卜漢萍 王 璐 許 宙 程云輝

BU Han－ping WANG Lu XU ZhouCHENG Yun－h(huán)ui

（長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114）

（College of Chemistry and Biology Engineering，Changsha University of Science and Technology，Changsha，Hunan 410114，China）

近年來，隨著人們生活方式的轉(zhuǎn)變，人體免疫能力受到諸多因素的影響與挑戰(zhàn)，老齡化、肥胖癥、飲食不當(dāng)、生活壓力與不良生活習(xí)慣皆可導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降而引發(fā)各種疾病，尋求適宜的免疫調(diào)節(jié)劑來提高人體免疫能力，成為了人類社會(huì)的迫切需要。

傳統(tǒng)的藥物免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)機(jī)體有一定的毒副作用，而免疫活性肽作為安全無副作用的免疫調(diào)節(jié)劑在食品、藥品與飼料等領(lǐng)域已顯出其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，免疫活性肽可通過促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖、提高巨噬細(xì)胞活性、增強(qiáng)自噬細(xì)胞（NK）機(jī)能、促進(jìn)細(xì)胞因子生成［1，2］等來提高機(jī)體免疫力。

目前，國(guó)外學(xué)者［3－5］雖然已從多種動(dòng)植物蛋白中獲得了氨基酸序列和結(jié)構(gòu)明確的肽段，并對(duì)其活性機(jī)理做了系統(tǒng)研究，但工業(yè)化制備的免疫活性肽并不多見；國(guó)內(nèi)學(xué)者［6－8］對(duì)免疫活性肽的研究主要集中在制備方法與分離純化工藝研究方面，具有明確氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的免疫活性肽的報(bào)道較少。要對(duì)免疫活性肽進(jìn)行生理活性、結(jié)構(gòu)及其構(gòu)效關(guān)系的研究，首先必須富集得到較高純度的活性肽，然后再深入研究其免疫活性機(jī)制。因此，研究高純度免疫活性肽的高效制備方法與免疫活性機(jī)制皆具重要意義。文章對(duì)免疫活性肽的酶法制備、分離純化和活性機(jī)制進(jìn)行了綜述，可為肽類免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)提供理論參考。

1 免疫活性肽的酶法制備

目前主流的制備免疫活性肽的方法主要有酶解法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法等，因生產(chǎn)條件溫和、安全性較高、價(jià)格低廉且可得到特定功能的活性肽等優(yōu)點(diǎn)，酶解法已成為從蛋白質(zhì)中釋放生物活性肽的最常用方法。

雖然食源性蛋白在生物體內(nèi)的消化過程中也可酶解成氨基酸與多肽類物質(zhì)，但體內(nèi)酶解具有不完全性和不確定性，不能有目的地釋放出具有特定生物活性的肽段。近年來研究［9］發(fā)現(xiàn)蘊(yùn)藏于蛋白質(zhì)多肽鏈中的肽類物質(zhì)的生理活性往往還強(qiáng)于其母體蛋白，若選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌阁w外水解蛋白，就有可能釋放出母體蛋白質(zhì)中有生理活性的肽段，按工業(yè)化規(guī)模制備出具特定生理功能的活性肽。

1.1 酶法制備免疫活性肽的底物蛋白

研究表明體外酶解有可能釋放出母體蛋白質(zhì)中有活性的肽段［6］，母體蛋白的氨基酸組成［10］、亞基序列［11，12］與空間結(jié)構(gòu)［13］皆影響著肽的免疫活性。從大量免疫活性肽的研究［14，15］中發(fā)現(xiàn)，免疫活性肽通常具有疏水性氨基酸，如Ala、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Pro、Trp等。因此，對(duì)制備免疫活性肽的蛋白，有必要對(duì)其氨基酸組成與結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

