趙麗娟, 周 潔, 高 誠

(1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 揚州 225009; 2.上海實驗動物研究中心, 上海 201203)

·綜 述·

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)及其應(yīng)用

趙麗娟1,2, 周 潔2, 高 誠2

(1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 揚州 225009; 2.上海實驗動物研究中心, 上海 201203)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(LAMP)是一種新的核酸擴增法。該方法在一定溫度下一步即可完成擴增反應(yīng)。由于其擴增效率極高、反應(yīng)簡單快速、高特異性和反應(yīng)結(jié)果只需肉眼觀察的特點，LAMP法已廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌等的定性定量檢測和臨床疾病的診斷。本文介紹了LAMP方法的原理及其在微生物分子檢測方面的應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(LAMP); 核酸擴增; 基因檢測

2000年日本學(xué)者Notomi等[1]發(fā)明一種新型的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法(即LAMP 法)。LAMP方法針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物, 利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63℃左右)保溫30～60 min,即可完成核酸的擴增反應(yīng)。擴增效率極高，可在15～60 min內(nèi)實現(xiàn)109～1010倍的擴增。與常規(guī)PCR相比，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法是一種不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，且簡單、快速、特異性強的全新的核酸擴增方法[2]。

1 LAMP技術(shù)的原理

LAMP技術(shù)針對靶基因設(shè)定的6個不同的區(qū)域設(shè)計了4種特異引物，包括一對內(nèi)引物(FIP和BIP)和一對外引物(F3和B3)。FIP(forward inner primer)3′端含有與F2c互補的F2區(qū)段，在5′端含有與F1c相同序列的區(qū)段; BIP(backward inner primer)3′端含有與B2c互補的B2區(qū)段，在5′端含有與B1c相同序列的區(qū)段; F3(forward outer primer)含有與目標(biāo)DNA上的F3序列相同的區(qū)段; B3(backward outer primer)含有與目標(biāo)DNA上的B3序列相同的區(qū)段。其擴增原理是根據(jù)這4條特殊引物，配合Bst DNA聚合酶的作用，在等溫條件(63℃左右)DNA開始合成。利用可以產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)的引物和Bst DNA聚合酶的鏈置換合成活性，靶序列兩端引物結(jié)合處循環(huán)不斷地產(chǎn)生環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)。當(dāng)一個引物向雙鏈DNA 的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈解離變成單鏈，引物在恒溫條件下不斷引發(fā)新鏈的合成，靶基因因此得到高效擴增。反應(yīng)可分為擴增循環(huán)起始結(jié)構(gòu)形成階段和擴增循環(huán)階段[3]。

為使反應(yīng)時間進一步縮短, 可在體系中加入環(huán)引物(Loop Primer F/B)。LAMP環(huán)引物是指在啞鈴狀結(jié)構(gòu)的5′末端的環(huán)狀單鏈部分(B1區(qū)段與B2區(qū)段之間, 或者F1區(qū)段與F2區(qū)段之間)導(dǎo)入具有互補序列的環(huán)引物(分別為環(huán)引物B和F), 就能增加DNA合成的起點。環(huán)引物的加入，使含環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單鏈都能用作擴增起點，稱為LAMP快速法。與傳統(tǒng)LAMP方法相比，LAMP快速法的擴增時間更短。

