俞麗娜， 邵興鋒

寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系，浙江 寧波 315211

我國海域遼闊，海洋資源豐富，是世界第一水產(chǎn)大國。但是每年約有30%的海洋資源無法得到充分利用，造成資源的浪費(fèi)。水產(chǎn)品的傳統(tǒng)加工技術(shù)主要有腌制、干制、煙熏、糟制和天然發(fā)酵等，這些方法操作簡便，加工成本低，故只適于對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行初加工。隨著科技的進(jìn)步和生活水平的提高，人們更關(guān)注食品的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值，傳統(tǒng)工藝在改良食品品質(zhì)、促進(jìn)加工深度以及實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化方面存在很大的不足，而現(xiàn)代生物技術(shù)作為一種高新技術(shù)，改善了傳統(tǒng)工藝的不足，能夠?qū)λa(chǎn)資源進(jìn)行有效利用，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品的深加工［1］?，F(xiàn)代生物技術(shù)主要包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、酶技術(shù)和發(fā)酵技術(shù)等四個(gè)方面，其中，酶技術(shù)對(duì)水產(chǎn)品加工的影響最大。

近年來，由于水體污染和過度捕撈，低值水產(chǎn)品比例不斷上升，水產(chǎn)加工下腳料也無法得到有效利用，因而運(yùn)用酶技術(shù)將低值水產(chǎn)品和水產(chǎn)加工下腳料來生產(chǎn)高附加值的產(chǎn)品已成為水產(chǎn)品加工業(yè)發(fā)展的主要趨勢(shì)［2，3］。酶制劑是從生物中提取的具有酶特性的一類活性物質(zhì)。在水產(chǎn)品加工業(yè)方面，研究人員對(duì)蛋白酶的研究最為深入，通過蛋白酶處理低值水產(chǎn)品和加工下腳料，可提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量，降低環(huán)境污染，豐富水產(chǎn)品市場(chǎng)［4］。本文綜述了蛋白酶在水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用研究現(xiàn)狀，提出了使用蛋白酶酶解過程中的注意事項(xiàng)，并對(duì)其未來的發(fā)展趨勢(shì)作出展望。

1 蛋白酶概述

蛋白酶，又名蛋白水解酶（proteolytic enzyme，proteinase），是最主要的酶制劑之一，能夠催化蛋白質(zhì)中肽鍵的水解。蛋白酶廣泛存在于動(dòng)物內(nèi)臟、植物莖葉、果實(shí)和微生物中［5］。蛋白酶種類繁多，按其來源可分為動(dòng)物蛋白酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶）、植物蛋白酶（木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶）和微生物蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶、鏈霉蛋白酶）；按其pH不同又可分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶；按其活性中心起催化作用的基團(tuán)屬性則可分為金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶；還可根據(jù)剪切基團(tuán)分為內(nèi)切酶和外切酶兩種類型。蛋白酶作為一種生物酶制劑具有三大特點(diǎn)，一是來源于動(dòng)植物和微生物，安全性高，幾乎沒有有害殘留物；二是蛋白酶具有專一性和高效性，因此酶用量較少；三是酶解反應(yīng)條件溫和，操作簡便。因此蛋白酶酶解技術(shù)作為一種安全、高效和快捷的加工技術(shù)廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)加工中［6］。

2 蛋白酶在水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用研究現(xiàn)狀

2.1 水解魚蛋白研究

低值魚的食用價(jià)值較低，利用酶技術(shù)生產(chǎn)水解魚蛋白一方面能有效地對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行綜合利用，另一方面可以提高水產(chǎn)品加工的經(jīng)濟(jì)效益，實(shí)現(xiàn)低值魚的高值化應(yīng)用。水解魚蛋白不僅蛋白質(zhì)含量高，且品質(zhì)優(yōu)于整塊魚肉組織或者魚蛋白的濃縮物［7］。采用蛋白酶酶解得到的水解魚蛋白營養(yǎng)豐富，水溶性好，且必需氨基酸比例恰當(dāng)。

