聶英軍，傅超美，廖 婉，傅 舒，嚴(yán) 鑫，甘彥雄

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

醋莪術(shù)配方顆粒HPLC指紋圖譜研究

聶英軍，傅超美，廖 婉，傅 舒，嚴(yán) 鑫，甘彥雄

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

采用HPLC法，色譜柱為Dikma Diamonsil C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，以乙腈—水為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，色譜柱柱溫30℃，流速1.0 mL/min.建立了醋莪術(shù)飲片HPLC指紋圖譜共有模式，標(biāo)定了8個(gè)主要共有峰，并利用計(jì)算機(jī)輔助相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，表明相似度較大.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:該指紋圖譜研究方法簡(jiǎn)便可靠，重復(fù)性好，可作為目前醋莪術(shù)配方顆粒內(nèi)在質(zhì)量控制有效方法之一.

醋莪術(shù)配方顆粒;HPLC;指紋圖譜;質(zhì)量控制

0 引言

莪術(shù)始載于《藥性論》，是破血消 要藥，莪術(shù)炮制始載于南北朝的《雷公炮炙論》，醋制后入肝經(jīng)血分，其活血化瘀、消積止痛作用增強(qiáng)，同時(shí)也可緩和其峻猛的藥性.《中國(guó)藥典》2010年版同時(shí)收載生莪術(shù)與醋莪術(shù)2種規(guī)格［1］.醋莪術(shù)配方顆粒是中藥新型飲片，目前已投入臨床應(yīng)用［2－3］.相對(duì)于傳統(tǒng)以單個(gè)或少數(shù)主要成分作為指標(biāo)來(lái)控制醋莪術(shù)質(zhì)量的方法［4－6］，HPLC 指紋圖譜能比較全面地反映中藥中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，更好地表明中藥的內(nèi)在質(zhì)量［7－9］，所以本研究擬采取 HPLC 指紋圖譜法，以建立醋莪術(shù)配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).

1 儀器與材料

1.1 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用的儀器包括:島津LC－10AT高效液相色譜儀(SPD－10AT紫外檢測(cè)器、LC－10AT色譜泵)，江申JS－3030色譜工作站.

1.2 試 藥

實(shí)驗(yàn)所用試藥包括:莪術(shù)醇對(duì)照品(批號(hào)，120924;純度，HPLC≥98%);莪術(shù)二酮對(duì)照品(批號(hào)，120726;純度，HPLC≥98%)，2種對(duì)照品均購(gòu)自于四川省維克奇生物科技有限公司;水為重蒸水(自制)，甲醇為色譜純，其余試劑純度均為分析純.

1.3 藥 材

實(shí)驗(yàn)所用的藥材包括:醋莪術(shù)飲片10批，其生產(chǎn)廠家及批號(hào)如表1所示，配方顆粒按照最佳制備工藝制備而成.藥材經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本中心盧先明教授鑒定為醋制姜科植物蓬莪術(shù)的干燥根莖.

表1 醋莪術(shù)藥材飲片編號(hào)表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

實(shí)驗(yàn)的色譜條件為:色譜柱，Dikma Diamonsil C18柱(Dikma 公司，5 μm，4.6 mm × 250 mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)，254 nm，流動(dòng)相，乙腈(A)—水(B);梯度洗脫程序?yàn)?0 min→5 min，乙腈10%，水90%;5 min→30 min，乙腈20%，水80%;30 min→35 min，乙腈21%，水79%;35 min→45 min，乙腈35%，水 65%;45 min→90 min，乙腈 37%，水 63%;90 min→120 min，乙腈45%，水55%;120 min→160 min，乙腈50%→80%，水50%→20%;DAD檢測(cè)器，流速1.0 mL/min;色譜柱柱溫30℃.

2.2 供試品溶液的制備

精密稱定醋莪術(shù)配方顆粒1 g，置于三角錐形瓶中，加入100%甲醇40 mL，稱重，超聲提取(頻率20 kHz，功率250 W)1 h 后，稱重后補(bǔ)重，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，制得供試品溶液.

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮對(duì)照品適量于容量瓶中，加入適量甲醇，振搖，定容，制得含0.00810 mg/mL莪術(shù)醇，0.00425 mg/mL莪術(shù)二酮的混合對(duì)照品溶液.

