王方忠，蔣 藝，劉奎美，姜寶杰，王明鈺，2，方 詡，2

(1.山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100;2.山東大學(xué) 國(guó)家糖工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250100)

當(dāng)今世界經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展很大程度上依賴石油資源的大量開采和利用。隨著石油、煤炭等礦石資源漸進(jìn)枯竭，尋找可替代的液體燃料來(lái)維持人類社會(huì)可持續(xù)發(fā)展迫在眉睫。木質(zhì)纖維素資源在自然界中含量豐富并在轉(zhuǎn)化液體燃料方面具有很好的潛在應(yīng)用價(jià)值［1］。自然界中降解木質(zhì)纖維素資源的策略很多，如在腐爛的樹枝枯葉中生存的絲狀真菌，在轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素方面發(fā)揮重要作用。研究較為深入的絲狀真菌有紅褐肉座菌［2］(Hypocrea jecorina)、粗糙脈孢菌［3］(Neurospora crassa)和草酸青霉［1］(Penicillium oxalicum)等。

雖然絲狀真菌能夠分泌大量纖維素酶和半纖維素酶類，但是其產(chǎn)量還不足以支持工業(yè)化規(guī)模轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素類底物。因此，有必要解析絲狀真菌合成纖維素酶和半纖維素酶的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而為制定相關(guān)策略以提高工業(yè)菌株生產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶產(chǎn)量提供理論參考。研究人員發(fā)現(xiàn)了很多參與調(diào)控纖維素酶和半纖維素酶表達(dá)的調(diào)控因子及其調(diào)控機(jī)制［4］。例如，碳代謝阻遏及轉(zhuǎn)錄因子Cre1，絲狀真菌中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)參與碳代謝阻遏的同源蛋白Cre1［2］。在里氏木霉和曲霉中Cre1可調(diào)控許多纖維素和半纖維素酶基因表達(dá)。在Cre1突變菌株中，在葡萄糖存在條件下絲狀真菌仍能夠大量表達(dá)纖維素酶和半纖維素酶基因。Ace1和Ace2都是通過(guò)酵母雙雜交分離出來(lái)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［4］。Ace1是一個(gè)含有3個(gè)Cys(2)-His(2)類鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白，在里氏木霉中敲除基因ace1后，在纖維素和槐糖的培養(yǎng)條件下能夠提高主要的纖維素酶基因和半纖維素酶基因表達(dá)量，這表明ace1為轉(zhuǎn)錄抑制因子;里氏木霉中敲除基因ace2后，在纖維素培養(yǎng)條件下主要的纖維素酶基因和半纖維素酶基因表達(dá)量減少，這表明ace2為轉(zhuǎn)錄激活因子。Xyr1是雙核鋅指類轉(zhuǎn)錄激活因子，在里氏木霉中Xyr1的調(diào)控不受誘導(dǎo)物和纖維素酶基因本身表達(dá)模式影響，而是纖維素酶與半纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄所必需的［2］。

最近幾年，調(diào)控絲狀真菌合成纖維素酶和半纖維素酶的研究集中以下方面:胞外信號(hào)分子(C源，光信號(hào))的調(diào)控;對(duì)以上發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子的最新研究和一些新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)現(xiàn);染色質(zhì)重建調(diào)控等。筆者對(duì)近年來(lái)絲狀真菌調(diào)控纖維素酶和半纖維素酶合成機(jī)制進(jìn)行綜述，希望為相關(guān)研究工作提供參考。

1 絲狀真菌合成纖維素酶和半纖維素酶的信號(hào)感應(yīng)機(jī)制

在自然界中，有很多信號(hào)分子能夠調(diào)控絲狀真菌合成纖維素酶和半纖維素酶，其中研究較多的有碳信號(hào)和光信號(hào)。

1.1 碳信號(hào)

碳信號(hào)研究主要集中在尋找菌體內(nèi)部真正的誘導(dǎo)物，乳糖誘導(dǎo)里氏木霉表達(dá)纖維素酶機(jī)制及碳信號(hào)識(shí)別受體等方面工作。

