陸洪省 劉月月 趙曉舒 王亞舒

(山東科技大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山東青島266590)

我國許多煤礦，尤其是多年的老礦井，其煤層所處地質(zhì)構(gòu)造多富含礦物質(zhì)，在礦井水長(zhǎng)期的溶蝕過程中，通過一系列的生物化學(xué)反應(yīng)生成酸性礦井水。酸性礦井水的酸度值較低，一般pH值在2～5之間，利用酸性礦井水中中溫嗜酸菌對(duì)貧礦、尾礦中的多種金屬硫化物進(jìn)行浸礦處理是目前研究的熱點(diǎn)之一［1-6］。

細(xì)菌浸礦是利用細(xì)菌與礦石中的金屬化合物發(fā)生物化作用，將其中的金屬從礦石中溶脫出來的過程。細(xì)菌浸礦集采礦、選礦和冶金于一身，具有能耗少、成本低、流程簡(jiǎn)單和無污染等特點(diǎn)。目前，細(xì)菌浸礦中應(yīng)用較多的中溫嗜酸菌有氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、氧化硫硫桿菌(Acidi-thiobacillus thiooxidans)以及氧化亞鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillum ferrooxidans)等，對(duì)成團(tuán)泛菌在浸礦中應(yīng)用的研究在國內(nèi)未見報(bào)道［9-12］。

本研究是從兗州煤礦酸性礦井水中分離、篩選到1株具有產(chǎn)酸能力的浸礦(鐵礦)細(xì)菌，屬成團(tuán)泛菌，并對(duì)分離得到的菌株外部形態(tài)、生長(zhǎng)特性、除鐵效率以及系統(tǒng)分類等進(jìn)行了分析，以期為細(xì)菌冶金新菌種的發(fā)現(xiàn)和低品位礦石的綜合利用提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

9 K液體培養(yǎng)基［13］。A液:(NH4)2SO43.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，KCl 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，Ca(NO3)20.01 g/L，去離子水溶解，調(diào)pH值2.0，121℃滅菌20 min;B液:FeSO4·7H2O 44.78 g/ L，去離子水溶解，調(diào)pH值至2.0，用0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。

9 K固體培養(yǎng)基配制。在A液中加入15 g/L的瓊脂，121℃滅菌20 min，冷卻至70℃左右與B液混合待用。A液、B液的組成及配制方法同液體培養(yǎng)基配制。

9 K半固體培養(yǎng)基配置。在A液中加入3 g/L的瓊脂，其配制方法及其他成分組成同9K固體培養(yǎng)基。

1.2 菌株的分離和培養(yǎng)

將10 mL兗州煤礦酸性礦井水加入到盛有150 mL 9K液體培養(yǎng)基的三角瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)(30℃，150 r/min)15 d，培養(yǎng)至培養(yǎng)液的顏色呈紅棕色。取0.03 mL培養(yǎng)液劃線培養(yǎng)于9K固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)，挑取單菌落接入9K液體培養(yǎng)基中恒溫振蕩培養(yǎng)(30℃，150 r/min)，再劃線平板固體培養(yǎng)，重復(fù)上述操作3次，將純化菌株保存于9K半固體培養(yǎng)基中，待用。

1.3 溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)以及培養(yǎng)過程中pH的影響

將處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的菌株培養(yǎng)液5 mL接種于100 mL的9K液體培養(yǎng)基中，分別置于25℃、30℃和35℃條件下振蕩培養(yǎng)(150 r/min)9 d，利用血球計(jì)數(shù)板分別對(duì)細(xì)菌計(jì)數(shù)，確定最適生長(zhǎng)溫度，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液中pH值。

1.4 溫度對(duì)細(xì)菌氧化率的影響

將處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的菌株培養(yǎng)液5 mL接種于100 mL的9K液體培養(yǎng)基中，作為對(duì)照。同時(shí)將5 mL去離子水接入到100 mL的9K液體培養(yǎng)基中，分別對(duì)其進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)(30℃，150 r/min)，每隔72 h對(duì)培養(yǎng)液中二價(jià)鐵含量進(jìn)行測(cè)定，通過培養(yǎng)液中二價(jià)鐵含量變化評(píng)價(jià)菌株的氧化效率，二價(jià)鐵含量測(cè)定采用重鉻酸鉀滴定法［14-15］。

Fe2+氧化率計(jì)算公式:

Fe2+氧化率(%)=(C0－Ct)/C0×100%.

其中，C0、Ct分別為溶液中Fe2+的初始濃度和最終濃度，g/L。

1.5 菌株DNA的提取、PCR擴(kuò)增以及系統(tǒng)發(fā)育分析

1.5.1 細(xì)菌DNA提取方法

采用柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒(UNIQ－10)對(duì)菌株進(jìn)行DNA提取，提取方法按試劑盒說明書。

1.5.2 PCR擴(kuò)增引物

PCR擴(kuò)增引物采用細(xì)菌16S rDNA通用引物，引物序列為:7F，5'－CAGAGTTTGATCCTGGCT－3'; 1540R，5'－AGGAGGTGATCCAGCCGCA－3'。

1.5.3 PCR反應(yīng)條件

反應(yīng)體系(25μL):2.5μL 5×Buffer(with Mg2+)，0.5μL模板DNA，各0.5μL 7F(10μmol)和1540R(10μmol)，1μL dNTP(各2.5 mmol)，超純水定容至25μL。PCR反應(yīng)條件:98℃預(yù)變性3 min;98℃變性25 s，55℃退火25 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，再72℃延伸10 min。上海生工生物工程公司對(duì)菌株16S rDNA測(cè)序。