2.4 測(cè)定方法

精密吸取供試品溶液及對(duì)照品溶液各10 μL，進(jìn)樣，采集160 min內(nèi)的色譜峰.

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察.

取醋莪術(shù)配方顆粒供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次后，分別對(duì)保留時(shí)間為 18、51、70、75、121、128、141、144 min的8個(gè)主要共有色譜峰進(jìn)行考察.結(jié)果顯示，各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積基本一致，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為，0.11%～0.67%，各共有峰的相對(duì)峰面積RSD為，0.6% ～1.65%，表明本方法精密度良好.

2.5.2 穩(wěn)定性考察.

取醋莪術(shù)配方顆粒供試品溶液，選取時(shí)間點(diǎn)0、1、2、4、8、12、24、48 h 進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算指紋圖譜中保留時(shí)間為 18、51、70、75、121、128、141、144 min 的 8個(gè)主要共有色譜峰峰面積.由計(jì)算結(jié)果可知，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為，0.45% ～1.05%，各共有峰的相對(duì)峰面積RSD為，0.73% ～1.64%，表明該樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.5.3 重復(fù)性考察.

取同一批次制得的醋莪術(shù)配方顆粒6組，對(duì)指紋圖譜中保留時(shí)間為 18、51、70、75、121、128、141、144 min的8個(gè)主要共有色譜峰進(jìn)行考察，采集峰面積數(shù)值，計(jì)算15個(gè)主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間與峰面積.由計(jì)算結(jié)果可知，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為，0.20%～0.75%，各共有峰的相對(duì)峰面積RSD為，0.46% ～1.04%，表明本測(cè)定方法重復(fù)性良好.

2.6 HPLC指紋圖譜共有色譜峰確認(rèn)

對(duì)10批次醋莪術(shù)配方顆粒指紋圖譜中的色譜峰進(jìn)行校正，將分離度較差的色譜峰去除，最終確定8個(gè)色譜峰為特征峰.吸取10 μL對(duì)照品溶液，進(jìn)樣，通過(guò)分析色譜峰保留時(shí)間與峰面積確定其色譜峰相似性歸屬.

2.7 樣品測(cè)定結(jié)果

2.7.1 指紋圖譜的檢測(cè).

精密稱定10組不同批次醋莪術(shù)配方顆粒，每組1 g，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，采集160 min中色譜峰保留時(shí)間與峰面積數(shù)值.使用“中藥色譜圖分析與數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)”應(yīng)用軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖1所示.

圖1 混合對(duì)照品溶液的HPLC指紋圖譜識(shí)別

2.7.2 指紋圖譜的相似度計(jì)算.

使用“中藥色譜圖分析與數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)”應(yīng)用軟件.以S1樣品譜圖為相似度計(jì)算的校正參照譜圖，時(shí)間窗寬度大小為0.1 min，采用平均算法，以多項(xiàng)式最小二乘擬合平滑法控制噪音，將參照譜圖作為基準(zhǔn)，各樣品的指紋圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)計(jì)算得各不同批次醋莪術(shù)配方顆粒的相似度，結(jié)果如表2、圖2～3所示.

表2 指紋圖譜相似度測(cè)定

圖2 醋莪術(shù)配方顆粒HPLC手動(dòng)匹配MARK峰與指紋圖譜共有模式

圖3 10批次不同醋莪術(shù)配方顆粒HPLC指紋圖譜疊加譜圖

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)不同廠家與批次的同一基源制備的醋莪術(shù)配方顆粒，使用本研究方法所得10個(gè)不同批次醋莪術(shù)配方顆粒的指紋圖譜的相似度和校正參照?qǐng)D譜相似度均在0.9以上.此與其藥材的產(chǎn)地均為四川有關(guān)，但使用夾角余弦法與相關(guān)系數(shù)法所計(jì)算得的相似度有略微差別.

3 討論

3.1 醋莪術(shù)配方顆粒指紋圖譜色譜條件的選擇

使用DAD檢測(cè)器對(duì)樣品在波長(zhǎng)200～800 nm下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，醋莪術(shù)HPLC指紋圖譜于波長(zhǎng)320～200 nm下色譜峰較多，故本研究選用310、280、254、216 nm 作為考察波長(zhǎng).結(jié)果顯示，在280 nm與254 nm 2個(gè)波長(zhǎng)下色譜峰的吸收度最大，且峰形完好.由于波長(zhǎng)280 nm下色譜峰的分離度較波長(zhǎng)254 nm下色譜峰分離度低，且在154 min后的基線有向上漂移的現(xiàn)象發(fā)生，故最終考慮確定波長(zhǎng)254 nm為指紋圖譜的測(cè)定波長(zhǎng).