目前，制備免疫活性肽的蛋白主要來源于動(dòng)物與植物蛋白。以動(dòng)物蛋白作為酶法制備免疫活性肽底物蛋白的研究報(bào)道較多，Jolles等［16］采用胰蛋白酶酶解乳蛋白，分離純化后獲得一個(gè)具有免疫活性的肽段，研究表明從α－乳白蛋白中獲得的免疫活性肽Tyr－Gly與Tyr－Gly－Gly能在體外有效促進(jìn)人外周血細(xì)胞的增殖，增殖率分別為90%和35%，促進(jìn)細(xì)胞代謝過程中蛋白合成（25%）［17］。Jairo Duarte等［18］采用太平洋無須鱈魚蛋白為原料，利用酵母代謝酶發(fā)酵鱈魚蛋白，探討發(fā)酵物的免疫活性，研究結(jié)果表明0.3 mg／m L發(fā)酵物連續(xù)灌喂小鼠7 d后能有效促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，Ig A＋細(xì)胞數(shù)量在小腸固有層增加，IL－4、IL－6和IL－10細(xì)胞數(shù)量在相同位置有顯著性增加，此外，IFNγ和TNFaα促炎因子含量也得到增加，因此發(fā)酵物能增強(qiáng)小鼠機(jī)體的非特異性免疫能力。丁進(jìn)峰等［19］采用響應(yīng)面優(yōu)化的木瓜蛋白酶酶解海蜇膠原蛋白工藝制備免疫活性肽，研究發(fā)現(xiàn)在1%加酶量、55℃，p H 6.5，酶解時(shí)間180 min的條件下，海蜇膠原蛋白肽能顯著促進(jìn)小鼠免疫器官脾臟指數(shù)（4.857 mg／g）和胸腺指數(shù)（2.083 mg／g），并且能提高小鼠巨噬細(xì)胞的各項(xiàng)吞噬指標(biāo)，如碳廓清指數(shù)0.033、吞噬指數(shù)6.645、伴刀球蛋白指數(shù)0.220。

以植物蛋白作為酶法制備免疫活性肽底物蛋白的研究報(bào)道涉及大米蛋白、大豆蛋白和小麥蛋白。Takahashi M等［20］采用胰蛋白酶水解可溶性大米蛋白，其水解物分離純化后獲得具有免疫調(diào)節(jié)功能的肽段為 Gly－Tyr－Pro－Met－Tyr－Pro－Leu－Pro－Arg，此九肽能引起豚鼠回腸收縮，具有提高白細(xì)胞吞噬功能，吞噬指數(shù)為1.5。陳季旺等［21］采用胰蛋白酶酶解米糠，凝膠過濾和RP—HPLC對(duì)酶解物進(jìn)行分離純化，獲得 一 個(gè) 氨 基 酸 序 列 為 Asp－Gly－Ser－Val－Arg 的 阿 片 活性肽。

1.2 酶法制備免疫活性肽的酶種

蛋白酶的種類決定了酶解的作用位點(diǎn)和酶解程度，從而可獲得具有不同氨基酸組成和分子量的肽段。

胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶與復(fù)合蛋白酶常用于制備免疫活性肽。房新平［22］、Hu Hou等［23］以淋巴細(xì)胞增殖活性為考察指標(biāo)，采用胰蛋白酶分別對(duì)牛胎盤蛋白、阿拉斯加鱈魚進(jìn)行酶解，皆獲得具有免疫活性功能的肽段。JingJiao Ma等［24］用堿性蛋白酶酶解乳清蛋白，以淋巴細(xì)胞增殖活性作為檢測(cè)指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)酶解物較母體蛋白能更顯著地促進(jìn)細(xì)胞增殖，脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)為1.71。馬儷珍等［25］以脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)考察了酶（木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶與堿性蛋白酶）、底物濃度、酶解時(shí)間和加酶量等因素的影響，研究發(fā)現(xiàn)采用木瓜蛋白酶在加酶量1 600 U／g，4 h，底物濃度1∶4.5（m∶m）條件下，能夠獲得較高免疫活性的多肽。

