盧 聰 鮑勇剛 石松傳 William Jia 劉新民

(1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京，100193;2北京博肽健諾威生物技術(shù)有限公司，北京，100085;3加拿大UBC大學(xué)，加拿大)

人參(Panax ginseng C.A.Meyer)是我國(guó)名貴中藥材，為五加科人參屬植物，陰生且生長(zhǎng)緩慢，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較高。皂苷是人參主要的活性物質(zhì)，研究表明，人參皂苷具有廣泛的生理活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抑制細(xì)胞凋亡等[1]。因此人參皂苷含量被認(rèn)為是衡量人參內(nèi)在質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。而人參皂苷的含量因品種、部位、生長(zhǎng)條件、采集時(shí)間以及炮制方法等不同而存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;近年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)尤其是組學(xué)技術(shù)在人參研究中的廣泛深入應(yīng)用，人參皂苷合成相關(guān)的基因與蛋白組學(xué)的研究逐漸深入到人參研究中，而人參皂苷含量也與此類基因及蛋白表達(dá)的變化息息相關(guān)。本文從不同生長(zhǎng)環(huán)境、皂苷合成相關(guān)基因及差異表達(dá)蛋白這三方面對(duì)人參皂苷含量變化的影響因素進(jìn)行歸納整理，以期對(duì)人參皂苷含量相關(guān)研究提供有益的幫助。

1 人參皂苷及其含量變化

人參皂苷由糖的半縮醛羥基與非糖組分構(gòu)成，屬于三萜類化合物，其中非糖部分稱為苷元。根據(jù)苷元化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，人參皂苷分為兩大類型，即達(dá)瑪烷型和齊墩果烷型。達(dá)瑪烷型為四環(huán)三萜類皂苷，齊墩果烷型為五環(huán)三萜類皂苷。達(dá)瑪烷型人參皂苷依據(jù)糖基在碳骨架上的位置不同(C－3，C－6及C－20)被分為原人參二醇型(Protopanaxadiols，PPD)和原人參三醇(Protopanaxatriols，PPT)。二醇型達(dá)瑪烷皂苷中糖基位于苷元碳骨架的C－3和/或C－20位，包括Rb1，Rb2，Rc，Rd，Rg3，Rh2，Rh3;三醇型達(dá)瑪烷皂苷中糖基位于苷元碳骨架的C－3、C－6和/或C－20位，包括 Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1。

1854年，Garriques等在進(jìn)行西洋參化學(xué)成分研究時(shí)，最早分離出了含有皂苷成分的組分[2]。但直到1963年，日本學(xué)者Shibata才從人參根中分離鑒定出皂苷及其結(jié)構(gòu)[3－4]，這些皂苷被稱為人參皂苷。這之后，研究者們不斷從人參根、莖、葉、花蕾、果實(shí)及種子中分離鑒定出各種皂苷成分，目前已經(jīng)確認(rèn)人參總皂苷是由100多種人參皂苷組成，其中已被分離并鑒定結(jié)構(gòu)的皂苷達(dá)60 多種[1]。

不同的人參其皂苷含量是有差別的。何紹玉等[5]通過對(duì)林下山參和園參中人參皂苷含量的分析比較證實(shí)人參總皂苷的含量林下山參高于園參。荊淑芹等[6]采用高效液相色譜法對(duì)園參、林下參、紅參三種人參的皂苷含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)園參與紅參在皂苷Rg1、Re、Rb2含量上是有差異的，林下參中皂苷單體Re含量高于園參中，而林下參與紅參在皂苷Rb2、Rf、Re以及皂苷總量上也是有差異的。趙亞會(huì)等[7]對(duì)淺橙果人參、深橙果人參、橙果人參、紅果人參、黃果人參、大馬牙類型人參、二馬牙類型人參、圓膀圓蘆類型、吉參一號(hào)以及長(zhǎng)脖類型人參進(jìn)行含量測(cè)定與分析，結(jié)果顯示:在不同果實(shí)顏色的人參類型中，以純色系類型紅果和黃果人參的單體皂苷含量總和較高，且它們的單體皂苷Rg1含量也呈相同趨勢(shì)。在以根部形態(tài)為分類特征的人參類型中，大馬牙型人參中的Rg1含量最高。而人參不同部位的皂苷含量也有差異。Shi等[8]對(duì)5年生人參根、葉、根毛、根莖、莖的總皂苷和單體皂苷的量進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示:總皂苷含量(mg/g)最高的是根毛(85.90)，最低的是莖(9.79)，僅次于根毛的是葉(69.85)、根莖(38.33)和根(36.41)。人參皂苷Re在人參葉和根毛中的量是人參皂苷Rg1在其中的5倍，但是在人參根中則低于人參皂苷Rg1;人參皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd在人參根毛中的量最高，在人參莖中沒有檢測(cè)到Rb3和Rc。而李闖等[9]進(jìn)行了更多不同人參部位皂苷含量的研究，結(jié)果顯示:人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd在人參須根和支根中含量比其他部位均高;皂苷Rg1在葉和果肉中含量顯著;此外Re在人參葉和果肉中含量均很高，約占總皂苷含量的50%。這兩位的研究結(jié)果相類似，均提示研究者們除了人參根能得到完全利用外，人參的其他部位如葉和果肉亦含有豐富的皂苷成分，極具價(jià)值潛質(zhì)，引導(dǎo)人們進(jìn)行更加深入的人參不同部位皂苷成分和含量的研究工作。