醋莪術(shù)配方顆粒HPLC指紋圖譜中測(cè)定的成分主要是揮發(fā)油中小分子成分，有些化合物的結(jié)構(gòu)較為相似，甚至通過(guò)氧化、還原、催化等途徑發(fā)生某些化合物之間的結(jié)構(gòu)重排或者相互轉(zhuǎn)化，如莪術(shù)烯與呋喃二烯，導(dǎo)致部分色譜峰的分離難度增大，特別是在36～53 min之內(nèi)的色譜峰群.

3.2 配方顆粒研究的必要性

大多數(shù)批次的醋莪術(shù)配方顆粒HPLC指紋圖譜在152 min內(nèi)均能出峰完全，而少量批次中在保留時(shí)間為154 min左右任然會(huì)出現(xiàn)一個(gè)很小的色譜峰，如使用四川新荷花中藥飲片廠的醋莪術(shù)飲片制備的配方顆粒，所以在指紋圖譜測(cè)定中，設(shè)定保留時(shí)間為160 min，而且以色譜峰數(shù)量最多的四川新荷花中藥飲片廠的醋莪術(shù)飲片制備的配方顆粒測(cè)定得到的指紋圖譜作為參照譜圖.

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］涂瑤生.“一方”單味中藥濃縮顆粒的現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程與思考［J］.中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2001，3(3):24 －28.

［3］涂瑤生，畢曉黎.中藥配方顆粒國(guó)際化有關(guān)問(wèn)題的思考［J］.中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007，9(2):77 －81.

［4］郝普彥，郭力，許莉，等.不同種黃草石斛的HPLC指紋圖譜研究［J］.中藥與臨床，2013，4(2):1 －3.

［5］廖婉，傅超美，章津銘，等.醋莪術(shù)飲片質(zhì)量控制方法的研究［J］.華西藥學(xué)雜志，2012，27(4):447 －449.

［6］廖婉，傅超美，章津銘，等.醋莪術(shù)飲片HPLC指紋圖譜研究［J］.中藥材，2012，35(10):1582 －1585.

［7］蔡寶昌，劉訓(xùn)紅.常用中藥材HPLC指紋圖譜測(cè)定技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［8］王薇，康云鷹.論中藥指紋圖譜利弊及其應(yīng)用前景［J］.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2009，3(2):70 －71.

［9］覃葆，曾春暉，榮玲芝，等.不同炮制方法對(duì)廣西莪術(shù)的質(zhì)量研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20(9):2247 －2248.

Study on HPLC Fingerprint of Vinegar Rhizoma Zedoariae Formula Particles

NIE Yingjun，F(xiàn)U Chaomei，LIAO Wan，F(xiàn)U Shu，YAN Xin，GAN Yanxiong
(College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China)

This paper adopts HPLC method，Dikma Diamonsil C18column(4.6 mm ×250 mm，5 μm)as chromatographic column，acetonitrile-water as mobile phase.Gradient elution is used.The detection wavelength is 254 nm.The column temperature is 30 ℃.The flow rate is 1.0 mL·min－1.The HPLC fingerprint common model of vinegar rhizoma zedoariae yinpian is established，and the eight main common peaks are calibrated.By the computer aided similarity evaluation system，fingerprint similarity is analyzed，which indicates greater similarity.The experimental results show that this method is simple and reliable，and has good repeatability，which can be regarded as one of the effective methods for intrinsic quality control of vinegar rhizoma zedoariae formula particles.

vinegar rhizoma zedoariae formula particles;HPLC;fingerprint;quality control

R944.2+7

A

1004－5422(2014)01－0004－04

2014－01－16.

四川省科技支撐計(jì)劃(2013S20123)、四川省中醫(yī)藥管理局科技專項(xiàng)(2012－E－041)與四川省科技創(chuàng)新苗子工程(20133006)資助項(xiàng)目.

聶英軍(1986—)，男，碩士研究生，從事中藥新制劑、新技術(shù)與新工藝研究.