鄧學(xué)田(綜述)，李忠武，周立新(審校)

(1.河北省保定市第二中心醫(yī)院病理科，河北 涿州 072750；2.北京腫瘤醫(yī)院病理科，北京 100036)

·綜述·

數(shù)字化病理技術(shù)在病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用

鄧學(xué)田1(綜述)，李忠武2，周立新2(審校)

(1.河北省保定市第二中心醫(yī)院病理科，河北 涿州 072750；2.北京腫瘤醫(yī)院病理科，北京 100036)

病理學(xué),臨床；顯微切片術(shù)；數(shù)字化病理，質(zhì)量控制

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.03.045

通過光學(xué)顯微鏡觀察玻璃切片是常規(guī)病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)的基本技術(shù)[1]。數(shù)字病理是隨著全切片掃描(whole slide imagimg,WSI)應(yīng)用而生的新技術(shù)，為病理界帶來了日新月異的變化，該技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)獲得高清圖像，可以提供高清數(shù)字切片，目前已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、科研、教學(xué)以及遠(yuǎn)程會(huì)診中，必將對(duì)于病理實(shí)驗(yàn)室技術(shù)產(chǎn)生非常深遠(yuǎn)的影響[2-4]?，F(xiàn)以本科室應(yīng)用的Aperio Scanscope為例，就其中重要方面做簡(jiǎn)要綜述。

1 常規(guī)病理切片的質(zhì)量控制

常規(guī)病理切片主要關(guān)注的是切片的完整性、染色的對(duì)比度、背景深淺以及染色雜質(zhì)的有無。對(duì)于切片的清晰度難以作出客觀評(píng)價(jià)，而且也缺乏客觀的指標(biāo)評(píng)價(jià)切片的整體效果，我們?cè)趯?shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，切片經(jīng)掃描后，只有CO-EFFICEFACTOR在95%以上才能評(píng)價(jià)為優(yōu)質(zhì)切片，而CO-EFFICEFACTOR在70%以下，基本上應(yīng)歸屬為不合格切片，因?yàn)榍衅舴糯笾?00倍時(shí)圖像會(huì)模糊不清，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)難以辨別。此時(shí)，需要重新切片或重新經(jīng)二甲苯等有機(jī)溶劑處理切片。這些細(xì)微的差別在普通光學(xué)顯微鏡下很難觀察的到，但是應(yīng)用數(shù)字化病理全切片掃描技術(shù)可以輕松地完成上述工作。所以，數(shù)字化病理技術(shù)為病理實(shí)驗(yàn)室提供了很好的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

2 組織芯片的質(zhì)量控制及結(jié)果評(píng)判

組織芯片因其大規(guī)模、高通量、標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)在科研中得到大范圍的推廣和應(yīng)用。但是在實(shí)際工作中，經(jīng)常會(huì)遇到組織脫片后，在常規(guī)光鏡下核對(duì)比較困難的情況，合理應(yīng)用數(shù)字化病理切片掃描技術(shù)，根據(jù)組織芯片制作草圖，可以較容易地查找到脫失的組織，以備下一步進(jìn)行彌補(bǔ)(圖1A)。此外，在判讀免疫組織化學(xué)結(jié)果時(shí)，經(jīng)常會(huì)遇到上述同樣的問題，缺失的組織難以核對(duì)，而且結(jié)果判讀也需要參考組織芯片制作草圖，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且容易出錯(cuò)，而應(yīng)用數(shù)字掃描技術(shù)，所有問題都能迎刃而解(圖1B)，可以清楚看到哪些組織有缺失(脫片)，哪些組織陽性表達(dá)及陰性表達(dá)，結(jié)果一目了然。

3 免疫組織化學(xué)結(jié)果的定量及質(zhì)量控制

乳腺癌和胃癌是嚴(yán)重影響人類健康的疾病[5-8]。隨著分子病理學(xué)及靶向藥物研發(fā)的迅猛發(fā)展，給這兩種疾病特別是晚期患者的治療帶來了新的希望。準(zhǔn)確判讀原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER-2)免疫組織化學(xué)結(jié)果，對(duì)于篩選出真正可以從曲妥珠單抗治療獲益的乳腺癌及胃癌患者意義重大。

美國(guó)臨床腫瘤協(xié)會(huì)(American Society of Clinical Oncology,ASCO)/美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)(College of American Pathologists,CAP)2007年關(guān)于乳腺癌指南中，對(duì)于乳腺癌HER-2免疫組織化學(xué)表達(dá)的判讀做了明確規(guī)定[9]。美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)2011胃癌指南中，關(guān)于胃癌HER-2免疫組織化學(xué)評(píng)判也有明確規(guī)定[10-11]。盡管如此，觀察者之間主觀差異也會(huì)直接影響到結(jié)果判讀以及后續(xù)可能涉及的靶向治療。