一般認(rèn)為，纖維素首先被絲狀真菌分泌的少量纖維素酶水解成葡萄糖和纖維寡糖，一部分纖維寡糖再被水解成葡萄糖供菌體利用，一部分則誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)。但是，不清楚在菌體內(nèi)部起誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)的具體是哪種纖維寡糖。敲除粗糙脈孢菌胞外3個(gè)主要的β-葡萄糖苷酶基因后，菌體不能夠?qū)⒗w維二糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖，但是仍可在纖維二糖培養(yǎng)條件下有效的誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)［4］。草酸青霉114-2中敲除胞外 β-葡萄糖苷酶基因 bgl1和胞內(nèi)主要β-葡萄糖苷酶基因 bgl2后，發(fā)現(xiàn)纖維二糖(而不是其轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物槐糖和龍膽二糖)能直接誘導(dǎo)菌株表達(dá)纖維素酶和半纖維素酶［5］。相似的結(jié)果也在里氏木霉中有所報(bào)道［6］。敲除里氏木霉胞內(nèi)外主要的β-葡萄糖苷酶基因的菌株，纖維素酶基因的表達(dá)在纖維素培養(yǎng)條件下出現(xiàn)延遲，但在纖維二糖培養(yǎng)條件下并不受影響，同時(shí)向纖維素培養(yǎng)基中添加纖維二糖能夠恢復(fù)敲除株表達(dá)纖維素酶能力［6］。在纖維素培養(yǎng)基中，里氏木霉水解纖維素釋放的纖維二糖的濃度利于菌體吸收而不是被β-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖［7］。在里氏木霉中，發(fā)現(xiàn)1個(gè)對(duì)纖維二糖有催化活性的葡萄糖-核糖醇脫氫酶(GRD1)，GRD1能夠正調(diào)控纖維素酶基因表達(dá)［8］。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都暗示著纖維二糖或其代謝產(chǎn)物(而不是其轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物)是自然界中絲狀真菌菌體內(nèi)部誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)的真正誘導(dǎo)物。值得注意的是，所有的敲除β-葡萄糖苷酶基因的實(shí)驗(yàn)都沒(méi)有提供直接的證據(jù)來(lái)證明菌體是不能將纖維二糖轉(zhuǎn)化成其轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物(如槐糖)，但是，里氏木霉野生菌株的細(xì)胞破碎液是能夠?qū)⒗w維二糖轉(zhuǎn)化成槐糖的［9］。所以，絲狀真菌菌體內(nèi)部纖維素酶真正的誘導(dǎo)物是什么仍然沒(méi)有很明確的結(jié)論。在里氏木霉中，低濃度D-木糖和L-阿拉伯糖能夠誘導(dǎo)木聚糖酶大量的表達(dá)，但高濃度時(shí)卻會(huì)抑制木聚糖酶的相關(guān)表達(dá)。Mach-Aigner等［10］通過(guò)敲除里氏木霉木糖代謝路徑第一個(gè)關(guān)鍵酶(木糖還原酶)，發(fā)現(xiàn)起誘導(dǎo)作用的應(yīng)該不是 D-木糖，而可能是 D-木糖的代謝產(chǎn)物。然后，通過(guò)阻斷里氏木霉D-木糖代謝路徑檢測(cè)木聚糖酶表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)D-木糖中間代謝物L(fēng)-阿拉伯糖醇才是真正的誘導(dǎo)物［10］。但是這種觀點(diǎn)并不被Seiboth等［7］接受，他們認(rèn)為 Mach-Aigner等人測(cè)試木聚糖轉(zhuǎn)錄的時(shí)間點(diǎn)太早，此時(shí)D-木糖的誘導(dǎo)仍然還不明顯，并且敲除木酮糖還原酶基因后，向培養(yǎng)基中添加木糖仍然有木聚糖酶表達(dá)。Seiboth 等［7］認(rèn)為，D-木糖本身起誘導(dǎo)作用而非 L-阿拉伯糖，因此可能是L-阿拉伯糖醇誘導(dǎo)木聚糖酶表達(dá)。

乳糖并不是纖維素降解產(chǎn)物或其衍生物，但是能夠顯著誘導(dǎo)里氏木霉表達(dá)纖維素酶［7］。乳糖誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)依賴生長(zhǎng)速率，即在低生長(zhǎng)速率條件下有較高的纖維素酶產(chǎn)生。

乳糖及水解產(chǎn)物D-半乳糖都能誘導(dǎo)纖維素酶基因表達(dá)。在相同生長(zhǎng)速率條件下，乳糖的誘導(dǎo)效果明顯強(qiáng)于半乳糖。由于胞內(nèi)缺少來(lái)源GH2家族β-半乳糖苷酶(BGA1)的活性，所以，以前認(rèn)為乳糖只可能被胞外或結(jié)合在細(xì)胞壁上的β-半乳糖苷酶水解成葡萄糖和β-D-半乳糖，β-D-半乳糖再參與到纖維酶的誘導(dǎo)中。但是Ivanova等［11］研究發(fā)現(xiàn)在里氏木霉中有1個(gè)乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將其基因敲除后導(dǎo)致里氏木霉菌株不能在乳糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)也不能吸收乳糖，同時(shí)不能表達(dá)纖維素酶，但纖維素酶基因仍受槐糖誘導(dǎo)。這使得乳糖誘導(dǎo)機(jī)制變得十分復(fù)雜。造成以上現(xiàn)象的原因，一種可能的情況是乳糖被胞外BGA1水解成葡萄糖和β-D-半乳糖，且β-D-半乳糖參與纖維素酶誘導(dǎo);另一種情況可能是乳糖本身作為信號(hào)分子。這又可能出現(xiàn)2種情況:①發(fā)現(xiàn)的乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接作為乳糖特異識(shí)別受體參與誘導(dǎo)纖維素酶基因的表達(dá);②乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，被胞內(nèi)有類似BGA1水解活性的酶類水解后，β-D-半乳糖參與纖維素酶誘導(dǎo)。代謝半乳糖有2條途徑:①還原路徑;②Leloir路徑［7，12］，但 Leloir路徑只能代謝 α-D-半乳糖。而β-D-半乳糖和 α-D-半乳糖轉(zhuǎn)換又依以下2種方式:①pH依賴的構(gòu)型變化;②半乳糖變旋酶催化。雖然里氏木霉有3個(gè)半乳糖變旋酶，但是在其胞內(nèi)外并不能檢測(cè)到有半乳糖變旋酶活性。在里氏木霉中，表達(dá)來(lái)源于酵母的gal10基因C-末端具有半乳糖變旋酶的結(jié)構(gòu)域，可以使 β-D-半乳糖大量轉(zhuǎn)化成α-D-半乳糖，雖然菌體在纖維素培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不受影響，但是在乳糖培養(yǎng)條件下纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄明顯減少，這寓示著，缺少相應(yīng)半乳糖變旋酶活性，是里氏木霉在乳糖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)表達(dá)纖維素酶的重要因素并且β-D-半乳糖在乳糖誘導(dǎo)過(guò)程發(fā)揮重要作用［12］。