1.3 水解度對(duì)酶法制備免疫活性肽的影響

水解度（DH）可以反映蛋白質(zhì)被水解的程度，在相同條件下它與酶的種類及活力、底物種類有關(guān)。DH越高，蛋白質(zhì)水解得越徹底，獲得的分子量較小的肽段就越多，免疫活性肽的分子量大多小于2 k Da，但過高DH將產(chǎn)生較多的游離氨基酸?？梢酝ㄟ^水解度來控制酶解反應(yīng)的進(jìn)程，但僅用DH作為考察指標(biāo)是不完善的，通常應(yīng)結(jié)合生理活性指標(biāo)來考察制備免疫活性肽的工藝條件。

曾珍等［26］選用不同蛋白酶酶解兔骨粉，以DH和小鼠淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)（SI）作為指標(biāo)，篩選較適宜的蛋白酶，并優(yōu)化酶解工藝，研究結(jié)果表明，采用胰蛋白酶酶解兔骨粉，DH對(duì)SI有顯著影響，隨著DH不斷提高，SI值的變化趨勢(shì)是先增大后減小，可能是因?yàn)殡S著DH提高，具有免疫活性的肽段被進(jìn)一步降解了。Xiang Zhen Kong等［27］比較了 DH對(duì)3種大豆蛋白（InSP、SPI與SSP）水解物分子量的影響，相同條件下，InSP的DH較其它兩種蛋白高，獲得的水解物分子量最小為655.3 Da；以InSP為底物，考察不同條件對(duì)SI、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力與DH的影響，研究發(fā)現(xiàn)在60℃獲得的酶解物的DH最高，此時(shí)SI值與吞噬能力也最強(qiáng)。

2 免疫活性肽的分離純化

酶法制備的活性肽中，因蛋白酶酶切位點(diǎn)具有一定的隨機(jī)性和不確定性，導(dǎo)致酶解過程中產(chǎn)生了大量分子量大小相近但氨基酸序列不同的肽段。因此，要對(duì)酶法制備的活性肽進(jìn)行生物活性、結(jié)構(gòu)及其構(gòu)效關(guān)系的研究，就必須對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，以富集得到較高純度的生物活性肽。

在生物活性肽常用的分離純化方法中，膜分離、等電點(diǎn)分離、離子交換樹脂分離和親和色譜分離已在工業(yè)化生產(chǎn)中得到了較廣泛的應(yīng)用，凝膠色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管色譜、高壓液相色譜、質(zhì)譜等分離技術(shù)則在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上得到了較普遍的使用。

2.1 膜分離

鑒于目前國(guó)內(nèi)外研究［6］報(bào)道的免疫活性肽的相對(duì)分子量大多在2 k Da以下，因此，按分子量對(duì)肽進(jìn)行分離純化是一種有效可行的方法，并且適用于工業(yè)化生產(chǎn)。膜分離技術(shù)基于膜本身孔徑的大小，比其孔徑大的物質(zhì)被截留在膜上，而直徑較孔徑小的物質(zhì)可以透過膜，依據(jù)此原理可對(duì)不同分子量大小的活性肽進(jìn)行分離純化。

Bingjun Qian等［28］采用超濾膜對(duì)乳酸桿菌發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)肽的分子量范圍為3～5 k Da時(shí)，其抗氧化活性比較高；繼續(xù)分離純化則可得到一個(gè)具有免疫活性的F6組分，此組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)為0.729。Milda Stuknyte等［29］采用超濾膜按分子量大小對(duì)牛乳乳酸菌發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，研究發(fā)現(xiàn)分子量小于3 k Da的分離組分能顯降低Caco－2細(xì)胞中NF－κB因子的活性，具有免疫調(diào)節(jié)的作用。

2.2 色譜分離

2.2.1 離子交換色譜分離 離子交換色譜的分離原理是基于活性肽帶有不同性質(zhì)電荷和不同電荷量，先使活性肽與帶有相反電荷的離子交換劑結(jié)合，再通過電荷強(qiáng)度不同的洗脫液與活性肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，從而將帶有不同電荷量的物質(zhì)分離開。離子交換色譜因成本低、效率高和易再生等特點(diǎn)而成為蛋白質(zhì)和寡肽分離純化中最常用手段，在蛋白質(zhì)和寡肽純化方案中的使用率達(dá)到75%左右，工業(yè)化應(yīng)用前景良好。

