鄧梅葵，孫 迎，韓雯晴

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院醫(yī)學(xué)信息工程研究所(上海，200093)

細(xì)菌鑒定方法

鄧梅葵，孫 迎，韓雯晴

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院醫(yī)學(xué)信息工程研究所(上海，200093)

細(xì)菌的分類鑒定與細(xì)菌的研究和應(yīng)用有著同等重要的地位。準(zhǔn)確地鑒定細(xì)菌類別，根據(jù)其菌種種類不同，分別針對腸桿菌、陽性球菌、非發(fā)酵菌等菌種設(shè)計(jì)不同藥敏板條的抗生素組合，可以指導(dǎo)臨床應(yīng)用用藥。目前，細(xì)菌分類鑒定方法主要包括表型鑒定法和分子遺傳學(xué)鑒定法兩大類，針對這兩大類鑒定方法，匯總其生理生化分類特征，簡述各方法采用的關(guān)鍵技術(shù)，針對各技術(shù)討論其優(yōu)缺點(diǎn)。同時(shí)詳細(xì)研究了表型鑒定法下數(shù)值分類法中自動化鑒定涉及的算法，結(jié)合目前細(xì)菌鑒定方法，對細(xì)菌分類鑒定的發(fā)展趨勢進(jìn)行了總結(jié)和展望。

細(xì)菌；分類鑒定；自動化鑒定

0 前言

目前，正式發(fā)表的細(xì)菌種類已達(dá)到9 916種之多，且仍在快速增長，據(jù)估計(jì)自然界存在的細(xì)菌種類總數(shù)在105～106之間，還有巨大數(shù)量的細(xì)菌新種類有待于科學(xué)家去發(fā)現(xiàn)。微生物個體微小、結(jié)構(gòu)簡單，分類和鑒定方法較多。分類鑒定主要是從以下4個水平分別進(jìn)行：細(xì)菌形態(tài)與生理生化水平、蛋白質(zhì)水平、細(xì)胞組分水平和核酸水平。前3個水平的鑒定方法可以統(tǒng)稱為表型鑒定法，其中包括常規(guī)鑒定法、數(shù)值分類鑒定法和化學(xué)分類鑒定法；核酸水平鑒定的方法主要有分子遺傳學(xué)鑒定法，主要是對細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析，包括G+C mol %含量測定、核酸雜交、PCR技術(shù)、16S r RNA和16～23SrRNA序列分析、全基因組測序等[1]。隨著儀器分析技術(shù)的進(jìn)步和計(jì)算機(jī)的廣泛應(yīng)用，微生物菌種鑒定漸漸地由傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察和人工、生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定發(fā)展進(jìn)入了基于儀器自動化分析的鑒定系統(tǒng)階段。本文將以細(xì)菌分類鑒定方法為主線，對各種方法做出詳細(xì)的介紹和總結(jié)[2]。

1 細(xì)菌常規(guī)鑒定法

1.1形態(tài)學(xué)鑒定法

從細(xì)菌形態(tài)與生理生化水平和蛋白質(zhì)水平鑒定，稱之為細(xì)菌常規(guī)鑒定法。傳統(tǒng)的分類鑒定方法主要依賴于表型分析、個體形態(tài)學(xué)觀察，主要觀察菌落在其適合的培養(yǎng)基上的生長狀況[3]：細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的生長形態(tài)、大小、顏色是否均勻一致，菌落個體表面及邊緣的生長狀況；在液體培養(yǎng)基上的渾濁狀況、沉淀狀況、液面菌膜狀況；半固體上穿刺接種后，觀察細(xì)菌生長狀態(tài)。在鑒別培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察結(jié)果是否跟預(yù)期結(jié)果相同。