尋找識(shí)別碳信號(hào)的受體仍然是非常重要的工作，根據(jù)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)證據(jù)推測(cè)碳信號(hào)識(shí)別受體可能存在2種情況:①位于膜上寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或同源物;②相關(guān)代謝酶類或同源物。在里氏木霉中發(fā)現(xiàn)1個(gè)寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Crt1，將其基因敲除后并不影響里氏木霉轉(zhuǎn)運(yùn)纖維二糖和槐糖。分別在纖維素、乳糖和槐糖培養(yǎng)條件下，Δcrt1菌株并不能表達(dá)纖維素酶，同時(shí)其生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。這就說(shuō)明Crt1可能是一個(gè)關(guān)鍵的獨(dú)立于胞內(nèi)糖信號(hào)傳遞的碳信號(hào)受體［13］。還有一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果需引起注意，在里氏木霉中敲除胞內(nèi)主要的β-葡萄糖苷酶基因后，在纖維素培養(yǎng)條件下菌株的纖維素酶基因表達(dá)受到明顯抑制［6］。這就說(shuō)明β-葡萄糖苷酶不可能僅僅發(fā)揮著水解作用，β-葡萄糖苷酶也可能是碳信號(hào)的一個(gè)識(shí)別受體。乳糖信號(hào)識(shí)別受體除了可能是前面提到的乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外，還可能存在其他受體蛋白。在里氏木霉中，敲除乳糖代謝Leloir路徑第一個(gè)酶半乳糖激酶基因gal1，會(huì)導(dǎo)致在乳糖培養(yǎng)基上纖維素酶表達(dá)量明顯減少，但是敲除隨后路徑中相關(guān)酶類基因，纖維素酶類表達(dá)并沒(méi)有受到影響。如果同時(shí)敲除Leloir路徑第一個(gè)酶半乳糖激酶基因和還原路徑的第一個(gè)酶木糖還原酶基因，纖維素酶表達(dá)水平和單敲除半乳糖激酶基因的水平基本一致，說(shuō)明單敲除株和雙敲除株破壞的靶向物是一致的［14］。因此，可以猜測(cè)半乳糖激酶基因gal1是乳糖誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)受體蛋白。

寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否是碳信號(hào)識(shí)別受體還需要進(jìn)一步深入研究。但至少有許多寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)活性影響纖維素酶表達(dá)的報(bào)道。例如，粗糙脈孢菌中發(fā)現(xiàn)的CDT-1和CDT-2［15］，里氏木霉中發(fā)現(xiàn)的 Stp1［13］。

1.2 光信號(hào)

光調(diào)控絲狀真菌表達(dá)纖維素酶是依賴于C源誘導(dǎo)物存在。

在里氏木霉中，以纖維素為C源只能夠增強(qiáng)纖維素酶表達(dá)［16］，但以乳糖為C源時(shí)，光卻能夠抑制纖維素酶表達(dá)［17］。BLR1和BLR2是里氏木霉中藍(lán)光受體蛋白。在光照條件下，BLR1和BLR2對(duì)纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄起正調(diào)控作用。在黑暗條件下，雖然BLR1和BLR2對(duì)纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄也起正調(diào)控作用，但是敲除基因blr1導(dǎo)致菌體分泌纖維素酶能力增強(qiáng)，敲除blr2后導(dǎo)致菌體分泌纖維素酶能力變?nèi)?，這說(shuō)明BLR1和BLR2的功能相互獨(dú)立，并不形成復(fù)合物［18-19］。在里氏木霉中，破壞光調(diào)節(jié)蛋白ENVOY(env1)的PAS結(jié)構(gòu)域后，在光照條件下，纖維素酶誘導(dǎo)作用發(fā)生延遲，在黑暗條件下誘導(dǎo)不能持續(xù)［16］。進(jìn)一步分析 Δblr1、Δblr2和 Δenv1發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在光照還是黑暗條件下，cbh1基因轉(zhuǎn)錄情況在3個(gè)敲除株中保持一致，同時(shí)在Δblr1和Δblr2敲除株中并不能檢測(cè)到env1基因轉(zhuǎn)錄。這暗示著blr1和blr2位于env1上游［18］。G蛋白參與的信號(hào)途徑影響很多重要的生理過(guò)程，G蛋白有GNA、GNB和GNG這3個(gè)亞基組成。在里氏木霉中，雖然3個(gè)亞基對(duì)纖維素酶表達(dá)都有調(diào)控作用［20］，但是只有GNA(GNA3和GNA1)參與了依賴誘導(dǎo)物的光調(diào)控絲狀真菌表達(dá)纖維素酶。在光照和纖維素培養(yǎng)條件下，沉默基因gna3會(huì)導(dǎo)致依賴光的纖維素酶延遲表達(dá)，敲除基因gna1后，在光照下纖維素對(duì)纖維素酶的誘導(dǎo)作用喪失，但黑暗下誘導(dǎo)作用反而增強(qiáng);而組成型激活基因gna3和gna1都表現(xiàn)出依賴光和誘導(dǎo)物，隨著光強(qiáng)和誘導(dǎo)物的增加，纖維素酶基因的表達(dá)量亦增加。GNA1能抑制基因env1表達(dá)，ENVOY則抑制基因gna3表達(dá)。ENVOY能夠正向調(diào)控gna1自我反饋激活，但不能調(diào)控 gna3［21-23］。在組成型激活gna3和gna1菌株中，分別敲除基因env1后，在黑暗條件下，敲除株與出發(fā)株在菌絲形態(tài)，生孢能力及纖維素酶轉(zhuǎn)錄方面表現(xiàn)一致;在光照條件下，表現(xiàn)出與單敲除env1一致的表型。這些結(jié)果說(shuō)明ENVOY可能通過(guò)影響與gna3和gna1之間相互調(diào)控耦聯(lián)光信號(hào)和G蛋白信號(hào)通路，進(jìn)而影響纖維素酶表達(dá)，但在黑暗條件下ENVOY不影響G 蛋白信號(hào)通路［23］。