房新平等［30］以體外淋巴細(xì)胞增殖活性為考察指標(biāo)，采用DEAE Sepharose CL－6B陰離子交換色譜、凝膠色譜和反相高效液相色譜對(duì)牛胎盤蛋白胰蛋白酶酶解物進(jìn)行分離純化，牛胎盤免疫活性肽含量達(dá)93%，并經(jīng)分離純化獲得氨基酸序列為 Tyr－X－Phe－Leu－Gly－Leu－Pro－Gly－X－Thr的免疫活性肽。張亞飛等［31］利用離子交換色譜法對(duì)小麥蛋白堿性蛋白酶酶解物進(jìn)行分離，研究結(jié)果表明使巨噬細(xì)胞增殖效果較好的是p H 8與p H 10的洗脫組分。吳綿斌等［32］采用陰離子和陽離子兩種交換色譜對(duì)小牛胸腺酶解物進(jìn)行分離純化得到的組分具有較高的肽含量。

2.2.2 大孔吸附樹脂色譜分離 大孔吸附樹脂的分離原理是基于吸附和分子篩，主要是通過分子間作用力如范德華引力或氫鍵等對(duì)被吸附的分子進(jìn)行吸附，吸附劑表面的親水或疏水性質(zhì)決定了其具有不同的吸附特性；同時(shí)本身的多孔性結(jié)構(gòu)亦決定其具有一定的分子篩作用。因樹脂與被分離成分之間的吸附為物理吸附，被吸附的活性肽較易洗脫，因而具有成本低、效率高、穩(wěn)定性好和易再生等特點(diǎn)。

侯虎等［33］比較了6種大孔吸附樹脂對(duì)鱈魚免疫活性肽的分離效果，其中DA201－C樹脂對(duì)鱈魚免疫活性肽的吸附能力最強(qiáng)，其吸附率、脫鹽率與回收率分別為84.7%，98.1%，90.3%，脫鹽后的鱈魚免疫活性肽對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力有劑量依賴性。

2.2.3 凝膠色譜分離 凝膠色譜是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，據(jù)分子大小、形狀差異進(jìn)行分離的方法。凝膠色譜因具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分離條件溫和、重復(fù)性好和樣品回收率高等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于活性肽的分離純化，但因上樣量小，只適合在活性肽分離純化后期使用。紀(jì)麗娜［34］以小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)為考察指標(biāo)，采用葡聚糖凝膠色譜Sephadex G－25與Sephadex G－15對(duì)分子量范圍為5～10 k Da的金槍魚頭酶解物進(jìn)行分離純化，獲得3個(gè)洗脫峰，研究結(jié)果顯示TIP3C組分主要由200～800 Da的肽構(gòu)成，低劑量的金槍魚頭酶解物即可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力。Assad Sila等［35］聯(lián)用凝膠過濾色譜Sephadex G－25、反相高效液相色譜（RP—HPLC）與電噴霧質(zhì)譜（ESI）對(duì)堿性蛋白酶魚蛋白酶解物進(jìn)行分離純化，在一個(gè)活性較高的組分中檢測(cè)出具有 抗 菌 活 性 的 3 條 肽 Ala－Ala－Ala－Leu、Ala－Ala－Gly－Gly－Val和 Ala－Ala－Val－Lys－Met。

Hu Hou等［24］以淋巴細(xì)胞增殖活性為指標(biāo)，采用離子交換色譜、凝膠過濾色譜與RP—HPLC對(duì)阿拉斯加鱈魚胰蛋白酶酶解物進(jìn)行分離純化，獲得 Asn－Gly－Met－Thr－Tyr、Asn－Gly－Leu－Ala－Pro與 Trp－Thr 3條肽，其淋巴細(xì)胞增殖活性分別為35.92%，32.96%，31.35%。