2 不同生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)人參皂苷含量的影響

人參皂苷含量受多種因素影響，而由于諸如莖葉數(shù)、生育期、生長(zhǎng)年限、土壤、施肥、光照、栽培方式、采收期等的不同，都使得不同產(chǎn)地的人參中總皂苷及單體皂苷的含量具有顯著的差異[10]。張燕娣等[11]通過研究不同莖葉數(shù)人參在不同生育期的人參皂苷含量變化，發(fā)現(xiàn)單體皂苷和總皂苷的結(jié)果基本一致，從總皂苷和單體皂苷的結(jié)果看出人參皂苷含量:雙莖葉＞三莖葉＞單莖葉即人參中皂苷含量隨光合葉面積的變化而變化，而且在紅果期的末期含量最高。Lee等[12]分析了4年生人參葉在受光率為5%、10%、20%、30%時(shí)人參根總皂苷量的差異，發(fā)現(xiàn)總皂苷量隨受光率的增大而增加，而在30%受光率時(shí)略降低。Kim等[13]分析比較了光量子分別為 19、39、26、35 μmol/(s·m2)的藍(lán)色、紅色、1∶1藍(lán)紅混合光LED及熒光燈對(duì)2年生人參總皂苷量的影響，結(jié)果得出:總皂苷量(mg/g)由高到低的順序?yàn)樗{(lán)色LED(46.1)＞熒光燈(45.3)＞1∶1藍(lán)紅混合光LED(40.2)＞紅色LED(40.1)，但各種光源間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。張?zhí)m蘭等[14]通過分析不同年份(5～17年)林下山參葉中多個(gè)皂苷類成分的含量，考察年份對(duì)皂苷含量的影響，并與已有的研究報(bào)道作比較發(fā)現(xiàn):5～17年林下山參葉皂苷成分隨著生長(zhǎng)年份增長(zhǎng)大體上存在降低－升高－降低的變化過程，其中14年林下山參葉中的皂苷類成分含量最高，其各皂苷類成分含量均處于較高水平，尤其是人參皂苷Re和人參皂苷Rd，顯著高于其他年份林下山參葉且其總皂苷成分含量最高。而同一批5～17年林下山參根部的皂苷類成分研究表明，5～10年根部皂苷類成分升高，隨后降低，14年生林下山參總皂苷含量最低，16、17年生林下山參總皂苷含量又開始升高，與葉中的變化趨勢(shì)相反。An等[15]對(duì)4月18日、5月15日、6月18日、8月18日、9月18日、10月18日采收的4年生人參的總皂苷和單體皂苷量進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示:總皂苷量分別為 2.52%、4.09%、1.92%、2.14%、1.82%、1.75%，總皂苷量在5月15日最多，之后隨采收期的延長(zhǎng)而逐漸減少，且各采收期間具有顯著差異;人參皂苷Re等7種單體皂苷量的變化趨勢(shì)與總皂苷量的變化趨勢(shì)相似，也在5月15日最多。孫海等[16]研究證實(shí)土壤養(yǎng)分影響人參皂苷的積累，其中土壤中有機(jī)質(zhì)和全量氮、磷直接影響人參總皂苷的積累。土壤有機(jī)質(zhì)是其他養(yǎng)分的來源，是微生物生存和繁衍的碳源和氮源，直接影響著土壤中速效養(yǎng)分的供給，而速效養(yǎng)分是人參完成正常生理代謝和進(jìn)行次生代謝所必須的物質(zhì)基礎(chǔ);氮和磷的含量則直接影響人參的次生代謝途徑，影響人參皂苷的合成。Li等[17]對(duì)直播栽培與移植栽培5年生人參的總皂苷及單體皂苷量進(jìn)行了比較，結(jié)果得出直播參的主根及支根的總皂苷量為23.8 mg/g、40.9 mg/g，高于移植參的 22.2 mg/g、35.7 mg/g，而須根則為移植參總皂苷量83.1 mg/g高于直播參78.8 mg/g，結(jié)合干物質(zhì)量計(jì)算出的直播參與移植參的皂苷量分別為 722.1 mg、1142.9 mg;單體皂苷 Rb2、Rb3、Rf與測(cè)試的3個(gè)部位無關(guān)，直播參均高于移植參，而Rd和Rh1則相反，直播參均低于移植參。據(jù)此為了綜合利用寶貴的人參資源，擴(kuò)大人參具有藥用價(jià)值的部位，合理進(jìn)行人工種植和炮制等提供一定的參考，從多方位多因素進(jìn)行更深入的皂苷含量的研究是十分必要的。

