暴麗莎 郝玲 劉芳 任常軍

·綜述與講座·

早產(chǎn)動物GMH-IVH模型的制作

暴麗莎 郝玲 劉芳 任常軍

生發(fā)基質(zhì)-腦室內(nèi)出血；模型，動物；早產(chǎn)

隨著圍產(chǎn)技術及重癥監(jiān)護技術的提高，目前越來越多的早產(chǎn)兒得以存活。因此，早產(chǎn)兒的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥日漸成為人們首要關注的問題之一[1]。生發(fā)基質(zhì)-腦室內(nèi)出血(germinal matrix hemorrhage-intraventricular hemorrhage，GMH-IVH)是早產(chǎn)兒主要的腦損傷形式[2]。根據(jù)文獻報道在胎齡<32周或(和)出生體重<1 500 g的早產(chǎn)兒中GMH-IVH的發(fā)生率為20%左右，其中Ⅳ級出血占8.3%[3]。出生體重為500～750 g的超低出生體重兒GMH-IVH的發(fā)生率高達45%[4]。我國早產(chǎn)兒GMH-IVH的發(fā)生率明顯高于發(fā)達國家。我國早產(chǎn)兒GMH-IVH的發(fā)生率為56.6%，其中重度出血的發(fā)生率為16.3%，并且存活者約35%遺留慢性神經(jīng)障礙。GMH-IVH后出現(xiàn)的主要神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥包括腦性癱瘓、癲癇、學習困難和認知異常等[5]，因此GMH-IVH是早產(chǎn)兒早期死亡的主要原因，也是早產(chǎn)兒以后智力、運動發(fā)育障礙的主要原因。這些不僅給家庭、社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔，還給家庭帶來沉重的心理負擔。目前GMH-IVH造成的腦損傷機制還在研究中，同時在臨床治療中GMH-IVH無特效療法，主要依靠支持療法，許多新的治療辦法還有待于驗證[6]。GMH-IVH動物模型的建立是解決這些問題十分有效的途徑。當前存在的主要問題是如何建立較為標準的GMH-IVH動物模型，它不僅在出血后形態(tài)學及病理生理機制上要接近人類早產(chǎn)兒，還要具有價格合理、容易復制和操作的優(yōu)點。2008年美國Georgiadis等[3]首次報道了該類動物模型的建立及相關研究。目前在國內(nèi)相關研究中尚無標準GMH-IVH動物模型用于描述這種GMH-IVH后的急性腦損傷。本文綜述了近年來在國內(nèi)外各類文獻中應用的GMH-IVH動物模型，以供大家參考，同時對國外建立的早產(chǎn)動物GMH-IVH模型進行介紹，希望可借助此動物模型對早產(chǎn)兒GMH-IVH進行更加深入、細致的研究。

1 早產(chǎn)兒腦出血的類型及機制

1.1 新生兒腦出血根據(jù)出血部位主要分為四種類型：(1) GMH-IVH；(2)硬腦膜下出血；(3)蛛網(wǎng)膜下腔出血；(4)小腦出血。GMH-IVH是早產(chǎn)兒最常見的腦出血類型。