2.3 電泳分離

電泳法分離蛋白質(zhì)、肽、氨基酸等兩性物質(zhì)能得到較純的組分，但處理量較小，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。常規(guī)Tris－Glycine－SDS－PAGE對(duì)10 kDa以下的小分子肽分辨率低，并且易出現(xiàn)擴(kuò)散丟失和無著色帶等現(xiàn)象。Schagger等［36］用Tricine代替?zhèn)鹘y(tǒng)甘氨酸，在常規(guī)SDS—PAGE分離膠與濃縮膠基礎(chǔ)上增加一層間隙凝膠，并減小電流、延長(zhǎng)電泳時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了對(duì)5～20 k Da肽段的分離，并能觀察到不太清晰的1 kDa肽段的色帶。曹佐武［37］采用5%濃度的聚丙烯酰胺凝膠，并在分離膠中加入尿素，發(fā)現(xiàn)1 kDa的小分子肽段的帶型也能清晰顯示。

3 免疫活性肽的作用機(jī)制

免疫系統(tǒng)由非特異性免疫與特異性免疫組成，非特異性免疫是多細(xì)胞生物經(jīng)過進(jìn)化形成的防御系統(tǒng)，它由皮膚黏膜組織、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等組成，是機(jī)體抵抗和消滅抗原的第一戰(zhàn)線；特異性免疫是隨著機(jī)體的個(gè)體發(fā)育，與抗原接觸后獲得的防御功能，它包含體液免疫和細(xì)胞免疫。免疫活性肽可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖、提高巨噬細(xì)胞活性、增強(qiáng)自噬細(xì)胞（NK）機(jī)能、促進(jìn)細(xì)胞因子生成［2，38］等，通過這些功能來鞏固機(jī)體防御能力、提高機(jī)體免疫力。

3.1 免疫活性肽與非特異性免疫

3.1.1 免疫活性肽與巨噬細(xì)胞 巨噬細(xì)胞是非特異性免疫的重要組成部分，巨噬細(xì)胞存在于各種器官和組織中，它能無特異性的識(shí)別抗原，釋放出大量的細(xì)胞因子IL－1、IL－6、IL－8與TNF－α等，激發(fā)免疫反應(yīng)。同時(shí)巨噬細(xì)胞能活化增殖、吞噬并消化抗原，也能將抗原傳遞給T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞免疫階段。

龔吉軍等［39］采用環(huán)磷酰胺構(gòu)建小鼠免疫力低下模型，研究了油茶粕多肽對(duì)小鼠免疫能力的影響，發(fā)現(xiàn)油茶粕多肽能增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，減輕小鼠耳腫脹度，提高小鼠的免疫功能。Berthaou等［40］用合成的α－乳白蛋白免疫活性肽Gly－Leu－Leu研究其對(duì)小鼠的體液免疫活性，發(fā)現(xiàn)此3肽能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬綿羊紅細(xì)胞的能力，并能保護(hù)小鼠抵抗肺炎克雷伯氏菌的感染。Gattegno等［41］還發(fā)現(xiàn)此3肽能劑量依賴性地促進(jìn)人單核巨噬細(xì)胞與衰老的紅細(xì)胞的結(jié)合，并增強(qiáng)此類巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

3.1.2 免疫活性肽對(duì)自然殺傷NK細(xì)胞的作用 NK細(xì)胞是人體體液免疫的第一道防線，屬于非特異性免疫的范疇，它能分泌胞毒因子、腫瘤促死因子與穿孔素等，選擇性地殺死靶細(xì)胞。NK細(xì)胞較T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞來說其特異性識(shí)別功能是較弱的。通?？蓮腘K細(xì)胞生物活性變化來考察機(jī)體免疫功能。周涌等［42］采用蛙皮生物活性肽作用于小鼠，通過NK細(xì)胞增殖試驗(yàn)、變態(tài)反應(yīng)和碳廓清試驗(yàn)考察哺乳動(dòng)物細(xì)胞的免疫功能，發(fā)現(xiàn)蛙皮活性肽可明顯促進(jìn)NK細(xì)胞的免疫活性，NK細(xì)胞活性為77.4%。傅煒昕等［43］采用凝膠過濾層析與陰離子交換色譜分離純化低分子地龍肽，并考察分離組分對(duì)自然殺傷NK細(xì)胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)分子量在13 kDa以下的組分能明顯提高NK細(xì)胞活性和殺傷率。