魚體本身含有內(nèi)源蛋白酶，所以可以利用內(nèi)源酶的自溶技術(shù)水解魚體自身蛋白質(zhì)。內(nèi)源蛋白酶最大的優(yōu)點(diǎn)在于其活性高、成本低，且內(nèi)源蛋白酶與底物結(jié)合的效果好。Choi等［8］對(duì)鳀魚三種內(nèi)源酶的性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶具有相同的最適作用條件，在pH 8.0、45℃條件下酶解效率最高，而組織蛋白酶的最適作用條件為pH 6.0、50℃。Pastoriza等［9］利用內(nèi)源蛋白酶（粉狀的原料蛋白酶和鰩魚內(nèi)臟中提取的內(nèi)源復(fù)合蛋白酶）和商業(yè)蛋白酶（木瓜蛋白酶和胃蛋白酶）對(duì)鰩魚下腳料進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果表明利用鰩魚內(nèi)源蛋白酶在pH 8.5、49℃時(shí)的水解效果最佳，明顯優(yōu)于商業(yè)蛋白酶。榮婧等［10］以羅非魚內(nèi)臟為原料，研究了其內(nèi)臟蛋白酶的自溶工藝，得到在最佳工藝條件下的水解度為18.8%。但是內(nèi)源蛋白酶的酶解過程難以控制，在生產(chǎn)過程中還易受到微生物的污染，得到的產(chǎn)物其功能特性也較差［11］，因此在實(shí)際加工過程中更多地使用外源蛋白酶。利用外源蛋白酶水解不僅可以避免魚肉組織中營養(yǎng)素的損失，還能有效提高產(chǎn)品品質(zhì)，避免微生物的危害。胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶等都適于魚蛋白的水解，使其具有更好的溶解性或得到較長的肽鏈。研究發(fā)現(xiàn)，用堿性蛋白酶分別對(duì)白鰱內(nèi)臟和藍(lán)圓鯵進(jìn)行水解，水解產(chǎn)物的水解度較高，可分別達(dá)27.1%和51.9%，為低值魚的高值化利用提供了研究方向［12，13］。

蛋白酶水解低值水產(chǎn)品或水產(chǎn)加工下腳料得到的水解蛋白制品會(huì)產(chǎn)生不宜的腥味和苦味，影響產(chǎn)品的感官品質(zhì)，限制了資源的綜合開發(fā)利用。蛋白水解液的苦味是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)經(jīng)內(nèi)切酶作用后，水解過程中產(chǎn)生含有疏水基團(tuán)的多肽及疏水性游離氨基酸形成苦味肽［14］。徐錦等［15］應(yīng)用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶等6種商品蛋白酶研究了對(duì)鰱魚蛋白的水解效果，結(jié)果表明木瓜蛋白酶的水解度最高，而風(fēng)味蛋白酶的水解液風(fēng)味最佳，由此可見，運(yùn)用風(fēng)味蛋白酶能夠有效改善水解液的風(fēng)味。風(fēng)味蛋白酶作為真菌蛋白酶／肽酶的復(fù)合體，具有內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶兩種活性。外切酶能夠從多肽末端切斷釋放出氨基酸，將苦味肽降解為氨基酸［16］。但是外切酶必須與內(nèi)切酶復(fù)合使用或在內(nèi)切酶使用后添加才可有效水解苦味肽，減輕苦味甚至達(dá)到完全去苦的效果。因此可以將水解度較高的蛋白酶與水解風(fēng)味較好的蛋白酶進(jìn)行雙酶復(fù)合酶解。孫克巖等［17］研究了木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶酶解牡蠣，提高了酶解液中氨基氮的含量，改善了其風(fēng)味。姚芳等［18］通過研究三種復(fù)合酶（堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶；胰酶和風(fēng)味蛋白酶；堿性蛋白酶、胰酶和風(fēng)味蛋白酶）對(duì)鰱魚酶解效果的比較，得出堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶以1∶1組合水解效果最佳，風(fēng)味最好。另一方面，在酶解魚蛋白過程中，當(dāng)肽鏈的長度足夠長時(shí)則可將疏水性氨基酸包埋在其結(jié)構(gòu)內(nèi)部，也能達(dá)到減弱苦味的效果［19，20］。除了應(yīng)用酶法去苦外，通過吸附、沉淀、掩蓋等理化手段也可起到去苦作用，或者將酶法去苦和和理化去苦相結(jié)合，去苦效果更佳。