細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度能影響纖維素酶表達(dá)，并且受到光信號(hào)調(diào)控［23］。外源添加cAMP會(huì)影響絲狀真菌分泌纖維素酶［24］。胞內(nèi)cAMP濃度受到產(chǎn)生cAMP的腺苷酸環(huán)化酶(ACY1)和降解cAMP的磷酸二酯酶調(diào)控，cAMP通過(guò)激活蛋白激酶 K(PKA)調(diào)控下游靶基因，進(jìn)而影響相關(guān)生理過(guò)程。在里氏木霉中，敲除env1會(huì)造成胞內(nèi)cAMP減少，但向敲除株中添加cAMP則會(huì)導(dǎo)致敲除株出現(xiàn)更嚴(yán)重的缺陷表型，同時(shí)，敲除株中基因acy1表達(dá)量并沒(méi)有減少。但是，添加磷酸二酯酶抑制劑，敲除株表型缺陷能逐漸恢復(fù)。這些結(jié)果說(shuō)明了ENVOY能抑制磷酸二酯酶，但不影響腺苷酸環(huán)化酶。敲除cAMP路徑上2個(gè)主要組分——腺苷酸環(huán)化酶(ACY1)和cAMP依賴的蛋白激酶K(PKA)的催化結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)基因acy1在光照、黑暗下均正調(diào)控纖維素酶表達(dá)，而基因pka僅在光照下有正調(diào)控作用，黑暗下則表現(xiàn)出負(fù)調(diào)控作用。PKA可能通過(guò)調(diào)控結(jié)合在纖維素酶或相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子上的蛋白復(fù)合物來(lái)影響纖維素酶表達(dá)［17］。綜上可以看出:在里氏木霉中，ENVOY既能耦聯(lián)G蛋白信號(hào)通路，又能影響cAMP信號(hào)路徑，是光信號(hào)調(diào)控的關(guān)鍵基因。

相類似工作在粗糙脈孢菌中也有開展［25］。WC-1、WC-2和VVD都為含有PAS結(jié)構(gòu)域的光受體蛋白。在里氏木霉中，WC-1和WC-2的對(duì)應(yīng)同源蛋白分別為BLR1和BLR2。在光照條件下，它們對(duì)大多數(shù)纖維素酶和半纖維素酶起正調(diào)控作用，VVD只對(duì)少數(shù)纖維素酶基因起負(fù)調(diào)控作用。

2 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控纖維素酶和半纖維素酶基因的表達(dá)

2.1 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控纖維素酶和半纖維素酶基因表達(dá)

很多蛋白能夠結(jié)合到纖維素酶和半纖維素酶基因的啟動(dòng)子區(qū)，激活或者抑制相關(guān)基因表達(dá)。Xyr1、Ace2、Hap2/3/5、Ace1和Cre1是較早發(fā)現(xiàn)的能夠調(diào)控纖維素酶表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子［3］。在里氏木霉中，Xyr1的體外結(jié)合序列為5'-GGC(T/A)4-3'［26］。Xyr1受到乳糖和半乳糖的誘導(dǎo)，但半乳糖代謝產(chǎn)物并不能影響基因xyr1表達(dá)。同時(shí)，Xyr1能激活木糖還原酶1(Xyl1)和β-半乳糖苷酶1(Bga1)從而調(diào)控乳糖和半乳糖代謝路徑［27-28］。Cre1和Ace1抑制基因xyr1的表達(dá)［29］，但是大量誘導(dǎo)xyr1需要Cre1［28］。里氏木霉突變株Iogen-M8與出發(fā)株Iogen-M4相比，木聚糖酶酶活得到顯著提高，通過(guò)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)位于xyr1鋅指結(jié)構(gòu)域的824位上的丙氨酸(Ala)突變成纈氨酸(Val)。將突變后的基因xyr1導(dǎo)入Iogen-M4后(菌株命名為Iogen-M4X)，木聚糖酶酶活也得到顯著提高;同樣將野生型基因xyr1導(dǎo)入Iogen-M8(菌株命名為Iogen-M8X)，木聚糖酶活與Iogen-M4基本一致。這就說(shuō)明位于xyr1 824位上突變是提高Iogen-M8木聚糖酶活的關(guān)鍵因素。將Iogen-M8、Iogen-M4X和Iogen-M4分別培養(yǎng)在含有 50 mmol/L D-葡萄糖、0.5 mmol/L D-木糖、66 mmol/L D-木糖和1.5 mmol/L槐糖培養(yǎng)基中(以沒(méi)有C源為對(duì)照)，發(fā)現(xiàn)在Iogen-M8和Iogen-M4X中，基因xyn1和xyn2表達(dá)量都維持在較為恒定的高水平，且基因cbh1和cbh2基礎(chǔ)表達(dá)水平提高亦受槐糖誘導(dǎo)。這些說(shuō)明里氏木霉突變株Iogen-M8中A824V突變，能夠?qū)е聏yn1和xyn2表現(xiàn)出非常強(qiáng)的去調(diào)控現(xiàn)象，同時(shí)能提高cbh1和cbh2基礎(chǔ)表達(dá)水平［30］。在米曲霉(Aspergillus oryzae)中，Xyr1同源蛋白XlnR是以不同的磷酸化形式存在的，向培養(yǎng)基中添加D-木糖使得XlnR的磷酸化形式發(fā)生變化［31］，但不清楚磷酸化改變是否影響 XlnR功能。在里氏木霉中，Ace2體外結(jié)合位點(diǎn)和Xyr1的結(jié)合位點(diǎn)相同，都為5'-GGCTAATAA-3'，但Ace2與啟動(dòng)子的結(jié)合需要磷酸化和二聚體化，而且還具有選擇性。Ace2在調(diào)控xyn2基因中起作用:①抑制xyn2早期誘導(dǎo);②增強(qiáng)xyn2后期持續(xù)表達(dá)［32］。AmyR是淀粉酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，但最近研究發(fā)現(xiàn)AmyR負(fù)調(diào)控纖維素酶基因表達(dá)［33-34］。

