楊曉艷，魏柏青，辛有全，靳 娟，何 建，熊浩明，魏榮杰，祁美英，李存香，金 泳，代瑞霞

青海省自1954年證實(shí)存在鼠疫自然疫源地以來，全省有33個(gè)縣(市)、119個(gè)鄉(xiāng)(鎮(zhèn))被確定為鼠疫疫源地，疫點(diǎn)695處，疫源面積近20萬km2。青海高原鼠疫自然疫源地是目前我國動(dòng)物間和人間鼠疫流行最嚴(yán)重的地區(qū)之一，至2012年的60年間，僅1984年、2007年、2008年和2012年無病例報(bào)告外，其余年間均有人間鼠疫發(fā)生。因此，迫切需要采用新的技術(shù)手段，針對這種具有重要公共衛(wèi)生意義的傳染病進(jìn)行深入研究，掌握其遺傳變異的規(guī)律、形成機(jī)理以及地域和時(shí)空分布特征，為制訂有效的防治策略，鼠疫菌的分型、溯源以及保障國家生物安全奠定基礎(chǔ)。為此，作者對青海高原1954年以來分離的839株鼠疫菌采用DFR技術(shù)對其進(jìn)行基因分型的研究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株 共有839株鼠疫菌用于本研究。其中喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地829株，青海田鼠鼠疫自然疫源地10株。這些菌株涵蓋了青海高原鼠疫疫源地的不同時(shí)間、地區(qū)、宿主、媒介體內(nèi)分離的鼠疫菌，由青海國家鼠疫菌保藏中心提供。

1.2鼠疫菌DNA的提取 將鼠疫菌培養(yǎng)于赫氏瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，DNA提取按照經(jīng)典的苯酚-氯仿混合抽提法進(jìn)行[1]。

1.3引物和PCR擴(kuò)增方法 鼠疫菌差異區(qū)段(Different Region,DFR)分型，使用23個(gè)DFR和PMT1(質(zhì)粒驗(yàn)證引物)的擴(kuò)增引物(引物序列參見文獻(xiàn)[2])。PCR反應(yīng)體系：10×buffer 3 μL，10 mmol dNTP 0.1 μL, 5U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL, 10 μmoL引物對1 μL，模板DNA(2 ng/μL)5 μL, 用去離子水補(bǔ)足至30 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃終延伸3 min。PCR產(chǎn)物檢測：擴(kuò)增結(jié)束后取10 μL產(chǎn)物進(jìn)行濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳，用goldview 染料進(jìn)行染色，紫外燈下記錄結(jié)果，陽性結(jié)果記錄為“1”，陰性結(jié)果記錄為“0”。每次PCR檢測均設(shè)陰性對照(用去離子水取代模板)和陽性對照(模板為鼠疫菌菌株82009和620024 DNA的混合物，包括24個(gè)DFRs)?？梢蒔CR結(jié)果和陰性PCR結(jié)果至少重復(fù)1次。

1.4地理信息系統(tǒng)(GIS) 運(yùn)用青海省地方病預(yù)防控制所地理信息系統(tǒng)(GIS)[3]進(jìn)行鼠疫菌基因型空間分布特征的分析。

2 結(jié) 果

2.1青海省鼠疫菌的基因分型 青海高原存在2種類型的鼠疫疫源地。被試的839株菌，共發(fā)現(xiàn)有11個(gè)基因組型。檢索包含909株中國鼠疫菌自然分離菌株的DFR分型數(shù)據(jù)庫[2]，有8個(gè)基因組型與其相同，分別為1b、5、7、8、10、14、21、30型等基因組型，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的基因組型，即32、44、36。32型與5型接近，但32型缺失了DFR18；44型與8型接近，44型也缺失DFR18；36型亦與5型接近，但與5型相比缺少DFR10和DFR18。青海高原喜馬拉雅旱獺鼠疫疫源地以5、8型為主，青海高原青海田鼠鼠疫疫源地鼠疫菌基因組型為14型。青海省鼠疫菌株23個(gè)DFR和PMT1(質(zhì)粒驗(yàn)證引物)分布見表1。

表1 24個(gè)DFR在青海省791株鼠疫菌中的分布狀態(tài)

Note: “1” means PCR amplification showed positive; “0”means PCR amplification showed negative.