應(yīng)用APERIO SCANSCOPE系統(tǒng)，首先可以篩選出陽性表達(dá)的組織(圖2A)，通過系統(tǒng)ANALYSIS功能，對(duì)待評(píng)估組織內(nèi)的某個(gè)區(qū)域進(jìn)行分析(圖2B)，分析結(jié)果顯現(xiàn)于相應(yīng)的表格中，可以直接讀出+++，++，+，-表達(dá)的比例，評(píng)價(jià)結(jié)果更為客觀、可靠。此種評(píng)估方法對(duì)于精確判斷在光學(xué)顯微鏡下判斷為++的病例尤為重要。國(guó)外多項(xiàng)研究[12-15]均證明，數(shù)字病理技術(shù)對(duì)于免疫組織化學(xué)結(jié)果的評(píng)估更為客觀可靠。

4 顯色原位雜交(chromogenic in situ hybridization,CISH)中的應(yīng)用

CISH屬于原位雜交方法中的一種，利用其與免疫組織化學(xué)酶放大相似的工作原理，可以在普通光鏡的亮視野下直接進(jìn)行觀察，且具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用、方便快捷的特點(diǎn)，在乳腺癌檢測(cè)中，與熒光素原味雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)不一致率<1%，2種方法檢測(cè)結(jié)果差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[15-19]。

我們?cè)趯?shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，利用Aperio Scanscope系統(tǒng)制作的掃描切片，可以快速識(shí)別病例有無擴(kuò)增。CISH結(jié)果判斷，無擴(kuò)增，在選定的區(qū)域內(nèi)，大部分腫瘤細(xì)胞(>50%)清楚地顯示有1～5個(gè)單個(gè)信號(hào)顆粒。有擴(kuò)增的情況稍顯復(fù)雜，在選定的計(jì)數(shù)區(qū)域內(nèi)，大部分腫瘤細(xì)胞(>50%)清楚地顯示>5個(gè)單個(gè)信號(hào)顆粒，或在選定的計(jì)數(shù)區(qū)域內(nèi)，>50%的腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)大簇團(tuán)信號(hào)，在選定的計(jì)數(shù)區(qū)域內(nèi)，大部分腫瘤細(xì)胞(>50%)清楚地顯示多個(gè)信號(hào)顆粒和大簇團(tuán)信號(hào)相混合，或在選定的計(jì)數(shù)區(qū)域內(nèi)，大部分腫瘤細(xì)胞(>50%)中出現(xiàn)小簇團(tuán)信號(hào)，可將小簇團(tuán)信號(hào)記錄成5個(gè)點(diǎn)，將大簇團(tuán)信號(hào)記錄成10個(gè)點(diǎn)。交界性，具有4～6個(gè)基因拷貝的病例，當(dāng)計(jì)數(shù)30個(gè)腫瘤細(xì)胞之后，如果信號(hào)顆粒的平均數(shù)在4～6個(gè)之間，則應(yīng)當(dāng)再計(jì)數(shù)30個(gè)總共60個(gè)腫瘤細(xì)胞。根據(jù)60個(gè)腫瘤細(xì)胞的信號(hào)平均值作出判斷，如仍不確定，應(yīng)當(dāng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，重新計(jì)數(shù)。簡(jiǎn)言之，無擴(kuò)增，1～5個(gè)信號(hào)顆粒/腫瘤細(xì)胞核；有擴(kuò)增，>5個(gè)信號(hào)顆粒，或簇團(tuán)信號(hào)>50%腫瘤細(xì)胞核。此種情況下，數(shù)字化掃描切片可以清楚顯示陽性擴(kuò)增地簇團(tuán)狀信號(hào)(圖3)。

5 其他方面的應(yīng)用

近來，有研究[20]報(bào)道，全切片掃描技術(shù)應(yīng)用于宮頸液基細(xì)胞學(xué)涂片，可以大大提高切片的清晰度，對(duì)于p16和Ki67標(biāo)記后切片同樣適用。在數(shù)據(jù)儲(chǔ)存方面，數(shù)字掃描技術(shù)與傳統(tǒng)病理資料庫相比，可以節(jié)省大量的空間、人力和物力，隨著大容量硬盤的廣泛應(yīng)用，這一優(yōu)勢(shì)更為彰顯。在傳統(tǒng)的病理教學(xué)中，罕見的教學(xué)切片無法得到良好保存，存在脫片、老化、丟失現(xiàn)象，而數(shù)字化切片可以人手一張[21]，大大提高了教學(xué)效果。目前Aperio公司已經(jīng)開發(fā)出可以用于掃描熒光染色切片的掃描系統(tǒng)，這為將來的科學(xué)研究及實(shí)驗(yàn)室診斷帶來了更為深遠(yuǎn)的影響，如切片可以不用顯微鏡而在個(gè)人計(jì)算機(jī)上進(jìn)行閱讀并作診斷，可以方便在網(wǎng)絡(luò)上傳輸閱讀并請(qǐng)專家會(huì)診，使跨區(qū)域的遠(yuǎn)程會(huì)診成為現(xiàn)實(shí)[22]，我們期待數(shù)字化病理為病理界帶來更多的驚喜。(本文圖見封三)

[1]AL-JANABI S,HUISMAN A,NAP M,et al.Whole slide images as a platform for initial diagnostics in histopathology in a medium-sized routine laboratory[J].J Clin Pathol,2012,65(12):1107-1111.