除了上述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子外，最近還發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能夠調(diào)控纖維素酶和半纖維素酶表達(dá)。在粗糙脈孢菌中，分別敲除2個(gè)具有鋅指雙核簇轉(zhuǎn)錄因子的基因clr-1和clr-2，這2個(gè)基因敲除菌株在微晶纖維素培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷，胞外蛋白分泌量只有出發(fā)株的5%，纖維素酶活、內(nèi)切酶酶活及木聚糖酶活都檢測(cè)不到，相對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量也明顯減少。這種生長(zhǎng)缺陷也出現(xiàn)在纖維二糖培養(yǎng)條件下，但是在蔗糖、木聚糖生長(zhǎng)條件下，此現(xiàn)象并沒(méi)有出現(xiàn)。而且，在木聚糖培養(yǎng)條件下，敲除株的胞外蛋白分泌量及半纖維素酶活與出發(fā)株的基本一致。Clr-1對(duì)于粗糙脈孢菌有效利用纖維二糖是必需的，并且基因clr-2的轉(zhuǎn)錄受到基因clr-1調(diào)控［35］。在菌株 Δclr-2中，組成型表達(dá)clr-2不僅能夠恢復(fù)在纖維素培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)及誘導(dǎo)纖維素酶的表達(dá)缺陷，而且在非誘導(dǎo)條件下，纖維素酶表達(dá)量能夠達(dá)到野生型在微晶纖維素培養(yǎng)條件下的水平［36］。在構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)中，分別敲除clr-1和clr-2同源基因clrA和clrB，在纖維素培養(yǎng)基中，ΔclrA菌株纖維素酶酶活和木聚糖酶酶活是出發(fā)株的50%，菌株ΔclrB的纖維素酶酶活和木聚糖酶酶活幾乎完全喪失［35］。在ΔclrB菌株中，組成型表達(dá)基因clrB雖然能在微晶纖維素培養(yǎng)條件下提高纖維素酶酶活，但不能在非誘導(dǎo)條件下充分誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)［36］。這些結(jié)果表明，基因clr-1/clrA和clr-2/clrB是功能保守并且非常關(guān)鍵的纖維素酶和半纖維素酶激活因子。

在曲霉中，還發(fā)現(xiàn)其他在特定條件下調(diào)控某些相關(guān)纖維素酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。在棘孢曲霉(A.aculeatus)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有Zn(II)2Cys6結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子clbR，它能顯著激活不受XlnR調(diào)控的基因cbh1、cmc2和xynIa進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)對(duì)受到XlnR調(diào)控的基因cmc1和xynIb有激活作用。這種激活機(jī)制存在于纖維素培養(yǎng)條件下，而在D-木糖和L-阿拉伯糖培養(yǎng)條件下并沒(méi)有這種機(jī)制［37］。在構(gòu)巢曲霉中，發(fā)現(xiàn)1個(gè)能直接結(jié)合到基因eglA的啟動(dòng)子，屬于SRF-type MADS box蛋白，在其編碼區(qū)引入1個(gè)錯(cuò)義突變，在纖維二糖培養(yǎng)條件下能夠顯著減少纖維素酶的表達(dá)量［38］。Mikiko 等［39］報(bào)道了一個(gè)能特異調(diào)控β-葡萄糖苷酶的具有Zn(II)2Cys6結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子的基因bglR，在里氏木霉中，BglR能上調(diào)β-葡萄糖苷酶表達(dá)，但卻使菌株生產(chǎn)纖維素酶能力降低。

草酸青霉是山東大學(xué)自主分離纖維素酶高產(chǎn)菌株，經(jīng)過(guò)多年不懈研究，對(duì)其調(diào)控纖維素酶和半纖維素酶機(jī)制有了很大進(jìn)步［40-43］。筆者所在實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn):相對(duì)于150 r/min轉(zhuǎn)速條件下，基因cbh1、cbh2、eg1、eg2 和 bgl1在 250 r/min轉(zhuǎn)速條件下的表達(dá)量明顯提高，但轉(zhuǎn)錄因子xlnR和ace1的表達(dá)量卻下調(diào)。在里氏木霉中，Cre1能同時(shí)抑制基因ace11和xyr1表達(dá)。在草酸青霉中，通過(guò)提高轉(zhuǎn)速來(lái)影響纖維素酶表達(dá)量的一個(gè)可能機(jī)制是草酸青霉感受到外界信號(hào)(可能是溶氧)后激活creA，CreA同時(shí)抑制基因xlnR和ace1表達(dá)。CreA同時(shí)介導(dǎo)去抑制和去激活，兩者之間的競(jìng)爭(zhēng)決定了最后纖維素酶表達(dá)量［40］。敲除草酸青霉中creA，發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶、濾紙酶活及木聚糖酶酶活都顯著提高，但對(duì)外切葡聚糖酶酶活及β-葡萄糖苷酶酶活沒(méi)有影響。此外，CreA的缺失很可能影響斜臥青霉多條生長(zhǎng)代謝途徑，從而使該突變株菌落的形態(tài)與野生型相比發(fā)生了明顯的改變(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。CreA蛋白可與泛素結(jié)合，形成泛素化蛋白。泛素化的 CreA相對(duì)不穩(wěn)定，容易受到蛋白酶的降解，CreB是去泛素化蛋白，能夠穩(wěn)定creA。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)敲除creB能顯著提高濾紙酶活、內(nèi)切纖維素酶活、木聚糖酶活、外切纖維素酶活及胞外蛋白質(zhì)含量［41］。相類似的工作在米曲霉和里氏木霉也有報(bào)道［42-43］。

2.2 染色質(zhì)重建調(diào)控纖維素酶和半纖維素酶基因的表達(dá)