將測(cè)得的16S rDNA序列發(fā)送到DDBJ(DNA Data Bank of Japan，http:∥www.ddbj.nig.ac.jp/)數(shù)據(jù)庫中的Blast中進(jìn)行相似性比對(duì)，利用CustalX2.1和Mega5(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件創(chuàng)建系統(tǒng)樹，創(chuàng)建方法為鄰接法(Neighbor-Joining)。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離及形態(tài)特征

細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)劃線培養(yǎng)于9K固體平板上，經(jīng)5～6 d培養(yǎng)后，肉眼觀察到平板上有菌落隆起，菌落顏色最初為黃色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落逐漸過渡到鐵銹紅色。顯微鏡觀察菌株為桿狀，革蘭氏染色為陰性。

2.2 溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響測(cè)定

生長(zhǎng)在酸性礦井水環(huán)境中的細(xì)菌大多為嗜酸中溫菌，生長(zhǎng)溫度范圍一般為25～35℃［16-17］。分別采用25、30和35℃條件對(duì)菌株進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中利用血球計(jì)數(shù)板方法計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖1。

圖1 溫度對(duì)SKDYJ－1菌株生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of temperature on grow th of SKDYJ-1strain

從圖1可以看出，30℃培養(yǎng)條件下的細(xì)菌數(shù)目明顯高于25℃和35℃，當(dāng)溫度過高或過低時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)以及繁殖緩慢甚至受到抑制。培養(yǎng)9 d時(shí)細(xì)菌數(shù)目基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，細(xì)菌數(shù)目分別為2.0×108個(gè)/mL(25℃)，2.5×108個(gè)/mL(30℃)，1.7×108個(gè)/mL(35℃)。

2.3 溫度對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)過程中pH的影響測(cè)定

細(xì)菌在生物浸礦過程中除了將Fe2+氧化成Fe3+外，還將低價(jià)硫氧化成高價(jià)硫，形成硫酸而導(dǎo)致周圍環(huán)境pH發(fā)生變化。在25℃、30℃和35℃條件下培養(yǎng)，每隔72 h測(cè)定培養(yǎng)液pH值，結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對(duì)菌株SKDYJ－1培養(yǎng)過程中pH的影響Fig.2 Effect of temperature on pH value during the culture process of SKDYJ-1strain

由圖2可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的pH均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。25℃、30℃和35℃培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)液中pH值從2.6分別下降到1.9、2.52和2.34。30℃和35℃培養(yǎng)條件下pH下降趨勢(shì)相似且明顯高于25℃條件下的培養(yǎng)，在30℃條件下，最終發(fā)酵液pH值最低，說明該溫度條件下菌株產(chǎn)酸最多。因此，菌株最適合的生長(zhǎng)溫度為30℃，并且有利于酸的產(chǎn)生。

2.4 溫度對(duì)菌株氧化活性的影響測(cè)定結(jié)果

細(xì)菌的浸礦作用之一是將Fe2+氧化成Fe3+［18］，另一作用是通過產(chǎn)生酸性物質(zhì)維持生存環(huán)境為酸性，因此，細(xì)菌對(duì)Fe2+的氧化效率直接影響到浸礦效果。在25℃、30℃和35℃3種溫度下振蕩培養(yǎng)，每隔72 h測(cè)定菌株對(duì)Fe2+的氧化效果，結(jié)果見圖3。

圖3 不同溫度條件下菌株SKDYJ－1的Fe2+氧化率Fig.3 Fe2+oxidation rate of strain SKDYJ-1 under different tem peratures

從圖3可以看出，30℃、35℃以及25℃培養(yǎng)條件下菌株對(duì)二價(jià)鐵的最大氧化率分別為 6.52%、5.59%和2.79%，30℃培養(yǎng)條件下的氧化率明顯高于35℃和25℃條件，這可能與菌株在30℃培養(yǎng)條件產(chǎn)酸量最多有關(guān)。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)該菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1 434 bp的16S rDNA基因序列，將該序列發(fā)送到DDBJ(DNA data bank of Japan)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株與成團(tuán)泛菌P.agglomerans P1SAA(FJ611818)的同源性最高，達(dá)98%。選擇與菌株同源性較高的24個(gè)菌株的16S rDNA基因序列創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。

圖4 菌株SKDYJ－1的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(采用方法為緊鄰法)Fig.4 16S rDNA phylogenetic tree of Strain SKDYJ-1 w ith the nearest neighbor method

由圖4結(jié)果發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)樹分為兩個(gè)大類群，且菌株處于Pantoea組成的群中，與P.agglomerans P1SAA (FJ611818)親緣關(guān)系最近。綜合菌株生理生長(zhǎng)性質(zhì)以及系統(tǒng)發(fā)育分析，確定該菌株屬于成團(tuán)泛菌屬，并最終命名為Pantoea sp.SKDYJ－1。

3 結(jié)論

(1)分離得到的菌株SKDYJ－1桿狀，革蘭氏染色為陰性，最適宜生長(zhǎng)溫度為30℃。

(2)在25℃、30℃和35℃3種溫度下，對(duì)菌株SKDYJ－1振蕩培養(yǎng)，測(cè)定其對(duì)Fe2+的氧化率分別為2.79%，6.52%和5.59%，該菌株具有較高的浸礦能力，且在30℃培養(yǎng)條件下氧化能力最強(qiáng)。

(3)通過對(duì)菌株SKDYJ－1 DNA的提取，16S rDNA序列測(cè)定以及系統(tǒng)發(fā)育位置的分析，確定該菌株屬于成團(tuán)泛菌屬。

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