1.2 早產(chǎn)兒腦出血與成人腦出血機制不盡相同，目前早產(chǎn)兒GMH-IVH造成的腦損傷機制還在研究中，大多數(shù)研究認為早產(chǎn)兒GMH-IVH是多種原因共同作用的結果[7]，最主要的原因被認為是[8]：(1)早產(chǎn)兒生發(fā)基質(zhì)脈管系統(tǒng)的脆弱性：毛細血管內(nèi)皮細胞及細胞間緊密連接、基膜、星形膠質(zhì)細胞足突、周細胞和極狹小的細胞外隙共同構成了血-腦屏障，這些成分中，任何一處存在薄弱或受損，均有可能導致顱內(nèi)壓升高，引起GMH-IVH[7]。(2) 腦血管內(nèi)血流量的波動：早產(chǎn)兒的腦出血好發(fā)于室管膜下的生發(fā)基質(zhì)。室管膜下生發(fā)基質(zhì)的血液供應來自于大腦前動脈及中動脈，在此處形成供血豐富的毛細血管床，且來自腦白質(zhì)，脈絡叢，紋狀體的多條靜脈在尾狀核頭部位匯合成端靜脈，形成“U”字形回路，這種特殊的走形極易發(fā)生血流動力學的變化而致出現(xiàn)腦出血。(3)早產(chǎn)兒血小板及凝血功能障礙：新生兒肝臟功能不成熟，凝血因子生成不足，凝血功能較差，且目前通過研究發(fā)現(xiàn)，凝血功能與胎齡有關，胎齡越低，凝血功能低下程度越嚴重，越易發(fā)生GMH-IVH。此外一些影響因子如缺血、缺氧、感染、免疫及理化因素等均可能引起緊密連接結構及功能發(fā)生改變造成血腦屏障損害，從而導致血腦屏障通透性升高引起腦水腫、腦出血。早產(chǎn)兒生后易受血糖、血壓、氧分壓、二氧化碳分壓、機械通氣等因素的影響，尤其高碳酸血癥時，可擴張腦血管，從而增加腦血流，導致GMH-IVH的發(fā)生[9，10]。由此可見，早產(chǎn)兒GMH-IVH與成人腦出血發(fā)生機制的不同，建立的GMH-IVH模型要與早產(chǎn)兒GMH-IVH的機制具有臨床相似性，以便為進一步研究早產(chǎn)兒GMH-IVH后的急性腦損傷奠定研究基礎。

2 GMH-IVH模型實驗動物的選擇

許多動物如兔、犬及嚙齒類動物被用來制作GMH-IVH動物模型，但是目前尚無一種動物模型能模擬早產(chǎn)兒GMH-IVH后所有的病理生理及神經(jīng)行為的變化，且在對動物的選擇上，每種動物均有自己的優(yōu)缺點。無論何種實驗動物，制作模型的目的是希望其出血后腦組織的形態(tài)學變化及病理生理的改變與早產(chǎn)兒GMH-IVH具有良好的相似性。目前國內(nèi)外用以建立GMH-IVH常用的實驗動物有嚙齒類動物(如大鼠)、靈長類動物(如猩猩)、以及兔、貓、狗等多腦回動物。靈長類動物如獼猴、猩猩等，與人類腦成熟度及其損傷形式具有很高的一致性，能準確反應人類新生兒的損傷機制及神經(jīng)病理情況，可提供用于人體實驗前極有價值且安全有效的方法和實驗數(shù)據(jù)，但因其價格昂貴，數(shù)量有限，此模型的應用受到了限制，不適合進行大量的基礎研究。大鼠繁殖快、價格低廉，體積小，易于管理，喂養(yǎng)，可被大量的用以實驗研究，且大鼠的腦血管解剖及生理與人類較為接近，同時目前大量科研工作多用大鼠，已積累了大量關于大鼠的生理、病理等方面的實驗資料。但是大鼠為嚙齒類動物，屬于單腦回動物，此點與人類不符合，且大鼠的體積小，GMH-IVH后的影像學的評價較為困難。應用早產(chǎn)兔進行GMH-IVH模型制作的優(yōu)勢在于其許多方面與人類有相似之處：(1)腦組織生長極限發(fā)生在圍產(chǎn)期，這與人類相似，常用于腦損傷后的運動研究；(2)腦基質(zhì)含量十分豐富；(3)腦血流通過頸內(nèi)動脈和椎動脈；(4)肺的完全成熟發(fā)生在胎內(nèi)，這使它們即使是早產(chǎn)兔，也有能力存活；(5)它們有發(fā)生自發(fā)性GMH-IVH的風險；(6)家兔基底節(jié)發(fā)達，而基底節(jié)是人類GMH-IVH的好發(fā)部位，同時家兔體積大，其GMH-IVH后的影像學的評價也較為方便。此外家兔價格相對低廉，兔子妊娠期為30～32 d，孕周29 d的兔子生理上屬于早產(chǎn)兔，較容易獲得，因而適合作為研究人類早產(chǎn)兒GMH-IVH的動物模型。

