng)域的發(fā)展方向。例如，現(xiàn)在測(cè)序儀生產(chǎn)商都在大力開發(fā)自動(dòng)化建庫設(shè)備，甚至準(zhǔn)備將其與測(cè)序儀整合；而生物信息學(xué)專家也在大力開發(fā)工業(yè)級(jí)和醫(yī)用級(jí)軟件，相信在不久的將來，高通量測(cè)序亦能成為病原體檢測(cè)的一項(xiàng)主流技術(shù)。集樣品處理、目標(biāo)分子擴(kuò)增、信號(hào)檢測(cè)、結(jié)果分析和報(bào)告于一體的高集成生物芯片技術(shù)和產(chǎn)品的研發(fā)是傳染病分子診斷用生物芯片領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)難題，生物芯片技術(shù)也正向集成化、微型化、微量化、全自動(dòng)化、定量化和數(shù)據(jù)庫完善化方向發(fā)展。功能納米材料生物傳感器檢測(cè)目前主要停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，若要用于傳染病的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，還須解決抗體等敏感材料容易失活、信噪比較低、檢測(cè)的重復(fù)性和穩(wěn)定性不高等問題。未來功能納米材料生物傳感器在傳染病現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的發(fā)展趨勢(shì)將會(huì)集中于研發(fā)新型試劑和納米材料，提高抗體等生物材料的長時(shí)間保存活性，并能放大檢測(cè)信號(hào)，降低檢測(cè)背景，提高信噪比，從而進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度及傳感器的穩(wěn)定性。此外，我國傳染病分子診斷領(lǐng)域目前還存在以下幾個(gè)突出問題：第一，缺乏自主創(chuàng)新的分子診斷新技術(shù)；第二，已有分子診斷產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化程度不足，缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)等原因?qū)е虏糠之a(chǎn)品質(zhì)量無法保證，影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性；第三，特殊病原體分子診斷產(chǎn)品仍然較少，獲得注冊(cè)證書的更少。上述問題的逐步解決，將有力推動(dòng)我國傳染病分子診斷產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

志謝本文整理和撰寫過程中得到倪銘、劉琪琦、陳蘇紅、肖瑞和汪崇文等的大力支持，在此表示感謝

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（2014-07-13收稿 2014-08-30修回）

（責(zé)任編委 曲 芬 本文編輯 王 姝）

App lication ofmolecular diagnostic techniques to the detection of infectious diseases

WANG Sheng-qi
Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Key
Laboratory of New Molecular Diagnosis Techniques for Infectious Diseases,Beijing 100850,China

Fast and accurate detection of infectious pathogens is the premise of effective prevention and control of infectious diseases and also the basis for rational use of drugs.However,the traditional diagnostic methods such as isolation and culture of pathogens can not fully meet the needs of clinical therapy of infectious disease and the disease control.The newly developed rapid diagnostic techniques can effectively compensate for the lack of traditional methods.The progress of the application of nextgeneration sequencing,nucleic acid amplification,biochip and biosensor in the infectiousdiseasesdiagnosis is reviewed in thisarticle.

molecular diagnostic techniques;high-throughput nucleotide sequencing;microarray analysis;gene amplification; biosensing techniques;communicable diseases

R349.7

A

1007-8134(2014)05-0266-04

100850，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所全軍暨北京市傳染病分子診斷新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（王升啟）