某些修飾組蛋白酶類，例如甲基轉(zhuǎn)移酶、乙?；D(zhuǎn)移酶，可通過(guò)參與染色質(zhì)重建影響纖維素酶的表達(dá)［44-46］。Vu等［44］通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀法研究發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)cel7c附近的組蛋白H3第4位上賴氨酸甲基化可能參與到羧甲基纖維素(CMC)介導(dǎo)的基因cel7c激活。通過(guò)敲除組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因moset1，敲除株在CMC培養(yǎng)基上基因cel7c的表達(dá)量明顯減少，但在非誘導(dǎo)條件下，cel7c表達(dá)量明顯增加。所以，MoSET1調(diào)控纖維素酶基因表達(dá)是受外界信號(hào)調(diào)節(jié)。在里氏木霉中，敲除組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶基因gcn5、cbh1，突變株在誘導(dǎo)條件下表達(dá)量相對(duì)出發(fā)株明顯減少，并且在cbh1啟動(dòng)子上的組蛋白H3第9、14位賴氨酸乙酰化程度顯著減少，可以說(shuō)明GCN5是通過(guò)乙酰化組蛋白H3來(lái)修飾染色質(zhì)參與激活纖維素酶基因［45］。在里氏木霉基因組中，纖維素酶、半纖維素酶基因以及其他的cazy家族基因和一些次級(jí)代謝物合成基因位于相同的基因簇上。在曲霉中，甲基轉(zhuǎn)移蛋白LaeA通過(guò)組蛋白水平調(diào)控次級(jí)代謝簇基因表達(dá)。Seiboth等［46］發(fā)現(xiàn)在里氏木霉中纖維素酶基因可能受到Lae1(LaeA同源蛋白)調(diào)控。通過(guò)敲除基因lae1后，主要的纖維素酶、木聚糖酶及β-葡萄糖苷酶基因都不表達(dá)，過(guò)表達(dá)lae1可以明顯提高纖維素酶基因表達(dá)?；騲yr1的表達(dá)也受到Lae1調(diào)控。但是cazy家族在基因組編碼區(qū)組蛋白H3第4位上Lys并沒(méi)有發(fā)生二甲基化或三甲基化修飾，第9位上也沒(méi)有發(fā)生三甲基化修飾。這些結(jié)果說(shuō)明:Lae1對(duì)于纖維素酶、半纖維素酶基因表達(dá)是十分關(guān)鍵的，但可能不是通過(guò)甲基化組蛋白來(lái)調(diào)控纖維素酶基因表達(dá)。

除了上面提到的幾個(gè)方面，筆者所在課題組在絲狀真菌調(diào)控纖維素酶和半纖維素酶合成機(jī)制方面也有突破性進(jìn)展［47-48］。Wang等［47］研究發(fā)現(xiàn) MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)路徑參與到纖維素酶基因調(diào)控中。在里氏木霉中存在3個(gè)MAPKs蛋白，分別為Tmk1、Tmk2和Tmk3。Tmk3屬于Hog1-type類型MAPKs，敲除里氏木霉基因tmk3，導(dǎo)致在液態(tài)和固態(tài)培養(yǎng)條件下纖維素酶基因表達(dá)量及酶活都減少(液態(tài)條件減少程度更嚴(yán)重)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)許多轉(zhuǎn)錄因子上含有tmk3的磷酸化位點(diǎn)。Tmk2屬于Slt2類型的MAPKs蛋白，敲除基因tmk2后，主要的纖維素酶基因在液態(tài)培養(yǎng)條件下都發(fā)生了明顯的上調(diào)，同時(shí)轉(zhuǎn)錄抑制因子cre1和ace2發(fā)生明顯下調(diào)，轉(zhuǎn)錄激活因子xyr1和ace1并沒(méi)有發(fā)生明顯變化(未公開發(fā)表)。這說(shuō)明Tmk3和Tmk2可能都參與到纖維素酶基因表達(dá)，但Tmk3可促進(jìn)纖維素酶基因表達(dá)，Tmk2則抑制纖維素酶基因的表達(dá)。本課題組還發(fā)現(xiàn)分別在里氏木霉和草酸青霉中敲除同源性達(dá)到75%的Erp蛋白，都能造成菌體內(nèi)部出現(xiàn)分泌壓力，但是反饋調(diào)控纖維素酶及半纖維素酶基因的表達(dá)卻出現(xiàn)截然不同的現(xiàn)象。草酸青霉中主要的纖維素酶基因都發(fā)生明顯上調(diào)，在里氏木霉中主要的纖維素酶基因發(fā)生明顯下調(diào)［48］。

3 展望

對(duì)絲狀真菌合成纖維素酶和半纖維素酶機(jī)制的解析已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但相對(duì)絲狀真菌上萬(wàn)年的進(jìn)化，還有許多科學(xué)問(wèn)題值得深入研究。轉(zhuǎn)錄因子方面，除了繼續(xù)發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子外，建立轉(zhuǎn)錄因子與各種信號(hào)傳導(dǎo)路徑直接相互關(guān)聯(lián)是非常重要的。轉(zhuǎn)錄因子修飾是否能影響相關(guān)調(diào)控功能;哪些位點(diǎn)氨基酸對(duì)轉(zhuǎn)錄因子功能發(fā)揮是必需的。信號(hào)傳導(dǎo)方面，仍然不清楚接受信號(hào)的直接受體是什么，同時(shí)信號(hào)如何向下游傳遞還需要努力探究。但是，相信通過(guò)堅(jiān)持不懈的努力，會(huì)對(duì)整個(gè)絲狀真菌合成纖維素酶和半纖維素酶調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有更深入了解，能夠?yàn)檫M(jìn)一步遺傳改造工業(yè)菌株提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

［1］ 方詡，秦玉琪，李雪芝，等.纖維素酶與木質(zhì)纖維素生物降解轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2010，26(7):864-869.

