鄭志芬，戴榮繼

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京100081）

腫瘤是是機體在各種致癌因素作用下，局部組織細胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，從而導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的異常病變。學(xué)界將其分為良性和惡性兩大類。腫瘤作為全球疾病致死的重要元兇之一，如果發(fā)現(xiàn)和治療不及時，有可能導(dǎo)致人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發(fā)熱及臟器功能受損等，其后果極為嚴重。專家指出：在所有的腫瘤中約1/3的腫瘤可以預(yù)防，約1/3的腫瘤可以治愈，約1/3的腫瘤可以延長生命。目前，許多發(fā)達國家對于腫瘤的診斷與治療多在早期，其中腫瘤標志物（如MiR-122等[1]）在腫瘤的診斷、分型、分期、預(yù)后診斷等[2-4]過程中發(fā)揮著重要的作用，所以腫瘤的實驗室診斷檢測意義重大。實時熒光定量PCR技術(shù)是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，是1996年美國Applied Biosystems公司推出，它是通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，然后利用熒光信號的積累強弱實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知的DNA模板進行定量，實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，為全面快速準確地分析樣本中的各類待檢物質(zhì)提供了嶄新的技術(shù)工具，現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于實驗室及臨床腫瘤標志物的檢測。

1 Real-Time PCR技術(shù)原理

實時熒光定量PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針（如標記熒光素的Taqman探針[5]）或者相應(yīng)的熒光染料從而達到定量的目的。熒光標記探針是一寡核苷酸，其兩端分別標記報告熒光基團和猝滅熒光基團，探針完整時，報告基團發(fā)出的熒光信號可以被猝滅基團吸收，從而無熒光信號產(chǎn)生，探針與任意一條DNA單鏈結(jié)合，當(dāng)PCR開始擴增時，Taq酶將探針酶切降解，從而使報告基團與猝滅基團分離，熒光信號被熒光檢測系統(tǒng)檢測到。每擴增一條DNA鏈就有一個熒光分子形成，從而實現(xiàn)了熒光信號與PCR產(chǎn)物的等比例增加，進而達到定量檢測的目的[6]。

在熒光定量PCR技術(shù)中，一個很重要的概念Ct值：(C:Cycle，t: threshold即閾值，臨界值)其含義是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的復(fù)制循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在一定的線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。所以利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標為起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標為Ct值。因此，在實際操作過程中只要獲得了未知樣品的Ct值，即可通過標準曲線計算出該樣品的起始拷貝數(shù)[7]。

實時熒光定量PCR方法分為絕對定量和相對定量，絕對定量是使用系列稀釋已知濃度的標準品進行標準曲線的制作，從而對未知濃度的樣品進行拷貝數(shù)的測定；相對定量是通過分別測定目的基因和參比基因的量，通過計算目的基因相對于參比基因的量，從而進行樣品間相對量的比較，內(nèi)參基因一般選擇一些在細胞內(nèi)或者各種狀態(tài)下表達相對恒定的基因，如β-actin, GAPDH等；兩種定量方法各有優(yōu)缺點沒有較大的可比性，對方法的選擇只是根據(jù)實驗?zāi)康?、實驗要求等選擇較為合適的定量方法。

2 Real-Time PCR技術(shù)在腫瘤檢測中的應(yīng)用

2.1 Real-Time PCR 技術(shù)在肝癌檢測中的應(yīng)用

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）簡稱肝癌，是世界上臨床最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居惡性腫瘤第5位，并且約有55%肝癌病例發(fā)生在中國，肝癌具有進展快、死亡率極高[8]等特點。付琳等[9]采用SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR技術(shù)檢測PLAG1 mRNA 在健康人、肝硬化患者及肝癌患者血漿中的表達情況，其結(jié)果表明肝癌患者血漿中PLAG1 mRNA的表達量明顯高于肝硬化者及健康人群，并且其表達量與病例分化程度相關(guān)，分化程度越低，PLAG1 mRNA 表達越高。這表明PLAG1 有望作為 “分子標志物”，成為新的肝癌診斷的分子生物學(xué)輔助指標，有研究[10]指出血清標志蛋白作為腫瘤標志物存在一定的缺陷，主要是由于這些蛋白的敏感性和特異性有時無法使人滿意，也無法完整的詮釋腫瘤復(fù)雜的分子進展過程，而諸如PLAG1 這些血漿中游離循環(huán)核酸作為“分子標志物”逐漸成為臨床醫(yī)學(xué)腫瘤診斷的研究重點。這一觀點也為付琳等人的研究提供了理論支持。

除此之外，晉云等[1]采用Real-Time PCR技術(shù)檢測了45例肝細胞癌及其配對癌旁組織中miR-122表達情況，其研究發(fā)現(xiàn)miR-122在肝細胞癌組織低表達，這與王躍華等[11]的研究結(jié)果一致， miR-122表達受抑制是肝癌的特征，其主要表現(xiàn)為侵襲能力增強、腫瘤復(fù)發(fā)和患者生存時間減少，研究指出miR-122的表達缺失可以誘發(fā)肝癌細胞獲得侵襲表型。Tavazoie等[12]研究發(fā)現(xiàn)肝細胞癌中miR-12是一種與轉(zhuǎn)型相關(guān)的miRNA。綜上miR-122與肝細胞癌分型聯(lián)系密切，采用Real-Time PCR技術(shù)同時聯(lián)合免疫組化等方法對miR-122表達的檢測對于肝細胞癌的分型判斷具有重要作用。

