韓 星，石 磊，嚴(yán)華成，曾曉暉，張 營，關(guān) 慧，趙樹進(jìn)

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣州510515;2廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院)

在阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病機(jī)制中，腦內(nèi)淀粉樣蛋白(Aβ)產(chǎn)生與清除失衡，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Aβ蓄積和沉積形成淀粉樣斑塊，以及Aβ的神經(jīng)毒性是散發(fā)性AD最直接的病理因素［1］。在神經(jīng)內(nèi)源性免疫系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞起著非常重要的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞可以內(nèi)化吞噬Aβ，降低神經(jīng)細(xì)胞中Aβ含量［2］。維甲酸(RA)是機(jī)體正常發(fā)育不可越少的重要因子，RA信號(hào)參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化、凋亡，維持正常的免疫功能，以及神經(jīng)元的形成、存活［3］。在大腦皮層、海馬等區(qū)域存在RA受體，RA對(duì)各種神經(jīng)退行性疾病有神經(jīng)保護(hù)性作用。全反式維甲酸(ATRA)是人體內(nèi)RA最主要的活性成分，因此ATRA可能抵抗Aβ對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)毒性，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Aβ含量。2013年1～12月，我們觀察了ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞清除Aβ的影響，并探討其分子機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清(Hyclone)、DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone)、MTT(Sigma)、ATRA(Sigma)、Aβ42(上海楚肽生物科技有限公司)、小鼠GFAP抗體(Epitomics)、IgG-FITC(SanTa Cuz)、DAPI(Sigma)、APOE(兔單抗，Abcam)、BACE1一抗(Millipore)、HRP Goat anti-Rabbit IgG(CST)、β-actin(CST)、小鼠β-Amyloid ELISA試劑盒(上海西塘生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng) 取出生1～2 d的新生C57乳鼠的大腦，分離大腦皮層并剪碎，胰酶消化過濾，取濾液離心棄上清，加入DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)吹打成細(xì)胞懸液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)［4］。

1.2.2 原代細(xì)胞鑒定 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定，山羊血清封閉液封閉2 h，同時(shí)用 0.1%Triton X-100 破膜。GFAP(1∶300)孵育，4℃過夜。FITC(1∶200)室溫孵育2 h，同時(shí)用DAPI(10 μg/mL)染核。PBS沖洗，將細(xì)胞爬片轉(zhuǎn)移至載玻片上，滴加甘油封片。正置熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種至96孔板，細(xì)胞數(shù)約為4 000個(gè)/孔，實(shí)驗(yàn)分為6組，每組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔。細(xì)胞貼壁24 h后，棄培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組中分別加入 200 μL含0.01、0.1、1、10 μmol/L 的 ATRA，且同時(shí)含有 2 μg/mL Aβ42培養(yǎng)基，對(duì)照組加入 200 μL 含有 2 μg/mL Aβ42培養(yǎng)基，正常組僅加入培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)24 h后向每孔內(nèi)加入MTT 20 μL(5 g/L)，孵育4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min后酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長下各孔吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組組OD值－空白對(duì)照OD值)/(對(duì)照組OD值－空白對(duì)照OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)Aβ含量 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組加入含 2 μg/mL Aβ42 和 1 μmol/L ATRA 的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含2 μg/mL Aβ42的培養(yǎng)基，孵育24 h后，分別收集兩組的培養(yǎng)基及星形膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞加入IP裂解液，收集上清液。采用小鼠β-Amyloid ELISA試劑盒分別檢測(cè)培養(yǎng)基、星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的Aβ含量。

1.2.5 Western blot法檢測(cè) APOE、BACE1 蛋白取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，分為正常組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，分別加入培養(yǎng)基、含 2 μg/mL Aβ42的培養(yǎng)基、含μg/mL Aβ42和1 μg/mL ATRA 的培養(yǎng)基，孵育 24 h后，分別收集各組星形膠質(zhì)細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)總蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉:一抗4℃過夜，次日二抗孵育1 h。化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶光密度值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)(并做方差齊性檢驗(yàn))，多組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞純度鑒定 采用GFAP、DAPI共染細(xì)胞的方法鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞。GFAP免疫熒光陽性者呈綠色熒光，即為星形膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞純度＞95%。

2.2 不同濃度ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響 正常組、對(duì)照組及 0.01、0.1、1、10 μmol/L 實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率分別為(100±3.57)%、(88.7±1.96)%、(93.3 ±2.93)%、(94.7 ±2.27)%、(95.1±1.88)%、(89.7 ±2.40)%。對(duì)照組存活率明顯低于正常組，各實(shí)驗(yàn)組存活率均高于對(duì)照組(P＜0.05或 ＜0.01)。

2.3 ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞Aβ清除的影響 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞外培養(yǎng)基中Aβ的相對(duì)表達(dá)量分別為(100 ±2.36)%、(100 ±1.49)%，細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)基中Aβ 的相對(duì)表達(dá)量分別為(85.53 ±7.71)%、(59.30 ±1.11)%。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外培養(yǎng)基中的Aβ含量較對(duì)照組均明顯下降(P＜0.05或＜0.01)。