2 LAMP技術(shù)的特點

LAMP技術(shù)相比其他技術(shù)有很多特點。4個引物對靶序列的6個特異序列區(qū)的識別，保證了LAMP擴增的高度特等溫高效。LAMP在等溫條件下擴增，條件單一，受非靶序列的影響小，并且其檢測極限很小，僅為幾個拷貝。確定了最適反應(yīng)溫度后，由于無需預(yù)先熱變性的優(yōu)勢，LAMP反應(yīng)在1小時內(nèi)就可將靶序列擴增至109倍[4]。儀器要求寬松，不需要PCR儀和其他檢測儀器，僅水浴鍋或其他恒溫儀器即能完成反應(yīng)。產(chǎn)物易檢測，只需肉眼觀察或濁度儀檢測沉淀濁度即能判斷擴增與否。操作簡單，反應(yīng)不需要特殊試劑，比傳統(tǒng)PCR簡單，反應(yīng)后無需電泳，操作人員無需額外培訓(xùn)。LAMP技術(shù)也存在缺陷。LAMP的擴增是利用Best DNA聚合酶的鏈置換反應(yīng)，因為對靶序列長度有一定的要求，最適長度在300～500 bp內(nèi)，無法進行長鏈DNA 的擴增。由于反應(yīng)靈敏度高，擴增產(chǎn)物數(shù)量大, LAMP反應(yīng)很易造成氣溶膠污染。

3 LAMP技術(shù)的應(yīng)用

由于LAMP相比普通核酸擴增方法無法比擬的優(yōu)點，已經(jīng)得到越來越多國內(nèi)外實驗人員的青睞。不僅如此，LAMP技術(shù)近年來已被多國廣泛應(yīng)用于病原體快速檢測，其試劑盒的研發(fā)也開始變成新的趨勢。近年來LAMP技術(shù)又有新的發(fā)展和改進，最新報道稱聚乙二醇可加速LAMP反應(yīng)[5]，而其在微生物分子檢測方面的報道也不斷出現(xiàn)。本文重點列舉總結(jié)了一些國內(nèi)外成就以及一些最新進展。

3.1 LAMP在病毒檢測中的應(yīng)用

Imai等[6]用RT-LAMP建立了一個實驗室快速檢測H5N1禽流感病毒的方法，實驗對人類和野生鳥類咽拭子進行監(jiān)測，結(jié)果表明RT-LAMP對H5亞型有更高的特異性，LAMP可作為一個監(jiān)測禽流感爆發(fā)的診斷工具。Duc等[7]設(shè)計了一套用RT-LAMP方法特異性擴增H5N1禽流感病毒HA基因新的引物, 對比之前報道過的設(shè)計，RT-LAMP法有更好的敏感性和特異性。Zhang等[8]報道了一項人類禽流感病毒HA基因和NA基因的RT-LAMP檢測方法。根據(jù)與WHO推薦的RT-PCR方法相比, RT-LAMP法更快速。其H7基因的檢測極限與RT-PCR相近，但其N9基因的檢測敏感性比RT-PCR高出102倍。陳蕾等[9]建立了豬瘟病毒RT-LAMP檢測法，靈敏度試驗顯示RT-LAMP的靈敏度比RT-PCR高102倍，并進行特異性試驗結(jié)果結(jié)果均為陰性證明了RT-LAMP對豬瘟病毒的高度特異性。Yin等[10]針對豬瘟病毒E2基因設(shè)計引物進行RT-LAMP試驗。結(jié)果表明RT-LAMP的陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為均優(yōu)于常規(guī)RT-PCR，特異性實驗結(jié)果顯示其不對其他豬病毒發(fā)生擴增，特異性很高。Miren等[11]用RT-LAMP試劑盒法高效的檢測出諾瓦克病毒GI型和GII型, 對比證實了其高度的敏感性。Li等[12]證實用RT-LAMP方法檢測技術(shù)能基本克服目前在丙型肝炎病毒基因診斷方面存在的一些弊端，且與RT-PCR相比在可操作性和檢測時間及設(shè)備要求方面擁有更大的優(yōu)勢。Li等[13]用LAMP方法對淋巴囊腫病毒進行快速檢測證實了其檢出極限與RT-PCR類似，比普通PCR高出10倍，并認(rèn)為其或能進行淋巴囊腫病毒潛在感染的檢測。黃鶴等[14]建立了羊痘病毒CaPV-LAMP的儀器和目測兩種方法，其檢測方法的最低檢測值為比OIE推薦的PCR方法高104倍，為羊痘病毒的實驗室檢測提供了新的技術(shù)手段。Qiao等[15]成功建立了赤羽病毒的RT-LAMP檢測法。實驗根據(jù)赤羽病毒核蛋白上的高保守片段設(shè)計引物，結(jié)果顯示LAMP具有很高的特異性和敏感性，檢測極限為5.0 TCID50/ml。Shen等[16]應(yīng)用RT-LAMP技術(shù)檢測了番木瓜畸型花葉病毒，根據(jù)病毒CP保守序列設(shè)計引物，結(jié)果證實其敏感性比RT-PCR高出10倍。LAMP方法打破了此前沒有可用快速檢測番木瓜畸型花葉病毒方法的問題。Dukes等[17]根據(jù)3D蛋白聚合酶區(qū)設(shè)計引物建立的了口蹄疫病毒的LAMP檢測法，并與RT-PCR作比較。敏感性實驗結(jié)果表明用LAMP方法10個拷貝22min即可檢出，速度與靈敏度均高于RT-PCR，特異性實驗證實該方法有很高的特異性，鑒于其快速高效，LAMP方法可用于野外病原的快速檢測。