3 常見的腦出血動物模型

筆者尚未見到我國目前早產(chǎn)動物GMH-IVH模型研究的報道，很多實驗研究顯示了目前人們建立的成年動物腦出血模型。比較常見的為成年大鼠或家兔腦出血模型的建立，常見的腦出血模型包括四種：(1)自體血或血凝塊腦內(nèi)注入腦出血模型。20世紀60年代就開始應用此法進行腦出血模型的建立，隨著立體定位技術的問世，使此法更加完善。此法可通過立體定位技術建立我們所需要的腦出血模型，同時可通過控制血液注入量制作分級實驗性腦出血的研究，這種模型的制作接近臨床腦實質(zhì)的出血，可用于更好的觀察腦實質(zhì)出血后的病理形態(tài)學特點，但注入的血量與血腫產(chǎn)生的大小沒有確定的關系，所以此實驗重復性較差，而且即使有立體定位儀，注入血可能進入蛛網(wǎng)膜下腔，引起腦實質(zhì)的潛在損傷[11]。(2)腦內(nèi)植入填充物腦出血模型。此模型填充物大多應用微球囊。但此種方法為單純機械性損傷，不能進一步模擬腦出血后腦細胞及其神經(jīng)的病理生理變化，目前此法較少應用。(3)腦內(nèi)注入膠原酶誘導腦出血模型。此法制作模型快捷且重復性好，肝素化的膠原酶能夠破壞血腦屏障，與人類腦出血的病理生理學有許多相似之處，但血腫形成時間過長，病理上類似出血性腦梗死，與腦出血后急性腦損傷不相同，因此此模型的應用受到限制。(4)自發(fā)性腦出血模型。此模型中使用一種為應用血壓表型為標志近交培育的自發(fā)性高血壓大鼠，但此種大鼠培育不便，應用受到很大的限制。第二種為腎型高血壓大鼠，但是此法造成腦出血的發(fā)生率及部位不穩(wěn)定，使其應用受到限制。

國內(nèi)目前建立的腦出血動物模型基本上使用的是成年動物，從病理生理上也是為進一步模擬成年人腦出血后腦損傷的病理生理變化情況。但是早產(chǎn)兒作為特殊的群體，其腦出血的機制與成年人腦出血的機制不同，腦出血后造成的急性腦損傷亦與成年人有差別，成年動物腦出血模型不能直接被用來研究早產(chǎn)動物腦出血的機制。同時有實驗指出可應用缺氧或高碳酸血癥造成腦血管擴張，血流量增多，從而建立腦出血動物模型。但是這種實驗力度不易掌握，且容易造成動物死亡，復制困難，使實驗失敗。因此需要尋找一種安全的，更為接近早產(chǎn)兒腦出血發(fā)生機制的動物模型。

4 國外已建立的早產(chǎn)動物GMH-IVH模型

丙三醇(俗稱甘油)，是一種高滲溶液，是對硝基化合物的終產(chǎn)物，分娩時或分娩后快速腹腔注射丙三醇，使腦組織血漿滲透性急劇增加，組織間水分向血漿轉移，血流量增加，嚴重者出現(xiàn)腦組織血管破裂，引起新生動物顱內(nèi)出血[12]。更為重要的是，丙三醇對模型動物無直接腦損傷和肝、腎、肺、心等其他重要臟器毒副作用。在大鼠腹腔注射丙三醇實驗中，研究者檢測動物血漿肌酐、血尿素氮及電解質(zhì)，發(fā)現(xiàn)丙三醇并沒有對腎小管上皮細胞造成任何損害[13]。有相關實驗研究發(fā)現(xiàn)腹腔或靜脈注射丙三醇后不會產(chǎn)生神經(jīng)細胞的毒性，對腦組織內(nèi)谷氨酸、丙酮酸的代謝無影響。甚至有關于應用靜脈注射丙三醇治療缺氧性腦水腫、腦腫瘤等方面的報道[14，15]。利用腹腔注射丙三醇建立的早產(chǎn)兔GMH-IVH模型，與早產(chǎn)兒GMH-IVH發(fā)病機制及GMH-IVH后的腦損傷具有臨床相似性。