2.2 提取生物活性物質(zhì)

利用蛋白酶的水解作用，適度水解蛋白質(zhì)，使活性物質(zhì)游離出來，最后進(jìn)行分離，是制備生物活性物質(zhì)的一般流程。生物活性物質(zhì)主要包括生物活性肽、多糖和高度不飽和脂肪酸等。其中，生物活性肽是一類能夠優(yōu)化機(jī)體代謝環(huán)境，促進(jìn)機(jī)體健康的多肽。采用酶法從低值水產(chǎn)品及加工副產(chǎn)物中提取活性肽是目前研究的熱點(diǎn)。

淡水魚及其加工下腳料中蛋白質(zhì)含量豐富，富含抗菌肽、降血壓肽、抗氧化肽和免疫活性肽等多種活性物質(zhì)［21，22］，它們以非活性狀態(tài)潛藏于下腳料蛋白中，只有將其釋放出來才能發(fā)揮生物活性作用。近年來，國內(nèi)外學(xué)者致力于研究通過蛋白質(zhì)的可控酶解技術(shù)制備天然的抗氧化肽。鰱魚作為我國淡水魚的主要品種，由于其特有的腥味和多骨多刺的特點(diǎn)而不受消費(fèi)者喜愛，但是鰱魚酶解產(chǎn)物具有抗氧化活性，可以制備抗氧化肽，提高鰱魚附加值。尤娟等［23］應(yīng)用酶法提取鰱魚蛋白抗氧化肽，研究了風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶等5種酶水解其魚肉蛋白，結(jié)果表明胃蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的清除DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基的能力。胃蛋白酶還能用于水解魚皮蛋白質(zhì)，水解后添加蜂蜜、葡萄糖能夠制備營養(yǎng)豐富的多肽口服液。申鋒等［24］用4種蛋白酶水解草魚魚鱗，結(jié)果表明胃蛋白酶水解魚鱗膠原蛋白的水解產(chǎn)物具有較好的凝膠能力，制得的魚鱗膠原肽可作為膠凝劑、增稠劑和乳化劑應(yīng)用于保健品、化妝品等領(lǐng)域。

二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）屬于生物活性物質(zhì)中的高度不飽和脂肪酸。淡水魚內(nèi)臟中含有一定的EPA和DHA，具有降低人體血液中的低密度脂蛋白、減少血液的粘稠度、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和心腦血管疾病、增強(qiáng)免疫力和保護(hù)視力等作用。因此，利用蛋白酶法提取魚油，可以使淡水魚加工副產(chǎn)物得以充分利用。此過程是通過蛋白酶的水解作用，破壞了蛋白質(zhì)和魚油的結(jié)合，從而使油脂釋放出來。熊光權(quán)等［25］應(yīng)用酶解法從鰱魚內(nèi)臟中提取魚油，結(jié)果表明中性蛋白酶是最佳酶源，提取率可達(dá)17.2%。此外，應(yīng)用胰蛋白酶制備的魚油提取率也很高，例如用胰蛋白酶提取金槍魚魚油，其提取率高達(dá)90.2%［26］。蛋白酶法提取魚油的優(yōu)勢(shì)在于其作用條件溫和，魚油提取率高，生產(chǎn)的魚油質(zhì)量好，并且提高了低值魚類的附加值。

2.3 研發(fā)水產(chǎn)調(diào)味品

利用低值魚、蝦蟹和貝類等加工下腳料為原料生產(chǎn)水產(chǎn)調(diào)味品，實(shí)現(xiàn)了對(duì)海洋資源的綜合利用，豐富了水產(chǎn)品市場(chǎng)。