3.2 LAMP在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用

Maruyama等[18]率先將LAMP方法與原位雜交技術(shù)結(jié)合來檢測攜帶stx2基因的大腸埃希菌0157:H7，并應(yīng)用熒光抗體同步細(xì)胞鑒定。呂恒等[19]建立的基于顏色判定的大腸埃希菌O157:H7 LAMP檢測方法特異而靈敏，適用于大腸埃希菌O157:H7的快速檢測。朱杰儀等[20]建立了副豬嗜血桿菌LAMP方法。試驗結(jié)果證實了LAMP方法在恒溫條件下的高特異性，擴增反應(yīng)在1h內(nèi)完成，靈敏度試驗證實其比PCR方法敏感102倍。Mitarai等[21]證實了LAMP方法用臨床樣本檢測肺結(jié)核的可行性，直接從痰液中檢測得結(jié)核分枝桿菌的靈敏度很高。方法簡單、快速，易操作，可作為一個檢測肺結(jié)核的主要方法，也能對其他檢測方法做出補足。Goto等[22]建立了金黃色葡萄球菌腸毒素4種基因型的LAMP實驗，結(jié)果表明與傳統(tǒng)PCR相比有相等的特異性和較高的靈敏度。證實LAMP技術(shù)是一種可應(yīng)用于臨床診斷來篩查和分型金黃色葡萄球菌腸毒素的方法。Han等[23]針對弧菌溶血素基因(vvhA)設(shè)計引物進行LAMP擴增和特異性和敏感性實驗。結(jié)果表明無假陽性或假陰性，特異性很高且比常規(guī)的PCR敏感10倍。Wei等[24]針對鼠疫耶爾森氏菌特有F1基因設(shè)計一套LAMP引物，為鼠疫炎耶爾森菌的檢測提供了新的發(fā)展方向，認(rèn)為LAMP方法有望成為簡易的常規(guī)檢測手段，尤其適用于基層檢驗檢疫機構(gòu)及現(xiàn)場檢驗。Yang等[25]針對沙門氏菌的兩個不同蛋白區(qū)域設(shè)計引物，同時用兩種LAMP和PCR方法檢測沙門氏菌，結(jié)果表明兩種LAMP方法都高度敏感，是PCR方法的102倍。對比顯示，兩種LAMP方法都能在帶殼蛋中快速精確檢測出沙門氏菌血清型, 并有望列入蛋的沙門氏菌檢測程序。