形態(tài)學(xué)鑒定輔以生化試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中具有重要的意義，生化試驗(yàn)是根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)過程中不同菌種所產(chǎn)生的新陳代謝產(chǎn)物各異，表現(xiàn)出不同的生長特性[4]。通過生物化學(xué)的方法來檢測這些物質(zhì)的存在與否，從而能夠得到細(xì)菌的鑒定結(jié)果。如糖(醇)類代謝試驗(yàn)、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)、有機(jī)酸鹽和胺鹽利用試驗(yàn)、呼吸酶類試驗(yàn)、毒性酶類試驗(yàn)等。同樣，它也存在一些缺點(diǎn)，例如重現(xiàn)率低、某些技術(shù)的不定性、低辨識能力以及相似的表型特征并不等同于相似的或者關(guān)系密切的基因型。所以對于許多表型特征難以區(qū)別的菌種，通過傳統(tǒng)分類鑒定方法就無法準(zhǔn)確鑒定到菌種，該方法操作較繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期也較長。

細(xì)菌蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)研究技術(shù)在細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。細(xì)菌蛋白質(zhì)組的主要研究方法是雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)結(jié)合生物質(zhì)譜分析技術(shù)[5]，即通過2-DE 將細(xì)菌蛋白質(zhì)分離，然后利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)或表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，并應(yīng)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對鑒定結(jié)果進(jìn)行存儲、處理、對比和分析。對細(xì)菌蛋白質(zhì)水平鑒定技術(shù)，主要包括免疫診斷技術(shù)、蛋白質(zhì)圖譜分析等[6]。

1.2蛋白質(zhì)水平鑒定

1.2.1 免疫診斷技術(shù)

1.2.1.1 免疫診斷技術(shù)與抗原抗體反應(yīng)

免疫學(xué)檢測技術(shù)主要包括二大部分：一是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)，檢測抗原或抗體；二是免疫狀態(tài)的測定?？乖c相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。應(yīng)用已知抗體或抗原檢測未知抗原或抗體，可以對感染性、非感染性治病因子或疾病相關(guān)因子進(jìn)行診斷或輔助診斷[7]。血清型鑒定就是根據(jù)細(xì)菌具有相對特異性的抗原結(jié)構(gòu)這個特點(diǎn)進(jìn)行微生物鑒定的特異方法?？乖奶禺愋猿潭却嬖谟趯匍g細(xì)菌共有的共同抗原，這種抗原的存在，能表明其屬性。另一類特異性抗原只存在于特定的種、型，它是確定細(xì)菌種、型的重要依據(jù)。通過專門的分型血清即可對這些細(xì)菌的血清型進(jìn)行鑒定。

1.2.1.2 免疫檢測常用標(biāo)記技術(shù)

免疫標(biāo)記技術(shù)(immunolabelling technique)是運(yùn)用熒光素、放射性核素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)(膠體金、鐵蛋白)作為示蹤劑標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的一種抗原抗體反應(yīng)[8]。此類方法具有靈敏、特異、快速，能夠定性、定量甚至定位測定，結(jié)果易于觀察、適合自動化檢測等很多優(yōu)點(diǎn)。廣泛用于各種生物活性物質(zhì)的分析鑒定與定量檢測。

1.2.1.3 免疫細(xì)胞的檢測

細(xì)胞因子的分子生物學(xué)檢測方法：應(yīng)用細(xì)胞因子cDNA探針或寡核苷酸探針，經(jīng)放射性核素(32P或35S)、生物素或地高辛標(biāo)記，與細(xì)胞因子mRNA或DNA分別進(jìn)行DNA-RNA雜交(Northern blot)或DNA-DNA雜交(Southern blot)[9]；亦可在組織切片上進(jìn)行原位雜交分析。其優(yōu)異性在于特異性高，可避免生物活性檢測時(shí)其他細(xì)胞因子的影響。但是它只能檢測細(xì)胞因子基因表達(dá)的情況，不能直接提供有關(guān)因子的含量及生物活性等信息。

