文祝友，熊海蓉，熊遠(yuǎn)福，李 霞，蔣利華，趙明明

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，長沙 4101281； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 分析測試中心，長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，長沙 410128)

石蒜(LycorisHerb.)屬于單子葉植物綱石蒜科(Amaryllidaceae)多年生草本植物，全球約20種，我國擁有15個野生種[1-2]，資源豐富。石蒜鱗莖含有加蘭他敏、石蒜堿、力可拉敏等多種生物堿，具有重要藥用價值[3-4]。加蘭他敏(Galanthamine)為具有3個光學(xué)活性碳原子的四環(huán)叔胺型異喹啉類生物堿[5]，化學(xué)名稱：11-甲基-3-甲氧基-4α,5,9,10,11,12-六氫-6H-苯并呋喃[3α,3,2-ef][2]苯并氮雜卓-6-醇[6-7]。加蘭他敏是一種選擇性可逆膽堿酯酶抑制劑，最初用于治療小兒麻痹后遺癥、閉角型青光眼、重癥肌無力、術(shù)后腸肌麻痹、尿潴留以及作為手術(shù)麻醉后的催醒劑[8]；后來臨床研究顯示：加蘭他敏在治療輕、中度阿爾茨海默病(AD，老年癡呆癥)方面毒副作用小，具有較好療效[9]。加蘭他敏的氫溴酸鹽作為治療AD的藥物先后在奧地利、美國、歐洲等國家上市[10]。石蒜中加蘭他敏的提取普遍使用低級醇[11-12]、氯代乙烷[13]、稀酸[14]等常規(guī)溶劑法，存在費(fèi)時、溶劑耗量大、提取物雜質(zhì)多等缺點(diǎn)，而目前較先進(jìn)的超聲波輔助溶劑法提取加蘭他敏的報(bào)道很少[15]。本文以野生石蒜為原料，用乙醇作提取劑，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，探索了超聲波輔助法從石蒜中提取加蘭他敏的方法與工藝條件，并與常規(guī)溶劑提取法進(jìn)行了比較，以期為我國豐富的石蒜資源的高值利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

野生黃花石蒜鱗莖，2011年6月采自湖南九嶷山，洗凈、切片、烘干、粉碎后備用。95%乙醇，食用級，市售。乙腈，色譜純，天津大茂試劑廠。氯仿等其余試劑均分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

HF-2B超聲波循環(huán)萃取儀，北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司。Agilent1200高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。Heidolph型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司。pHS-3C型精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠。DZF-6020型真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取工藝

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的石蒜干粉，加入適量的提取劑，置于HF-2B超聲波循環(huán)萃取儀中，在設(shè)定溫度下提取一定時間；回收溶劑、濃縮提取液，用適量氨水調(diào)節(jié)溶液pH值為11，然后用氯仿萃取至提取液無生物堿反應(yīng)；合并氯仿液并回收溶劑，得到膏狀加蘭他敏提取物。

2.2 單因素與正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)筆者前期研究結(jié)果[12]，本實(shí)驗(yàn)以75%乙醇作為提取劑提取加蘭他敏。按照上述提取工藝，分別探討料液比、超聲波功率、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)對石蒜中加蘭他敏提取效果的影響。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對提取效果的影響較大的4個因素，每因素取3個水平，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，確定超聲波法提取加蘭他敏的最佳工藝條件。運(yùn)用正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 產(chǎn)率、提取率的測定

提取物用甲醇溶解，用高效液相色譜分析加蘭他敏的含量[16]，色譜條件如下：固定相：phenomenex-C18，2.1 mm×250 mm，5 μm；柱溫：40 ℃；流動相：乙腈-水(含0.1%TFA，體積比20∶80)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長290 nm；進(jìn)樣量20 μL。運(yùn)用外標(biāo)法定量。

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的原料W(g)，在設(shè)定的提取條件下提取加蘭他敏，提取物用甲醇溶解后，高效液相色譜測定加蘭他敏的質(zhì)量為W1(g)。準(zhǔn)確稱取等量的原料兩份，一份用最佳提取條件反復(fù)多次提取，直至加蘭他敏提盡，測定提取物中加蘭他敏總質(zhì)量為W2(g)；另一份完全按本實(shí)驗(yàn)所獲得的最佳條件提取，測得提取物中加蘭他敏的質(zhì)量為W3(g)，則加蘭他敏的產(chǎn)率、提取率按下式計(jì)算：產(chǎn)率=(W1/W)×100%；提取率=(W3/W2)×100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 加蘭他敏提取的單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1 超聲波功率對加蘭他敏提取的影響