［2］ 辛琪，徐金濤，汪天虹，等.絲狀真菌紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)報(bào)，2010，50(11):1431-1437.

［3］ Znameroski E A，Coradetti S T，Rochec C M，et al.Induction of lignocellulose-degrading enzymes in Neurospora crassa by cellodextrins［J］.PNAS，2011，109(16):6012-6017.

［4］ Aro，N，Pakula，T，Penttila，M.Transcriptional regulation of plant cell wall degradation by filamentous fungi［J］.FEMS Microbiol Rev，2005，29:719-739.

［5］ Chen M，Qin Y，CaoQ，etal.Promotionofextracellular lignocellulolytic enzymes production by restraining the intracellular β-glucosidase in Penicillium decumbens［J］.Bioresour Technol，2013(137):33-40.

［6］ Zhou Q，Xu J，Kou Y，et al.Differential involvement of βglucosidases from Hypocrea jecorina in rapid induction of cellulase genes by cellulose and cellobiose［J］.Eukaryot Cell，2012，11(11):1371-1381.

［7］ Seiboth B，Herold S，Kubicek C P.Metabolic engineering of inducer formation for cellulase and hemicellulase gene expression in Trichoderma reesei［M］.Subcell Biochem，2012，64:367-390.

［8］ Schuster A，Kubicek C P，Schmoll M.Dehydrogenase GRD1 represents a novelcomponentofthe cellulase regulon in Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina)［J］. Appl Environ Microbiol，2011，77(13):4553-4563.

［9］ Vaheri M，Leisola M，Kauppinen V.Transglycosylation products of cellulase system of Trichoderma reesei［J］.Biotechnol Lett，1979，1(1):41-46.

［10］ Mach-Aigner A R，Gudynaite-Savitch L，Mach R L.L-arabitol is the actual inducer of xylanase expression in Hypocrea jecorina(Trichoderma reesei)［J］.Appl Environ Microbiol，2011，77(17):5988-5994.

［11］ Ivanova C，B??th J A，Seiboth B，et al.Systems analysis of lactose metabolism in Trichoderma reesei identifies a lactose permease that is essential for cellulase induction［J］.PloS One，2013，8(5):e62631.

［12］ Fekete E，Seiboth B，Kubicek C P.Lack of aldose 1-epimerase in Hypocrea jecorina(anamorph Trichoderma reesei):a key to cellulase gene expression on lactose［J］.PNAS，2008，105(20):7141-7146.

［13］ Zhang W，Kou Y，Xu J，et al.Biosynthesis their roles in induction of cellulase transporters from Trichoderma reesei and two major facilitator super family sugar［J］.J Biol Chem，2013，288:32861-32872.

［14］ Hartl L，Kubicek C P，Seiboth B.Induction of the gal pathway and cellulase genes involves no transcriptional inducer function of the galactokinase in Hypocrea jecorina［J］.J Biol Chem，2007，282:18654-18659.

［15］ Galazka O M，Tian C G，Beeson W T，et al.Cellodextrin transport in yeast for improved biofuel production［J］.Science，2010，330:84-86.

［16］ Schmoll M，F(xiàn)ranchi L，Kubicek C P.Envoy，a PAS/LOV domain protein of Hypocrea jecorina(anamorph Trichoderma reesei)，modulates cellulase gene transcription in response to light［J］.Eukaryot Cell，2005，4(12):1998-2007.

［17］ Schuster A，Tisch D，Seidl-Seiboth V，et al.Roles of protein kinase A and adenylate cyclase in light-modulated cellulase regulation in Trichoderma reesei［J］.Appl Environ Microbiol，2012，78(7):2168-2178.

［18］ Castellanos F，Schmoll M，Martínez P，et al.Crucial factors of the light perception machinery and their impact on growth and cellulase gene transcription in Trichoderma reesei［J］.Fungal Genet Biol，2010，47:468-476.

［19］ Gyalai-Korpos M，Nagy G，Mareczky Z，et al.Relevance of the light signaling machinery for cellulase expression in Trichoderma reesei(Hypocrea jecorina)［J］.BMC Research Notes，2010，3:330.doi:10.1186/1756-0500-3-330.

［20］ Tisch D，Kubicek C P，Schmoll M.The phosducin-like protein PhLP1 impacts regulation of glycoside hydrolases and light response in Trichoderma reesei［J］.BMC Genomics，2011，12:613.doi:10.1186/1471-2164-12-613.

［21］ Schmoll M，Schuster A，Silva R N，et al.The G-alpha protein GNA3 of Hypocrea jecorina(anamorph Trichoderma reesei)regulates cellulase gene expression in the presence of light［J］.Eukaryot Cell，2009，8(3):410-420.

［22］ Seibel C，Gremel G，Silva R N，et al.Light-dependent roles of the G-protein α-subunit GNA1 of Hypocrea jecorina(anamorph Trichoderma reesei)［J］.BMC Biol，2009，7:58.doi:10.1186/1741-7007-7-58.

［23］ Tisch D，Kubicek C P，Schmoll M.New insights into the mechanism of light modulated signaling by heterotrimeric G-proteins:ENVOY acts on gna1 and gna3 and adjusts cAMP levels in Trichoderma reesei(Hypocrea jecorina)［J］.Fungal Genet Biol，2011，48(6):631-640.

［24］ Hu Y，Liu G，Li Z，et al.G protein-cAMP signaling pathway mediated by PGA3 plays differentrolesin regulating the expressions of amylases and cellulases in Penicillium decumbens［J］.Fungal Genet Biol，2013，58-59:62-70.

［25］ Schmoll M，Tian C，Sun J，et al.Unravelling the molecular basis for lightmodulated cellulasegene expression:theroleof photoreceptors in Neurospora crassa［J］.BMC Genomics，2012，13:127.doi:10.1186/1471-2164-13-127.