劉懿霄等[13]采用TaqMan-PCR技術(shù)檢測miR-429在癌組織、癌旁組織、肝癌細胞株及非肝癌細胞株中的表達情況，在138例病人中有47位患者發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)，并有72位患者發(fā)生死亡，5年期間腫瘤無復(fù)發(fā)率及病死率分別為60.1%和62.3%，研究發(fā)現(xiàn)對于miR-429來說，高miR-429表達與肝癌的不良預(yù)后相關(guān)。近年來也有越來越多的證據(jù)表明miR-429的表達與多種腫瘤相關(guān)，如結(jié)腸癌[14]、胃癌[15]、卵巢癌[16]。

2.2 Real-Time PCR 技術(shù)在乳腺癌檢測中的應(yīng)用

許多研究者認為乳腺癌是一種全身性疾病的局部表現(xiàn)，其治療效果的好壞取決于確診時是否遠處轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是乳腺癌致死的主要原因，如果可以在亞臨床狀態(tài)就能檢測到微轉(zhuǎn)移，對臨床的診斷、治療及患者的預(yù)后都具有重要的指導(dǎo)性作用。早期乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測與防治是乳腺癌研究的前沿課題，尤其是外周血循環(huán)腫瘤細胞(CTT)及腋窩淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢測逐漸成為乳腺癌研究的重點[17,18]。其中常見的標志性蛋白有乳腺上皮小黏蛋白（SBEM）、細胞角蛋白19（CK19）[19]及乳腺株細胞（hMAM）[20]等。

陳月鳳等[21]采用巢式PCR技術(shù)及半定量PCR技術(shù)對47例乳腺癌患者和45例乳腺良性腫瘤患者外周血有核細胞中SBEM、hMAN和CK19的mRNA進行檢測，研究結(jié)果顯示：SBEM、hMAN和CK19在乳腺癌組織、癌旁組織及乳腺良性腫瘤中均高表達，具有高度敏感性，可以作為檢測乳腺癌外周血、淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的標志。這一結(jié)論與Miksicek等[22]、楊華偉等[23]的研究結(jié)論一致。除此之外楊華偉等[23]還指出SBEM、hMAN和CK19等基因檢測乳腺癌外周血微轉(zhuǎn)移具有較高的靈敏度，但是缺乏特異性，在臨床檢測中最好采用聯(lián)合檢測以提高特異性。李文仿等[24]采用PCR技術(shù)檢測hMAM在15例正常乳腺組織及15例乳腺增生組織中的表達情況，結(jié)果顯示hMAM-mRNA在乳腺癌組織中高表達，這提示其有可能成為乳腺癌微轉(zhuǎn)移檢測的分子標志物，Tjensvoll K等[25]也提出高表達hMAM的患者腫瘤更易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，這也表明乳腺癌組織中乳腺珠蛋白表達成為乳腺癌的預(yù)后判斷的重要依據(jù)。

張曉霞等[26]采用Real-Time PCR技術(shù)檢測乳腺癌組織與正常乳腺組織中PDX-1和β-catenin mRNA的表達與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期之間的關(guān)系，結(jié)果顯示PDX-1和β-catenin蛋白和mRNA的表達與乳腺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著性相關(guān)，提示 PDX-1 和 β-catenin 可能參與腫瘤細胞的分化及轉(zhuǎn)移過程，并提示PDX-1和β-catenin的檢測對判斷乳腺癌的預(yù)后有重要價值。在蛋白表達與乳腺癌微轉(zhuǎn)移、預(yù)后等的檢測中除了Real-Time PCR技術(shù)以外，反轉(zhuǎn)錄PCR[27]，免疫組化等方法也被大量采用。

2.3 Real-Time PCR技術(shù)在卵巢癌、肺癌、大腸癌等檢測中的應(yīng)用

卵巢癌是婦科死亡率最高的惡性腫瘤，其具有發(fā)病隱匿，進展迅速的特點，僅有25%的卵巢癌能在Ⅰ期病變時被發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的患者診斷時都已擴散或轉(zhuǎn)移，故卵巢癌的早期診斷[27,28]對于卵巢癌患者具有重要作用。人附睪蛋白4（HE4）是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新基因，大量的研究表明HE4是一個優(yōu)秀的鑒別卵巢良惡性病變的生物標志物[29]，Schummer等[30]采用Real-Time PCR技術(shù)進行檢測，發(fā)現(xiàn)晚期卵巢癌經(jīng)過手術(shù)和治療，在復(fù)發(fā)前4~5個月就有HE4升高現(xiàn)象，提示HE4可用于檢測卵巢癌復(fù)發(fā)。