由圖1可知，隨著超聲波功率增加，加蘭他敏的產(chǎn)率逐漸上升；當(dāng)功率大于250 W后，加蘭他敏產(chǎn)率有所下降，可能是功率過大、導(dǎo)致加蘭他敏分解所致。故超聲波功率以250 W～300 W為宜。

圖1 超聲波功率對加蘭他敏提取的影響

3.1.2 料液比對加蘭他敏提取的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，加蘭他敏的產(chǎn)率開始上升較快；當(dāng)料液比達(dá)到1∶6之后，產(chǎn)率上升幅度很小。從經(jīng)濟(jì)效益考慮，料液比以1∶6左右為宜。

圖2 料液比對加蘭他敏提取的影響

3.1.3 溫度對加蘭他敏提取的影響

由圖3可見，隨著提取溫度升高，加蘭他敏的產(chǎn)率初期上升較快；達(dá)到60 ℃時產(chǎn)率最大；繼續(xù)升溫，產(chǎn)率開始下降，可能是溫度高致使加蘭他敏被氧化所致。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，溫度過高會導(dǎo)致石蒜中的淀粉大量溶出，出現(xiàn)提取液糊化現(xiàn)象、后續(xù)分離困難。故溫度以60 ℃左右為宜。

圖3 溫度對加蘭他敏提取的影響

3.1.4 時間對加蘭他敏提取的影響

由圖4可知，隨著提取時間延長，加蘭他敏產(chǎn)率逐漸升高，但時間超過1.5 h后，產(chǎn)率反而下降，可能是長時間的超聲波處理導(dǎo)致部分加蘭他敏分解所致。提取時間選1.5 h較適宜。

圖4 時間對加蘭他敏提取的影響

3.1.5 次數(shù)對加蘭他敏提取的影響

由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，加蘭他敏產(chǎn)率開始上升較快，但達(dá)到2次之后其增幅已不明顯。提取次數(shù)多費(fèi)時、且提取劑耗量大，考慮經(jīng)濟(jì)因素，提取2次較適宜。

圖5 次數(shù)對加蘭他敏提取的影響

3.2 加蘭他敏提取的正交實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取溫度(A)、超聲波功率(B)、料液比(C)、提取總時間(D)對加蘭他敏產(chǎn)率的影響較大。因此，選擇這4個因素、每個因素設(shè)定3個水平，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1、表2所示。

從表1各因素的極差(R)大小和表2方差分析可知，影響加蘭他敏提取效果的因素從主到次依次為：A>D>B>C；其中溫度的影響最大，達(dá)10%顯著水平(a=0.10)。從表1每個因素3個水平的均值(k)大小及表2方差分析可知，最佳提取條件組合為A2B1C2D2，即超聲波提取加蘭他敏的最佳工藝條件：溫度60 ℃、超聲波功率250 W、料液比1∶6、時間1.5 h，提取2次。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

3.3 產(chǎn)率、提取率及提取物含量測定結(jié)果

按上述最佳工藝條件進(jìn)行5輪重復(fù)提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過HPLC法測得加蘭他敏提取率的平均值為94.6 %，加蘭他敏產(chǎn)率的平均值為0.0543 %；提取物中加蘭他敏含量為15.53 %。加蘭他敏標(biāo)樣、提取物色譜圖見圖6。

圖6 加蘭他敏標(biāo)樣(A)和提取物(B)的HPLC圖譜

3.4 超聲波法與常規(guī)溶劑法的比較

從表3可知， 與常規(guī)溶劑法相比，超聲波法提取石蒜中的加蘭他敏具有用時少、提取率及產(chǎn)率高、提取次數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)，總體效果優(yōu)于常規(guī)溶劑法。

表3 超聲波法與常規(guī)溶劑法的比較

4 結(jié) 論

(1)以乙醇為提取劑，超聲波法提取野生石蒜中加蘭他敏的最佳工藝條件：料液比1∶6、超聲波功率250 W、提取溫度60 ℃、提取時間1.5 h，提取2次。在該條件下加蘭他敏的提取率達(dá)94.6%，加蘭他敏產(chǎn)率0.054 3%；提取物中加蘭他敏含量為15.53%。

(2)超聲波法提取石蒜的中加蘭他敏，具有用時少、提取率及產(chǎn)率高、提取次數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)，總體效果明顯優(yōu)于常規(guī)溶劑。

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