魚露是一類風(fēng)味獨(dú)特的水產(chǎn)調(diào)味品，味咸鮮美，略帶腥味。傳統(tǒng)生產(chǎn)魚露的生物技術(shù)是天然發(fā)酵法，高鹽腌制后進(jìn)行發(fā)酵。但此法生產(chǎn)周期長，產(chǎn)品鹽濃度高，無法滿足現(xiàn)代人對(duì)健康飲食的需求。運(yùn)用以加酶法為主的現(xiàn)代速釀技術(shù)生產(chǎn)魚露不僅縮短了魚露的生產(chǎn)周期，還能大大降低產(chǎn)品的鹽度。例如，遲玉森等［27］利用As1398蛋白酶水解鳀魚，20h即制成魚鮮醬油。何建君等［28］利用復(fù)合蛋白酶水解小雜魚和鰱魚下腳料中的蛋白質(zhì)，發(fā)酵后制成了淡水魚露，降低了調(diào)味品的鹽濃度。近幾年，對(duì)魚露快速發(fā)酵工藝的研究更加深入，將發(fā)酵工藝細(xì)分為前期、中期和后期三個(gè)階段。黃紫燕等［29］研究表明，通過前期高鹽酶解、中期加曲自然發(fā)酵和后期高鹽保溫的分段式魚露發(fā)酵工藝，可以顯著提高魚露的可溶性氮、氨基酸態(tài)氮和游離氨基酸的含量。

蛋白酶除了能生產(chǎn)魚露調(diào)味品，還能水解海蟹類和魚貝類加工下腳料制備海鮮調(diào)味品。目前，我國許多海鮮調(diào)味品中添加了合成香精、動(dòng)植物蛋白質(zhì)和味精來提高氮含量及鮮味，這種調(diào)味品不僅風(fēng)味不佳，而且營養(yǎng)價(jià)值低。而天然海鮮調(diào)味品富含有益的活性物質(zhì)，具有特定的營養(yǎng)和保健功能，有益于人體健康。劉光明等［30］利用木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解制得的海蟹調(diào)味品蟹味濃郁、鮮味明顯，不僅保持了原材料的營養(yǎng)成分和獨(dú)特風(fēng)味，而且蛋白質(zhì)資源也得到了有效回收。靳挺等［31］也用木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解龍頭魚，制備出風(fēng)味純正、自然的海鮮調(diào)味料。陳超等［32］則通過酶解貝類加工廢棄物制得了復(fù)合海鮮調(diào)味料，不僅風(fēng)味極佳，而且富含游離氨基酸態(tài)氮，提高了調(diào)味料的營養(yǎng)價(jià)值。

2.4 其他應(yīng)用研究

蛋白酶除了以上三種主要應(yīng)用外，還能用于去皮、脫鱗以及制備不帶魚肉的魚骨制品。水產(chǎn)品加工中去皮和去鱗的步驟較繁瑣，目前主要采用機(jī)械法，但易造成水生動(dòng)物體損傷，且處理后仍有殘留物粘附在其表面，降低了產(chǎn)品得率。一般機(jī)械法處理后還需人工去皮，二次處理更提高了加工成本，故此法不經(jīng)濟(jì)。研究表明，蛋白酶尤其是木瓜蛋白酶具有較好的去皮和脫鱗效果。陳青等［33］研究了木瓜蛋白酶對(duì)東海海參的脫皮工藝，先將干海參水發(fā)，然后用木瓜蛋白酶處理，最后脫皮。結(jié)果表明，0.09%的木瓜蛋白酶液在40℃下處理8h即能去除東海海參粗糙厚實(shí)的表皮，并且保持了其營養(yǎng)成分和優(yōu)良的口感。呂飛等［34］則將木瓜蛋白酶應(yīng)用于魚皮去鱗，首先清洗帶鱗黑魚魚皮表面黏液并除去殘留的魚肉，接著用木瓜蛋白酶處理，不停攪拌酶溶液。結(jié)果表明，0.6%的木瓜蛋白酶酶溶液在20℃下攪拌20min能有效去除魚鱗，且操作簡便。魚骨粉和魚骨休閑食品則需要在加工前首先將魚肉去除。例如利用堿性蛋白酶將魚骨上殘存的碎肉酶解，過濾即能制得不帶魚肉的魚骨［35］?？莶輻U菌蛋白酶也能去除殘存在魚骨間的魚肉，不僅脫肉效果好能得到干凈的魚肉，還能降低魚骨的腥味［36］。