3 皂苷合成相關(guān)基因?qū)θ藚⒃碥蘸康挠绊?/h2>

根據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究，人參皂苷的生物合成步驟是在許多關(guān)鍵酶的共同作用下完成的，這些酶包括3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)、法呢基焦磷酸合酶(FPS)、鯊烯合成酶(SS)、鯊烯環(huán)氧酶(SE)、氧化鯊烯環(huán)化酶(OSCS)、β－香樹素合成酶(β－AS)、達(dá)瑪烷二醇合成酶(DS)、細(xì)胞色素 P450(CYP450)以及糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)。研究者們對(duì)人參皂苷合成中關(guān)鍵酶的基因進(jìn)行分析研究發(fā)現(xiàn)，不同關(guān)鍵酶基因的變化與皂苷含量變化的相關(guān)性極高。蔣世翠等[18]在分析了4年生西洋參不同組織器官中總皂苷和單體皂苷量的差異及其與人參皂苷合成途徑中鯊烯合成酶(SQS)和鯊烯環(huán)氧酶(SQE)基因表達(dá)量之間的關(guān)系;這些組織器官分別是:須根、側(cè)根、根皮(周皮和韌皮部)、根心(木質(zhì)部)、蘆頭、莖、小葉柄、大葉柄、葉片、果莖、果柄、果肉、種皮、種仁。結(jié)果表明 SQS和SQE基因在14個(gè)組織器官中的表達(dá)量具有非常顯著的差異(P＜0.01)并與人參皂苷 Re、Rg1、Rb1、Rd和總皂苷量之間有顯著的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。

此外，提高或降低人參皂苷合成關(guān)鍵限速酶基因的表達(dá)，會(huì)極大影響人參中的皂苷含量。Lee等[19]將克隆分離出的鯊烯合成酶基因(PgSS1，AB115496)導(dǎo)入人參不定根中過量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)七種人參皂苷(Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf，Rg1)含量與未轉(zhuǎn)基因植株相比均有所增加，人參總皂苷量是對(duì)照的3倍。Han等[20]利用RNAi技術(shù)研究了SQE基因在人參皂苷合成中的作用，通過HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SQE基因沉默后，人參總皂苷量降低了84.5%。Kim等[21]將人參的PgFPS轉(zhuǎn)到積雪草毛狀根中使其過量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)積雪草達(dá)瑪烷合酶的mRNA水平顯著提高，三萜皂苷羥基積雪草苷和積雪草苷的產(chǎn)量瞬時(shí)升高。Han等[22]對(duì)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的人參不定根進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到9個(gè)候選CYP450全長(zhǎng)基因。其中CYP716A47基因不僅可使得茉莉酸甲酯誘導(dǎo)表達(dá)量上調(diào)，而且轉(zhuǎn)入過量表達(dá)SS基因的轉(zhuǎn)基因人參植株后能使人參根中皂苷的產(chǎn)量提高。除上述相關(guān)研究外，3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)基因相關(guān)的轉(zhuǎn)基因及基因敲除等研究未見相關(guān)報(bào)道，而近年來雖有關(guān)于糖基轉(zhuǎn)移酶基因克隆的報(bào)道[23]，但迄今尚未有從人參屬植物中克隆到GT基因及相關(guān)轉(zhuǎn)基因等研究的報(bào)道。