魏明等[31]采用實時熒光定量PCR技術(shù)對不同臨床分期和類型的肺癌患者外周血CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20mRNA的表達水平進行聯(lián)合檢測，結(jié)果表明：I-Ⅱ期肺癌患者外周血中有陽性表達，Ⅲ、Ⅳ期CEA mRNA、CK19 mRNA的表達水平顯著高于I-Ⅱ期，Ⅲ、Ⅳ期CEA mRNA、CK19 mRNA、CK20 mRNA的陽性率和表達水平明顯高于I-Ⅱ期，其結(jié)論指出：應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測肺癌患者外周血CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20mRNA是反映腫瘤細胞血源性播散的靈敏性指標，但是單獨檢測某一腫瘤標志物，存在陽性率不高、特異性不強等特點，故選擇聯(lián)合檢測多個指標以提高檢測的敏感性和準確性。

Gao XH等[32]指出鋅指蛋白zfp148表達水平和大腸癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切，zfp148在轉(zhuǎn)移性腫瘤的表達明顯低于在原發(fā)性腫瘤，zfp148高表達腸癌患者術(shù)后預(yù)后樂觀，這可能作為腸癌患者手術(shù)后一種重要的預(yù)后指標。岳昌武等[33]采用無血清懸浮培養(yǎng)結(jié)合CD13抗體標記磁珠分選獲得Colo205來源大腸癌始動細胞，高通量測序分析180個鋅指蛋白基因mRNA表達譜變化，并篩選差異表達基因，采用Real-Time PCR技術(shù)對部分差異表達基因進行表達變化驗證，結(jié)果顯示：與CD133-細胞群或未分選colo205細胞株比較，CD133+細胞群中有29個鋅指蛋白在表達發(fā)生顯著的改變，且表達變化趨勢一致。這為大腸癌的分子診斷、治療手段的確定以及預(yù)后的判斷提供了參考。黃喆[34]采用Real-Time PCR技術(shù)對50例大腸癌患者腫瘤組織中Bmi-1 mRNA的表達情況進行檢測，結(jié)果顯示大腸腫瘤組織中Bmi-1 RNA以及Bmi-1蛋白的表達量較多，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌細胞中Bmi-1 RNA及蛋白的表達明顯高于未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌細胞，說明大腸癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移與癌細胞中Bmi-1 RNA以及Bmi-1蛋白的表達密切相關(guān)；提示檢測Bmi-1基因的表達水平對臨床診療具有重要意義，但其是否能作為大腸癌診斷標志物尚需更多的數(shù)據(jù)進行證實。

3 Real-Time PCR技術(shù)存在的問題及其前景

實時熒光定量PCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來，實現(xiàn)了將標準化的PCR檢測技術(shù)成功廣泛用于臨床并且實現(xiàn)了DNA/mRNA的快速檢測；與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比其使用了熒光探針標記特定核酸從而提高了準確性；靈敏度提高故使用較少的樣本量，從而減少了樣本消耗殆盡的風(fēng)險，在一小時左右即可出結(jié)果，簡化了傳統(tǒng)PCR方法；全封閉管分析、利用電腦分析軟件對PCR擴增產(chǎn)物的實時動態(tài)的檢測和自動定量，定量動態(tài)范圍高達五個數(shù)量級，且結(jié)果重現(xiàn)性較好，這也提高了檢測的靈敏度和精密度。

實時熒光PCR技術(shù)在檢測過程中會受到Taqman探針比例、mRNA的部分降解、同源與異源DNA背景、SYBR GreenⅠ的濃度大小、寡核苷酸雜交特性、PCR產(chǎn)物長短等因素的影響，從而造成結(jié)果偏差甚至假陽性結(jié)果，故在試驗操作時必須對所設(shè)計的引物特異性進行充分的驗證和條件的最優(yōu)化探究；由于使用了封閉的檢測，減少了擴增后電泳的檢測步驟，故無法實現(xiàn)傳統(tǒng)的PCR技術(shù)檢測擴增產(chǎn)物大小的功能；由于實時熒光PCR技術(shù)需要特殊的熱循環(huán)儀和試劑，故目前使用成本較高，從而限制了它的使用；熒光素的種類及檢測光源的局限性也限制了實時熒光PCR多重檢測的能力。

實時熒光定量PCR的應(yīng)用非常廣泛。在科研方面，可定量分析各種基因的表達、突變和多態(tài)性、分析細胞因子的表達、單核苷酸多態(tài)性（SNP）測定及易位基因的檢測等；在臨床檢測中，Real-Time PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于免疫組分分析[19-21]、臨床疾病早期診斷[26-30]、病原體檢測[6]、耐藥性分析[35]、腫瘤研究和微小殘留病變（MRD）檢測等；另外還可以在進出口檢驗、公安系統(tǒng)、考古與物種分類等方面發(fā)揮重要作用。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展、科技的不斷進步，實時熒光定量PCR與其他一些技術(shù)諸如反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)[27]、免疫組化法[34,36]、HE染色法[36]等的結(jié)合應(yīng)用，是今后發(fā)展的主要方向。而在腫瘤的臨床檢測中采用實時熒光定量PCR技術(shù)對多個基因進行聯(lián)合檢測[31]，進行綜合性指標分析將成為今后的重點。

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