3 蛋白酶技術(shù)應(yīng)用的注意事項(xiàng)

3.1 酶種類的選取

蛋白酶種類繁多、應(yīng)用廣泛，在對(duì)不同的水產(chǎn)品加工過程中，并非所有的蛋白酶都適合加工同一水產(chǎn)品，不同的蛋白酶對(duì)同一酶底物表現(xiàn)出的水解能力差異很大。徐錦等［14］研究了6種商品蛋白酶對(duì)鰱魚蛋白的水解效果，在各酶的最佳水解條件下得出木瓜蛋白酶的水解度最高，達(dá)26.3%，而風(fēng)味蛋白酶的水解度最低，為17%。田寶玉等［37］也研究了不同酶對(duì)白鰱蛋白的水解效果，結(jié)果同樣顯示風(fēng)味蛋白酶的水解度最低。因此，不同的蛋白底物選擇合適的蛋白酶至關(guān)重要。

3.2 作用方式的確定

在水產(chǎn)品加工中，一般多酶水解可溶性蛋白得率要高于單酶水解。楊萍等［38］分別用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)青鱗魚肉進(jìn)行單酶水解和兩兩組合水解，測(cè)得木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶雙酶水解的可溶性蛋白得率高達(dá)85.6%，而單酶水解的得率僅有40%左右。此外，內(nèi)源酶水解水產(chǎn)品往往產(chǎn)生不適宜的苦腥味，風(fēng)味蛋白酶雖然水解度較低，但是其水解風(fēng)味較好，所以可以將其與水解度高的蛋白酶混合酶解，改善水產(chǎn)品的水解度和水解液的風(fēng)味［17，18］。

3.2 使用方法的選擇

在水產(chǎn)品加工中，蛋白酶的使用方法主要有以下三種：第一，直接加入商業(yè)酶制劑［12，13］，此法因使用方便而應(yīng)用最為廣泛，缺點(diǎn)是生產(chǎn)成本較高；第二，利用內(nèi)源蛋白酶水解［8，9］，與商業(yè)酶制劑相比可降低生產(chǎn)成本，節(jié)約資源，但酶解時(shí)間相對(duì)較長；第三，還可以通過直接加入富含蛋白酶的產(chǎn)品來提供水解所需的蛋白酶［39］，但易殘留蛋白酶源的食品特性而影響加工產(chǎn)品的品質(zhì)，故使用最少。根據(jù)不同蛋白酶和加工產(chǎn)品的特點(diǎn)選擇合適的使用方法，既能獲得所需的產(chǎn)品，又能最大限度降低生產(chǎn)成本，在生產(chǎn)加工中至關(guān)重要。

4 展望

隨著漁業(yè)資源的衰退，應(yīng)用蛋白酶對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行綜合利用，不僅降低生產(chǎn)成本、節(jié)約資源，而且實(shí)現(xiàn)了對(duì)低值水產(chǎn)品的高值化利用，促進(jìn)了水產(chǎn)加工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。但是我國酶制劑工業(yè)仍處于初步發(fā)展階段，提取設(shè)備和工藝技術(shù)落后，難以在生產(chǎn)實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用。此外，酶制劑的安全性問題也關(guān)系到廣大消費(fèi)者的健康。雖然酶作為一種生物產(chǎn)品比化學(xué)制劑的安全性高，但是在酶制劑的生產(chǎn)過程中極易受到微生物的污染，產(chǎn)生生物毒素。今后在酶制劑工業(yè)發(fā)展中，應(yīng)利用現(xiàn)代新技術(shù)開發(fā)具有高活力和良好風(fēng)味的酶制劑，降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。隨著酶技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展以及酶工業(yè)的進(jìn)步，酶制劑尤其是蛋白酶在水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用將會(huì)越來越廣泛。

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