4 人參中差異表達(dá)蛋白對(duì)皂苷含量的影響

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷成熟及廣泛應(yīng)用，除了皂苷代謝相關(guān)的酶類變化所導(dǎo)致的皂苷含量變化外，研究者們期望利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定其他與皂苷變化相關(guān)的差異表達(dá)蛋白。早期的人參蛋白組學(xué)分析多是對(duì)培養(yǎng)的人參須根進(jìn)行，因?yàn)榕囵B(yǎng)的人參須根作為研究材料有無法替代的優(yōu)勢(shì)。Kim等[24]使用2－DE技術(shù)從培養(yǎng)的人參須根中共分離出280個(gè)蛋白點(diǎn)，推測(cè)出其中159個(gè)蛋白的功能，最終確證91個(gè)。在這些確證功能的蛋白中，超過20%的蛋白參與能量代謝與應(yīng)激反應(yīng)，但是沒有發(fā)現(xiàn)參與次級(jí)代謝產(chǎn)物生成的酶類。Lum等[25]同樣用雙向電泳技術(shù)，比較了人參四個(gè)不同部位主根、須根、蘆頭及參皮的蛋白差異，雖然沒有特別突出的蛋白差異點(diǎn)出現(xiàn)，但是電泳圖上相同蛋白點(diǎn)的排列模式卻有顯著差別。孫立偉等[26]分析園參蘆頭、主根、須根、表皮等4個(gè)不同部位的雙向電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)了人參不同部位13個(gè)相同的蛋白點(diǎn)，并在主根中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)特異點(diǎn)，在蘆頭和表皮中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)特異點(diǎn)，在須根中發(fā)現(xiàn)了1組特異點(diǎn)群 (3個(gè)點(diǎn))。Nam等[27]比較了在不同光照環(huán)境下，人參葉片的蛋白表達(dá)差異，鑒定出的蛋白點(diǎn)功能多與能量代謝、蛋白質(zhì)穩(wěn)定以及氧化應(yīng)激保護(hù)等相關(guān)。Kim等[28]比較了培養(yǎng)的人參須根以及野生人參根中的蛋白差異，雖然有超過了90個(gè)共同的蛋白點(diǎn)，但是野生人參根中的表達(dá)蛋白依舊與培養(yǎng)的人參根須有很大的差異。而使用蛋白組學(xué)技術(shù)分析不同品種人參后，不同人參樣品的2－DE電泳圖間有明顯的差別，能夠用于不同人參品種的鑒別[29]。最近，Nagappan等[30]用2－DE技術(shù)比較分析了人參與印度參根中差異表達(dá)的蛋白，從電泳中分別挑出21個(gè)高麗參蛋白及35個(gè)印度參蛋白的序列進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，并分別對(duì)其中14個(gè)和22個(gè)高麗參及印度參的蛋白功能進(jìn)行確定，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與細(xì)胞代謝，防御以及次級(jí)代謝，但是共同參與睡茄內(nèi)酯和人參皂苷生物合成的蛋白卻沒有發(fā)現(xiàn)。上述研究表明，雖然皂苷合成在人參生理代謝過程中屬于次級(jí)代謝反應(yīng)，但是其他人參生理代謝相關(guān)蛋白的變化對(duì)皂苷合成的可能影響不應(yīng)忽略。遺憾的是，即便不同環(huán)境下的人參中誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白是顯著不同的，但未鑒定出與人參皂苷合成直接相關(guān)的差異表達(dá)蛋白。

5 展望

人參皂苷產(chǎn)量低、活性高，為滿足日益增長(zhǎng)的產(chǎn)業(yè)化需求，因此人參皂苷含量變化的研究也不斷向縱深發(fā)展?，F(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用尤其是以基因組及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為代表的組學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使得人參皂苷含量變化相關(guān)的研究取得了很大的進(jìn)展但也存在著一些問題，如不同生境下人參皂苷含量變化的機(jī)理研究尚需深入;缺乏有效的人參組培體系從而限制人參轉(zhuǎn)基因研究的開展，人參基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的缺乏成為制約發(fā)現(xiàn)、鑒定差異表達(dá)蛋白的主要因素等。相信隨著人參基因組測(cè)序工作的展開，以及代謝組、轉(zhuǎn)錄組等新技術(shù)的廣泛深入應(yīng)用，人參皂苷含量變化相關(guān)的研究工作將進(jìn)入更加全面的發(fā)展時(shí)期，也必將對(duì)人參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來深遠(yuǎn)影響。

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