1.2.2蛋白質(zhì)圖譜分析

蛋白質(zhì)圖譜分析主要采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE，Polyacrylamide Gel Electrophoresis)和SDS-PAGE。聚丙烯酰胺凝膠是單體丙烯酰胺和N，N，-亞甲雙丙烯酰胺在催化劑過硫酸銨和加速劑四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合為含酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈，相鄰長鏈通過甲叉橋連接形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，PAGE根據(jù)電荷、形狀和分子大小分離和定性、定量分析蛋白質(zhì)和多肽。SDS-PAGE根據(jù)分子量的不同分離蛋白質(zhì)，SDS是一種陰離子表面活性劑，與蛋白質(zhì)疏水部分結(jié)合使蛋白質(zhì)帶大量負(fù)電荷且使蛋白質(zhì)的形狀趨向一致，抵消了蛋白質(zhì)本身所帶電荷和形狀的影響，因此，樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系。采用全細(xì)胞SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS -PAGE) 對高度標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，可以得到反映生物基因組成的蛋白質(zhì)圖譜信息[10]，這是蛋白質(zhì)電泳分析用于細(xì)菌表型分類及多樣性研究的理論基礎(chǔ)。這項(xiàng)技術(shù)也是一種分群和比較大量相近菌株的較好方法，結(jié)果與數(shù)值分類和 DNA -DNA 雜交的結(jié)果相符合，說明該方法具有一定的可靠性，一般用于屬內(nèi)的分群。

2 細(xì)菌數(shù)值分類法和自動化鑒定

數(shù)值分類法是近20年來發(fā)展起來的細(xì)菌分類理論，它應(yīng)用大量已知菌對相關(guān)生化試驗(yàn)反應(yīng)出現(xiàn)的頻率得出數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)相似系數(shù)大小判斷細(xì)菌種屬間的親緣性[11], 自動化微生物鑒定系統(tǒng)即采用數(shù)值分類原理。隨著微電子、計(jì)算機(jī)、分子生物學(xué)等先進(jìn)技術(shù)向微生物生學(xué)領(lǐng)域的滲透和多學(xué)科的交叉，微生物的快速鑒定和自動化分析技術(shù)有了突破性的進(jìn)展，有代表性的是微量多項(xiàng)試驗(yàn)鑒定系統(tǒng)、快速自動化微生物檢測儀器。

2.1運(yùn)用數(shù)值分類的自動鑒定系統(tǒng)

1985年，中國引入第一臺自動化細(xì)菌分析化儀器VITEK-AMS，它以每種細(xì)菌的微量生化反應(yīng)為細(xì)菌的鑒定原理。不同種類的VITEK試驗(yàn)卡含有多種的生化反應(yīng)孔，可達(dá)30種。根據(jù)試驗(yàn)卡各生化反應(yīng)孔中的生長變化情況，由讀數(shù)器按光學(xué)掃描原理，定時(shí)測定各生化介質(zhì)中指示劑的顯色，或濁度反應(yīng)，然后把讀出信息輸入電腦儲存并進(jìn)行分析，再和預(yù)定的閾值進(jìn)行比較。判定反應(yīng)，再通過數(shù)值編碼技術(shù)與數(shù)據(jù)庫中反應(yīng)文件進(jìn)行比較，最后將鑒定報(bào)告顯示出來[12]。

BIOLOG微生物自動分析系統(tǒng)[13]是美國BIOLOG公司從1989年開始推出的一套微生物鑒定系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要根據(jù)細(xì)菌對糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等95種C源的利用情況進(jìn)行鑒定。細(xì)菌利用C源進(jìn)行呼吸時(shí)，會將四哇類氧化還原染色劑(TV)從無色還原成紫色，從而在鑒定微平板(96孔板)上形成該菌株特征性的反應(yīng)模式或“指紋圖譜”。鑒定板由讀數(shù)儀自動讀取吸光值，軟件自動判斷結(jié)果為陰陽性或邊界值，自動與數(shù)據(jù)庫對比，給出鑒定結(jié)果。

2.2預(yù)測微生物模型自動化鑒定

預(yù)測微生物學(xué)運(yùn)用微生物學(xué)、工程數(shù)學(xué)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行數(shù)學(xué)建模,并和應(yīng)用計(jì)算機(jī)學(xué)相結(jié)合組成一門新興學(xué)科[14]，它目的在于用數(shù)學(xué)的語言描述微生物在不同環(huán)境條件下的生長 、死亡情況。這些環(huán)境條件包括pH值、水分活度、溫度、氣體環(huán)境等。預(yù)測微生物學(xué)的核心在于建立完善的數(shù)學(xué)模型。在微生物的自動化鑒定中，利用美國BIOLOG公司開發(fā)的一種新的微生物鑒定方法-代謝指紋法，運(yùn)用特征選擇和優(yōu)化技術(shù)，得到細(xì)菌鑒定板上每孔的特征曲線。對于得到的特征-時(shí)間曲線，再運(yùn)用預(yù)測微生物學(xué)，擬合出預(yù)測微生物生長模型[15]，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和匹配，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌的全自動鑒定。