3.2 免疫活性肽與特異性免疫

3.2.1 免疫活性肽與T細(xì)胞 T細(xì)胞表面有能識(shí)別“非己”的抗原決定簇，這些抗原決定簇由糖蛋白組成，具有特異性的識(shí)別功能。T細(xì)胞的主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞免疫，T細(xì)胞能消滅一些被感染的細(xì)胞，提高其他細(xì)胞的免疫作用與釋放記憶細(xì)胞，抵御抗原的再次入侵。張智宇等［44］采用胰蛋白酶酶解豆粕，考察酶解工藝參數(shù)與小鼠T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)之間的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)在一定的劑量關(guān)系內(nèi)，豆粕酶解物對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞有顯著增殖作用，刺激指數(shù)為1.189 4。Javier Rodríguez－Carrio等［45］采用膜過濾對(duì)β－乳球蛋白酶解物進(jìn)行分離純化，研究發(fā)現(xiàn)富集大量酸性氨基酸的組分能誘導(dǎo)Th1應(yīng)答，分子量較小的組分能刺激單核細(xì)胞分泌TNF－α，另一個(gè)分子量較小的組分還能引導(dǎo)TGFβ分泌與調(diào)控T細(xì)胞分化，可能是由于從β－乳球蛋白獲得的段能削弱過敏與炎癥反應(yīng)。

3.2.2 免疫活性肽與B細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞是從骨髓干細(xì)胞分化而來的，屬于體液免疫細(xì)胞，主要分布在淋巴結(jié)和脾臟中。當(dāng)B細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，能夠分化成為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞可以產(chǎn)生抗體，參與體液免疫；也可以分化為記憶細(xì)胞。劉賓等［46］用計(jì)算機(jī)推測(cè)大豆蛋白酸性多肽具有刺激B細(xì)胞抗原表位的結(jié)構(gòu)，并能引起B(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫，從而激活體液免疫。方廖瓊［47］研究了羊胎盤免疫調(diào)節(jié)肽GPIF對(duì)體液免疫的影響，發(fā)現(xiàn)GPIF能顯著促進(jìn)B細(xì)胞增殖與抗體分泌，提高脾淋巴B細(xì)胞與骨髓B細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)骨髓干細(xì)胞向B淋巴細(xì)胞分化，表明GPIF具有促進(jìn)小鼠體液免疫的能力；GPIF還能促進(jìn)60Co－γ射線免疫損傷小鼠免疫功能的恢復(fù)。

4 展望

免疫活性肽的主流制備方法為酶解法，因蛋白酶酶切位點(diǎn)具有一定的隨機(jī)性和不確定性，導(dǎo)致酶解過程中產(chǎn)生大量分子量大小相近但氨基酸序列不同的肽段。酶解產(chǎn)物是由蛋白質(zhì)、肽和氨基酸混合的復(fù)雜體系，這大大增加了工業(yè)化生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室分離純化免疫活性肽的成本，選擇高效率、低成本的分離純化方法已成為酶法制備的免疫活性肽大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵所在。

免疫涉及到機(jī)體的體液、組織和器官，且各免疫細(xì)胞之間還將直接或間接的依靠多種信號(hào)分子進(jìn)行信息傳遞，因而導(dǎo)致不同免疫活性肽作用的方式也各不相同，這使得免疫活性肽作用機(jī)制的研究變得更為復(fù)雜，目前還沒有研究開發(fā)出簡(jiǎn)便有效的免疫活性評(píng)價(jià)方法。因此，進(jìn)一步探索免疫活性肽的作用機(jī)制，揭示免疫活性肽功能與活性之間的關(guān)系，可為免疫活性肽類功能性食品的研究開發(fā)提供重要的理論依據(jù)。

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