［26］ Furukawa T，Shida Y，Kitagami N，et al.Identif i cation of specif i c binding sites for XYR1，a transcriptional activator of cellulolytic and xylanolytic genes in Trichoderma reesei［J］.Fungal Genet Biol，2009，46:564-574.

［27］ Stricker A R，Steiger M G，Mach R L，et al.Xyr1 receives the lactose induction signal and regulates lactose metabolism in Hypocrea jecorina［J］.FEBS Lett，2007，581:3915-3920.

［28］ PortnoyT，MargeotA，Seidl-Seiboth V，etal.Differential regulation of the cellulase transcription factors XYR1，ACE2，and ACE1 in Trichoderma reesei strains producing high and low levels of cellulase［J］.Eukaryot Cell，2011，10(2):262-271.

［29］ Mach-Aigner A R，Pucher M E，Steiger M G，et al.Transcriptional regulation of xyr1，encoding the main regulator of the xylanolytic and cellulolytic enzyme system in Hypocrea jecorina［J］.Appl Environ Microbiol，2008，74(21):6554-6562.

［30］ Derntl C，Gudynaite-Savitch L，Calixte S，et al.Mutation of the xylanase regulator 1 causes a glucose blind hydrolase expressing phenotype in industrially used Trichoderma strains［J］.Biotechnol Biofuels，2013，6(1):62.doi:10.1186/1754-6834-6-62.

［31］ Noguchi Y，TanakaH，Kanamaru K，etal.Xylosetrigger reversible phosphorylation of XlnR the fungal transcriptional activator of xylanolytic and cellulolytic genes in Aspergillus oryzae［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2011，75(5):953-959.

［32］ Stricker A R，Trefflinger P，Aro N，et al.Role of Ace2(activator of cellulases 2)within the xyn2 transcriptosome of Hypocrea jecorina［J］.Fungal Genet Biol，2008，45(4):436-445.

［33］ Watanabe J，Tanaka H，Mogi Y，et al.Loss of Aspergillus oryzae amyR function indirectly affects hemicellulolytic and cellulolytic enzyme production［J］.J Biosci Bioeng，2011，111(4):408-413.

［34］ Liu G，Zhang L，Qin，Y，et al.Long-term strain improvements accumulate mutations in regulatory elements responsible for hyper-production of cellulolytic enzymes［J］.Sci Rep，2013，3:1569.doi:10.1038/srep01569.

［35］ Coradetti S T，Craig J P，Xiong Y，et al.Conserved and essential transcription factors for cellulase gene expression in ascomycete fungi［J］.PNAS，2012，109(19):7379-7402.

［36］ Coradetti S T，Xiong Y，Glass N L.Analysis of a conserved cellulase transcriptional regulator reveals inducer-independent production of cellulolytic enzymes in Neurospora crassa［J］.Microbiol Open，2013，2(4):595-609.

［37］ Kunitake E，Shuji Tani S J，Jun-ichi Sumitani J，et al.A novel transcriptional regulator，ClbR，controlsthe cellobiose-and cellulose-responsive induction of cellulase and xylanase genes regulated by twodistinctsignalingpathways in Aspergillus aculeatus［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2013，97:2017-2028.

［38］ Yamakawa Y H，Endo Y，Li N，et al.Regulation of cellulolytic genes by McmA，the SRF-MADS box protein in Aspergillus nidulans［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，431(4):777-782.

［39］ Mikiko N M，F(xiàn)urukawa T，Shida Y，et al.A new Zn(II)2Cys6-type transcription factor BglR regulates β-glucosidase expression in Trichoderma reesei［J］.Fungal Genet Biol，2012，49:338-397.

［40］ Wang M，He D，Liang Y，et al.Factors involved in the response to change ofagitation rate during cellulase production from Penicillium decumbens JUA10-1［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2013，40:1077-1082.

［41］ 周廣麒，呂晶，李忠海，等.斜臥青霉去泛素化蛋白酶CREB的缺失提高纖維素酶的生產(chǎn)［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2012，28(8):959-972.

［42］ Hunter A J，Morrisa T A，Jinc B，et al.Deletion of creB in Aspergillus oryzae increases secreted hydrolytic enzyme activity［J］.Appl Environ Microbiol，2013，79(20):5480-5487.

［43］ Denton J A，Kelly J M.Disruption of Trichoderma reesei cre2，encoding an ubiquitin C-terminal hydrolase，results in increased cellulase activity［J］.BMC Biotechnol，2011，11:103.doi:10.1186/1472-6750-11-103.

［44］ Vu B V，Pham K T M，Nakayashiki H.et al.Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae［J］.Appl Environ Microbiol，2013，doi:10.1128/AEM.02082-13.

［45］ Xin Q，Gong Y，LvX，etal.Trichoderma reeseihistone acetyltransferase Gcn5 regulates fungal growth，conidiation，and cellulase gene expression［J］.Curr Microbiol，2013，67(5):580-589.

［46］ Seiboth B，Karimi R，Phatale P，et al.The putative protein methyltransferase LAE1 controls cellulase gene expression in Trichoderma reesei［J］.Mol Microbiol，2012，84(6):1150-1164.

［47］ Wang M，Zhao Q，Yang J，et al.Amitogen-activated protein kinase Tmk3 participates in high osmolarity resistence，cell wall integrity maintenace and cellulase production regulation in Trichoderma reesei［J］.PLoS One，2013，8(8):e72189.doi:10.1371/journal.pone.0072189.

［48］ Wang F，Liang Y，Wang M，et al.Functional diversity of the p24γ homologue Erp reveals physiological differences between two filamentous fungi［J］. Fungal Genet Biol， 2013， doi:10.1016/j.fgb.2013.08.017.