2.2鼠疫菌基因型的空間分布特征 青海省鼠疫疫源地所分離的鼠疫菌基因型具有一定的地理分布特征，8型菌株的分布區(qū)為祁連山南麓、青海湖環(huán)湖地區(qū)、青海南山的祁連、門源、剛察、海晏、共和、天峻、烏蘭和宗務(wù)隆山的德令哈等地區(qū)，占56.14%(471/839)；5型菌株分布于青南高原的玉樹、雜多、治多、稱多、囊謙、曲麻萊和海西西部的格爾木等地區(qū)，占23.12%(194/839)；1b型菌株分布于冷湖、烏蘭、澤庫；7型菌株分布于循化、同仁、澤庫、德令哈、囊謙；32型菌株分布于格爾木的唐古拉地區(qū)；44型菌株分布于祁連、門源；36型菌株分布于囊謙；唯獨(dú)囊謙地區(qū)有10型分布，其菌株分離自2004年一次肺鼠疫流行中的尸體和病人。在稱多縣青海田鼠分布區(qū)，鼠疫菌基因型屬于14型，占1.19%(10/842)。見表2。

表2 青海高原鼠疫耶爾森菌基因組型的地區(qū)分布

Note:Focus C--Marmothimalayanplague foci; Focus M--Microtusfuscusplague foci

3 討 論

周冬生等[4]人利用全基因組芯片比較基因組學(xué)的研究獲得了鼠疫菌22 個(gè)差異區(qū)段(DFR)，并將我國各鼠疫自然疫源地分離的 260 株鼠疫菌分成14 個(gè)基因組型。之后，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所又通過消減雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)了新的差異區(qū)段，并使用23個(gè)DFR的擴(kuò)增引物，對分離自我國的909株鼠疫菌進(jìn)行了DFR分型，將909株中國鼠疫菌分離株分成32個(gè)基因組型，根據(jù)疫源地與宿主的分布規(guī)律，提出了主要基因組型和次要基因組型的概念，前者與鼠疫菌在自然疫源地中的演化密切相關(guān)。因此，隨著盡可能多的DFR的發(fā)現(xiàn)，DFR分型方法會(huì)日趨完善。

青海省青海田鼠鼠疫自然疫源地是近年來新發(fā)現(xiàn)的一塊疫源地[5]，青海田鼠是主要儲(chǔ)存宿主，細(xì)鉤黃鼠蚤和直緣雙蚤指名亞種為主要傳播媒介。分布于青海省稱多縣珍秦鄉(xiāng)境內(nèi)，與四川省石渠縣接壤。截止目前青海田鼠鼠疫疫源地內(nèi)分離到的10株鼠疫菌均為14型。

青海省喜馬拉雅旱獺鼠疫疫源地內(nèi)鼠疫菌基因型比較復(fù)雜，以5、8型為主。5型多分布在青海的青南高原和海西西部地區(qū)； 8型菌株的分布區(qū)為祁連山南北麓、青海湖環(huán)湖地區(qū)及青海南山和宗務(wù)隆山等地區(qū)；8型和5型的交匯處常同時(shí)有2～3種基因型的流行； 2004年青海省囊謙縣肺鼠疫暴發(fā)流行時(shí)所分離的8株菌株其基因組型全部為10型。新發(fā)現(xiàn)的3個(gè)基因組型，32型菌株分布于格爾木的唐古拉地區(qū)；44型菌株分布于祁連、門源；36型菌株分布于囊謙。由于青海高原地形復(fù)雜，自然景觀垂直成帶十分明顯，景觀特征的多樣性使得地區(qū)間生態(tài)系差異較大，草甸草原幾乎占據(jù)整個(gè)青海；森林草甸草原出現(xiàn)于祁連山東部、玉樹東南部；昆侖山—阿爾金山山地以干旱的高山草原為主，鼠疫菌為了適應(yīng)不同的自然景觀，基因組型發(fā)生變化也就不可避免。

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