3.3 LAMP在寄生蟲測中的應(yīng)用

Isaia等[26]對弓形蟲B1和TgOWP基因進行LAMP擴增，并結(jié)合免疫熒光試驗和PCR，結(jié)果顯示LAMP靈敏度極高，證實LAMP在弓形蟲檢測方面快速特異和靈敏的優(yōu)越性。Hiroka等[27]對純化后的瘧原蟲SPECT2基因進行LAMP擴增, 并利用LAMP方法成功檢測出一只易被顯微鏡漏檢的僅攜帶一個卵囊的按蚊, 證實了LAMP方法的高靈敏性。Wang等[28]根據(jù)瑟氏泰勒蟲P33基因設(shè)計引物, 建立了LAMP檢測方法, 結(jié)果顯示LAMP的靈敏度和陽性檢出率均高于常規(guī)PCR。Matovu 等[29]利用LAMP和PCR方法對錐蟲進行比較檢測。結(jié)果表明PCR方法的用時是LAMP方法的5倍。Nkouawa 等[30]建立了人類鏈狀帶絳蟲的LAMP檢測方法。Sako等[31]用LAMP方法，從寄生蟲組織和人類排泄物中成功檢測和區(qū)分了人類鏈狀帶絳蟲、豬帶絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲，表明LAMP方法很適合臨床樣本的檢測。

3.4 LAMP在真菌測中的應(yīng)用

Ludwig等[32]對禾谷鐮孢菌的gaoA基因設(shè)計引物并建立LAMP檢測方法，靈敏性實驗結(jié)果顯示LAMP法對純化后靶基因的檢測極限極低，并且特異性實驗證明其只擴增出禾谷鐮孢菌DNA，證實了LAMP法的高度特異性。

3.5 支原體的檢測

Saito等[33]建立了肺炎支原體的LAMP檢測方法，結(jié)果表明在陽性樣本檢出率一致的情況下，LAMP法的檢出限值優(yōu)于RT-PCR法，證明了LAMP方法的高敏感性。Jiahe等[34]根據(jù)豬肺炎支原體mhp165基因設(shè)計引物并建立了LAMP快速檢測方法。靈敏度實驗表明10fg DNA在30min內(nèi)即可被檢測到，LAMP技術(shù)加速并簡化了豬肺炎支原體的檢測程序。

3.6 轉(zhuǎn)基因方面的應(yīng)用

Tao等[35]應(yīng)用LAMP方法分別針對外源性核酸HbsAg和hATIII設(shè)計一套引物來監(jiān)測轉(zhuǎn)基因山羊。在加入SYBR Green后目測即可見結(jié)果，對比發(fā)現(xiàn)其比傳統(tǒng)PCR方法更敏感快速和簡便，證實了LAMP是一種快速準(zhǔn)確監(jiān)測轉(zhuǎn)基因山羊的方法。

4 小結(jié)與展望

LAMP技術(shù)以其高效快速的特點近年來發(fā)展迅速, 為實驗室檢測提供了一個新途徑。由于其簡單的操作和試劑盒的開發(fā), 該技術(shù)很有可能在未來替代傳統(tǒng)核算擴增方法, 由實驗室擴展到實地, 更好地應(yīng)用于基層診斷檢測。LAMP技術(shù)本身尚存在缺陷,產(chǎn)物易造成污染以及假陽性問題還需改善。總是,隨著LAMP技術(shù)的進一步完善和成熟, 其必能在病原體基因檢測方面發(fā)揮重要作用并逐漸應(yīng)用于臨床。

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Loop-mediated Isothermal Amplification Technique and Its Application

ZHAO Lijuan1,2, ZHOU Jie2, GAO Cheng2
(1. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;2. Shanghai Laboratory Animal Research Center, Shanghai 201203, China)

Loop-mediated isothermal amplification(LAMP) is a novel nucleic acid amplification method.At a certain temperature, LAMP performed only one step to terminate the process. Due to its high efficiency, simplicity, rapidly, high specificity and theResultof LAMP is easily detected by naked eyes,LAMP has been widely applied in the qualitative and quantitative detection of viruses, bacteria and clinical diagnosis of disease. In this paper, we introduced the principle of LAMP and its applicability in molecular detection and diagnosis.

Loop-mediated isothermal amplification(LAMP); Nucleic acid amplification;Gene detection

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0162-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.018

2013-10-16

上海市科委基金項目(No.11140901002)

趙麗娟(1988-),女, 碩士研究生。研究方向: LAMP技術(shù)的應(yīng)用

周 潔, 女, 副研究員。E-mail: zhoujie0526@163.com