3 化學(xué)分類鑒定法

細(xì)菌化學(xué)分類法通過化學(xué)測定，獲得細(xì)菌基因組和各細(xì)菌組分的化學(xué)數(shù)據(jù)[16]，依據(jù)得到的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)在種的水平上對細(xì)菌做出精確鑒定。屬的分類主要測定各種氨基酸組分。另外，還有全細(xì)胞水解液糖型分析、脂肪酸分析、磷酸類脂成分分析、枝菌酸分析、醌類分析和光合色素成分分析等，常使用紅外光譜、氣相色譜、高效液相色譜和質(zhì)譜等新技術(shù)。

3.1紅外光譜

紅外光譜法早在20世紀(jì)50年代起就開始運(yùn)用于區(qū)分不同的微生物[17]。隨著現(xiàn)代干涉型紅外光譜儀、傅立葉變換技術(shù)以及計(jì)算機(jī)的發(fā)展，這一研究領(lǐng)域又有了新的進(jìn)展。傅里葉變換紅外光譜法以未損傷細(xì)胞的傅里葉變換紅外光譜的特殊指紋區(qū)為基礎(chǔ)，光譜反映的是整個細(xì)胞組成分子的振動特征，也就是蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的特征，因此可以區(qū)分生化信息上的差別。

3.2高效液相色譜法(HPLC)

20世紀(jì)60年代末發(fā)展起來的一種分離分析新技術(shù)[18]，HPLC可直接測定細(xì)菌DNA的堿基組成和細(xì)菌的化學(xué)組分?？稍诩?xì)菌DNA的G+C含量測定、枝菌酸分析、醌類分析。在細(xì)菌分類鑒定中的應(yīng)用，具有分離效率高、選擇性好、檢測靈敏度高和分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。

4 分子遺傳學(xué)分類鑒定法

自 20 世紀(jì) 60 年代開始，分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展使細(xì)菌分類學(xué)進(jìn)入了分子生物學(xué)的時(shí)代，目前主要的遺傳學(xué)分析方法，包括DNA(G+C)mol% ，核酸雜交技術(shù)，16S rRNA序列分析，MLST(多位點(diǎn)序列分型，Multi Locus Sequence Typing)，全基因組測序，以及核酸指紋圖譜等[19]。

4.1DNA(G+C)mol%

染色體DNA的GC含量即DNA的堿基組成[20]，由于不受菌齡的影響，已成為細(xì)菌分類鑒定的重要指標(biāo)。每一種生物的 DNA 均有特定的 G+C mol%，不同生物各不相同，生物種間親緣關(guān)系較近，則 G+C mol% 差別較小，反之亦然。DNA的GC含量測定方法主要有紙層析法、浮力密度法、高效液相色譜法、熱變性溫度測定法(Tm法)和熒光法等，由于Tm法操作簡便、精確度高、重復(fù)性好，被廣為采用。

4.2核酸雜交技術(shù)

核酸雜交技術(shù)根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原理，將2條不同來源的單鏈核酸進(jìn)行復(fù)性以鑒定菌株間的親緣關(guān)系[21]，用于DNA-DNA(Southern雜交)、DNA-RNA、RNA-RNA(Northern雜交)和PNA-DNA雜交(PNA為肽核酸)。DNA-DNA雜交適用于種水平的研究，而DNA-RNA雜交用于屬和屬以上水平的分類研究。核酸雜交目前常采用固相雜交法。另外，對線粒體DNA進(jìn)行雜交分析將對種內(nèi)和種間的分類更加靈敏。