2.4 ATRA對(duì)BACE1、APOE表達(dá)的影響 正常組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的APOE相對(duì)表達(dá)量分別為0.194±0.030、0.413 ±0.062、0.472 ±0.098，BACE1 相對(duì)表達(dá)量分別為 0.129 ± 0.030、0.138 ± 0.045、0.114 ±0.036。對(duì)照組APOE表達(dá)較正常組明顯增加，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯增加(P均＜0.01)。各組BACE1表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＞0.05)。

3 討論

Aβ是β-分泌酶和γ-分泌酶的綜合裂解產(chǎn)物，是神經(jīng)退行性疾病的生物標(biāo)志物［5］。Aβ的聚集、沉淀形成淀粉樣斑塊，進(jìn)而誘發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)功能紊亂，是AD的主要病理變化［6］。星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持CNS的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也是CNS系統(tǒng)中最重要的免疫細(xì)胞。

APOE ε4等位基因是散發(fā)型AD的主要危險(xiǎn)因子，APOE4對(duì)Aβ的親和力低的缺陷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Aβ清除減弱，從而促進(jìn) Aβ 聚集［7］。但 APOE2、APOE3對(duì)Aβ更具親和力，抑制Aβ聚集，促進(jìn)內(nèi)含體對(duì)Aβ的內(nèi)吞作用，增加細(xì)胞內(nèi) Aβ的清除［8］。Cramer等［9］研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶增殖激活受體激動(dòng)劑貝莎羅丁可以直接誘導(dǎo)AD轉(zhuǎn)基因APOE表達(dá)上調(diào)，增加腦內(nèi)Aβ的清除，明顯改善小鼠的認(rèn)知功能障礙。因此認(rèn)為，APOE2、APOE3能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Aβ的清除，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)性作用。

RA信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化、凋亡，維持正常的免疫功能，以及神經(jīng)元的形成、存活［10］，參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與發(fā)展，與AD有密切聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，ATRA可以促進(jìn)APOE的表達(dá)顯著增加，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Aβ聚集，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。這可能由于ATRA信號(hào)可以激活 LXR/RXR、PPARγ/RXR等受體，誘導(dǎo)APOE、ABCA1等表達(dá)上調(diào)，增加 Aβ的清除率［10，11］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)高濃度的 ATRA 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞具有一定毒性，其分子機(jī)制不明確。ATRA具有抗氧化應(yīng)激損傷、抗炎作用、促進(jìn) α-分泌酶裂解APP、誘導(dǎo)ApoE表達(dá)等作用，其分子機(jī)制涉及各個(gè)環(huán)節(jié)［12，13］，仍需進(jìn)一步深入研究。

［1］Querfurth HW，La Ferla FM.Mechanisms of disease［J］.N Engl J Med，2010，362(4):329-344.

［2］Rivest S.Regulation of innate immune responses in the brain［J］.Nat Rev Immunol，2009，9(6):429-439.

［3］Lane MA，Bailey SJ.Role of retinoid signalling in the adult brain［J］.Prog Neurobiol，2005，75(4):275-293.

［4］周欣，明曉云，康頌建，等.差速貼壁技術(shù)對(duì)大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞純化率的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(15):2.

［5］Hardy JA，Higgins GA.Alzheimer＇s disease:the amyloid cascade hypothesis［J］.Science，1992，256(5054):184-185.

［6］Blennow K，de Leon MJ，Zetterberg H.Alzheimer＇s disease［J］.Lancet，2006，368(9533):387.

［7］Poirier J，Bertrand P，Poirier J，et al.Apolipoprotein E polymorphism and Alzheimer＇s disease［J］.The Lancet，1993，342(8873):697-699.

［8］Verghese PB，Castellano JM，Holtzman DM.Apolipoprotein E in Alzheimer＇s disease and other neurological disorders［J］.The Lancet Neurology，2011，10(3):241-252.

［9］Cramer PE，Cirrito JR，Wesson DW，et al.ApoE-directed therapeutics rapidly clear β-amyloid and reverse deficits in AD mouse models［J］.Science，2012，335(6075):1503-1506.

［10］Citron M.Alzheimer＇s disease:strategies for disease modification［J］.Nat Rev Drug Discov，2010，9(5):387-398.

［11］Chen J，Costa LG，Guizzetti M.Retinoic acid isomers up-regulate ATP binding cassette A1 and G1 and cholesterol efflux in rat astrocytes:implications for their therapeutic and teratogenic effects［J］.J Pharmacol Exp Ther，2011，338(3):870-878.

［12］Sodhi RK，Singh N.Retinoids as potential targets for Alzheimer＇s disease［J］.Pharmacology Biochemistry and Behavior，2014，120:117-123.

［13］Nomoto M，Takeda Y，Uchida S，et al.Dysfunction of the RAR/RXR signaling pathway in the forebrain impairs hippocampal memory and synaptic plasticity［J］.Mol Brain，2012，5:8.