2008年Georgiadis等[3]通過向早產(chǎn)兔腹腔注射丙三醇建立了GMH-IVH的早產(chǎn)兔動物模型。通過對孕29 d(足月為32 d)的孕兔進行剖宮產(chǎn)，將生后3 h的早產(chǎn)兔腹腔注射50%丙三醇，建立GMH-IVH模型。對此模型進行超聲影像學評價，發(fā)現(xiàn)約80%左右的早產(chǎn)兔出現(xiàn)顱內(nèi)出血。同時超聲影像顯示了早產(chǎn)兔腦出血的部位與人類早產(chǎn)兒GMH-IVH后的超聲影像具有相同的特點，將早產(chǎn)兔安樂死，肉眼觀察出血腦組織的大體標本也證實了超聲所見。對GMH-IVH早產(chǎn)兔根據(jù)Derrick法[16]進行神經(jīng)行為評分，發(fā)現(xiàn)GMH-IVH早產(chǎn)兔神經(jīng)行為學上的改變亦符合早產(chǎn)兒GMH-IVH后的神經(jīng)行為學改變。

通過對建立的GMH-IVH早產(chǎn)兔動物模型進一步實驗研究，發(fā)現(xiàn)出血腦組織周圍可見較多的嗜中性粒細胞和小膠質(zhì)細胞圍繞，可見細胞的凋亡及神經(jīng)元的壞死及軸索的損傷[17]。β-淀粉樣前體蛋白和神經(jīng)微絲的免疫標記提示發(fā)生了軸突的損害。同時，通過對早產(chǎn)兒進行尸解也發(fā)現(xiàn)了同樣的GMH-IVH后腦室周圍細胞的凋亡及浸潤[3]。由此可見此種動物模型不但具有很好的重復性，且與臨床上GMH-IVH早產(chǎn)兒腦組織的病理生理變化較為一致，因此非常適合作為進一步研究早產(chǎn)兒GMH-IVH的理想動物模型，也將為進一步研究早產(chǎn)兒GMH-IVH后的繼發(fā)性腦損傷機制，驗證新的治療方法奠定基礎。

隨著醫(yī)療水平的提高，越來越多的早產(chǎn)兒得以救治、存活。但是早產(chǎn)兒存活只是我們臨床救治的初級目標，我們更需要做的是提高其生存質(zhì)量。GMH-IVH作為早產(chǎn)兒常見的腦損傷形式之一，需要給予極大的關注。對于早產(chǎn)兒GMH-IVH的研究，基礎研究的前提是動物模型的建立，只有建立了較為完善的動物模型，我們才能進一步從發(fā)病機制、治療、預后等方面更加細致的研究早產(chǎn)兒GMH-IVH，為今后的治療策略及治療方法開辟進一步的研究方向。相信通過我們的不斷努力，可以建立更為完善的早產(chǎn)動物GMH-IVH模型，從而進一步應用于臨床，為人類帶來更大的福音。

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醫(yī)學論文中有關實驗動物描述的要求

在醫(yī)學論文的描述中，凡涉及到實驗動物者，在描述中應符合以下要求：(1)品種、品系描述清楚；(2)強調(diào)來源交待；(3)遺傳背景；(4)微生物學質(zhì)量；(5)明確體質(zhì)量；(6)明確等級；(7)明確飼養(yǎng)環(huán)境和實驗環(huán)境；(8)明確性別；(9)有無質(zhì)量合格證；(10)有對飼養(yǎng)的描述(如飼料類型、營養(yǎng)水平、照明方式、溫度要求、濕度要求)；(11)所有動物數(shù)量準確；(12)詳細描述動物的健康狀況；(13)對動物實驗的處理方式有單獨清楚的交代；(14)全部有對照，部分可采用雙因素方差分析。

本刊編輯部

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.049

項目來源：河北省科學術研究與發(fā)展指導計劃(編號：10276159)

050082 石家莊市，中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院兒科NICU(暴麗莎、劉芳)；河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院兒科(郝玲、任常軍)

R 722.6

A

1002-7386(2014)02-0266-03

2013-07-18)