[2]WEINSTEIN RS,GRAHAM AR,RIAHTER LC,et al.Overview of telepathology,virtual microscopy,and whole slide imaging: prospects for the future[J].Hum Pathol，2009，40(8):1057-1069.

[3]AL-JANABI S,HUISMAM A,VAN DIEST PJ.Digital pathology: current status and future perspectives[J].Histopathology,2012，61(1):1-9.

[4]GAVRIELIDES MA,GALLAS BD,LENZ P,et al.Observer variability in the interpretation of HER2/neu immunohistochemical expression with unaided and computer-aided digital microscopy[J].Arch Pathol Lab Med,2011，135(2):233-242.

[5]郭德超，安慧敏，孫廣正，等.乳腺癌組織中NF-κB和Galectin-3的表達(dá)及意義[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012,33(3):275-278.

[6]陳萌.人類乳腺癌抗雌激素藥物耐藥基因與他莫昔芬耐藥關(guān)聯(lián)性的研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,34(5):612-614.

[7]賈楠,劉月平,李勇.胃癌組織Pokemon和P14ARF表達(dá)率及其在臨床生物學(xué)行為中的意義[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012,33(3):263-267.

[8]郝英杰，羨鮮,李勇，等.基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)及其與胃癌臨床生物學(xué)行為和預(yù)后的關(guān)系[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,34(6):621-625.

[9]SHAH SS,KETTERLING RP,GOETZ MP,et al.Impact of American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations on HER2 interpretation in breast cancer[J].Human Pathology,2010,41(1):103-106.

[10]BANG YJ,VAN CUTSEM E,FEYEREISLOVA A,et al.Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3,open-label,randomised controlled trial[J].Lancet,2010,376(9742):687-697.

[11] AJANI JA,BENTREM DJ,BESH S,et al.Gastric cancer,version 2.2013: featured updates to the NCCN Guidelines [J].J Natl Compr Canc Netw，2013,11(5):531-546.

[12] KEAY T,CONWARY CM,O′FLAHERTY N,et al.Reproducibility in the automated quantitative assessment of HER2/neu for breast cancer[J].J Pathol Inform，2013,4:19.

[13]KOTHARI S,PHAN JH,STOKES TH,et al.Pathology imaging informatics for quantitative analysis of whole-slide images[J].J Am Med Inform Assoc，2013,20(6):1099-1108.

[15]KRüGER JM,THOMAS M,KOM R,et al.Detection of truncated HER2 forms in formalin-fixed,paraffin-embedded breast cancer tissue captures heterogeneity and is not affected by HER2-targeted therapy[J].Am J Pathol，2013,183(2):336-343.

[16]AMOULD L,ROGR P,MACGROGAN G,et al,Accuracy of Her2 status determination on breast core-needle biopsies (immunohistochemistry,FISH,CISH and SISH vs FISH) [J].Mord Pathol,2012,25(5):675-682.

[17]AUMAYR K,SuUSANI M,HORVAT R.P16INK4A immunohistochemistry for detection of human papilloma virus-associated penile squamous cell carcinoma is superior to in-situ hybridization[J].Int J Immunopathol Pharmacol，2013,26(3):611-620.

[18]JACGUEMIER J,SPYRATOS F,ESTEMI B,et al.SISH/CISH or qPCR as alternative techniques to FISH for determination of HER2 amplification status on breast tumors core needle biopsies: a multicenter experience based on 840 cases[J].BMC Cancer，2013,13:351.

[19]LIN RJ,LUBPAIREE T,LIU KY,et al.Cyclin D1 overexpression is associated with poor prognosis in oropharyngeal cancer[J].Otolaryngol Head Neck Surg，2013,42(1):2-7.

[20]LAHRMANN B,VALOUS NA,EISENMANN U.Semantic focusing allows fully automated single-layer slide scanning of cervical cytology slides[J].PLoS One，2013,8(4):e61441.

[21]蔡永萍，江燕.探討數(shù)字化病理在病理教學(xué)中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012,28(18)：2849-2850.

[22]王儀.數(shù)字化病理切片在病理遠(yuǎn)程會(huì)診中的應(yīng)用體會(huì)[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師：醫(yī)學(xué)專業(yè)，2013,15(5)：246.

2013-06-26；

2013-11-05

鄧學(xué)田(1959-)，男，河北高碑店人，河北省保定市第二中心醫(yī)院主治醫(yī)師，從事臨床病理學(xué)診斷研究。

R361.3

A

1007-3205(2014)03-0370-03

許卓文)