4.316S rRNA序列分析

16S rRNA廣泛存在于原核生物的細(xì)胞中，保留了大量的信息量又便于擴(kuò)增和測序，其基因序列由恒定區(qū)和可變區(qū)組成，可變區(qū)序列因不同細(xì)菌而異，恒定區(qū)序列基本保守，通常利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，結(jié)合 PCR 技術(shù)，將 16S rRNA 序列擴(kuò)增出來，再利用可變區(qū)序列的差異來對不同屬、種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定，現(xiàn)已成為大多數(shù)微生物實(shí)驗(yàn)室的常用方法和描述新的分類單元的必要指標(biāo)[22]。

4.4MLSA/MLST (多位點(diǎn)序列分析/分型，Multi Locus Sequence Analysis/Typing)

若要鑒定到種水平，需要分辨率很高的基因序列分析，即多位點(diǎn)序列分析/分型[23]。MLST也適合跟蹤細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)的長期變化，尤其是對基因重組率較高的種類進(jìn)行亞種的分型[24]。由于所用引物并不是在每個菌種中擴(kuò)增出來，只能小范圍應(yīng)用于某些種，序列相似度的臨界值從而難以界定，因此這種方法更適合于分析種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。MLSA雖然因此而受限，不過作為一項(xiàng)開放性技術(shù)，隨著數(shù)據(jù)庫的不斷擴(kuò)容，不久的將來會得到更廣泛的應(yīng)用。

4.5全基因組測序

微生物全基因組測序是當(dāng)前國際生命科學(xué)領(lǐng)域中掌握微生物全部遺傳信息的最佳途徑。目前測序技術(shù)有Sanger測序法和焦磷酸測序法2種。Sanger法對基因組測序，精確度較高，但由于焦磷酸法測序速度快，花費(fèi)低廉，在檢測基因突變和SNP(單核苷酸多態(tài)性)等需要大量檢測短序列的應(yīng)用中具有不可比擬的優(yōu)勢[25-27]。

5 細(xì)菌鑒定方法前景展望

綜上所述，傳統(tǒng)的分類鑒定需要測定的項(xiàng)目眾多，工作程序繁瑣，耗時(shí)長。免疫診斷技術(shù)若無相應(yīng)抗體則無法鑒定；細(xì)菌自動化鑒定適于快速鑒定,但目前國內(nèi)主要以半自動鑒定設(shè)備為主；分子遺傳學(xué)鑒定是從本質(zhì)上闡明細(xì)菌間的親緣關(guān)系,但所需費(fèi)用較高，鑒定時(shí)間較長。對于不熟悉或從未發(fā)表的新菌種，很難采用現(xiàn)有的一種或少數(shù)幾種方法進(jìn)行鑒定。因此，細(xì)菌分類鑒定必須充分利用和完善現(xiàn)有鑒定技術(shù),使用傳統(tǒng)與現(xiàn)代相結(jié)合以及不斷發(fā)掘新的鑒定方法以適應(yīng)多種微生物的鑒定需要。隨著細(xì)菌鑒定方法的不斷建立和完善,將為科研和臨床工作者提供簡便、快速、準(zhǔn)確、微量、靈敏和成本低廉的檢測方法和更先進(jìn)、更全面的檢測手段。

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MethodsofIdentificationofBacteria

Deng Meikui，Sun Ying，Han Wenqing

Medical Information Engineering Institute, School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology( Shanghai, 200093)

The classification and identification of bacteria are equally important compared to its research and application. After bacteria categories are accurately identified, different antibiotic susceptibility lath antibiotic combination, which are specific to bacteria species, such as enteric bacilli, positive coccus, non-fermenter and other bacteria respectively, can be designed to guide clinic drugs application. Currently, methods of bacteria classification and identification mainly include phenotypic and molecular genetic identification. According to these two methods for the classification and identification of bacteria, their physiological and biochemical characteristics were summarized. The key techniques and corresponding merits and defects were systematically elaborated and discussed. Simultaneously, relevant algorithms in numerical taxonomy and automated identification of the phenotypic identification method were studied. Combined with the current method of bacterial identification, this article summarized and prospected the development trend of bacteria identification in the future.

bacteria, classification and identification, automated identification

10.3969/j.issn.1674-1242.2014.02.009

鄧梅葵，E-mail:camerrilar@163.com

Q939.1

A

1674-1242(2014)02-0084-05

2014-05-15)