趙進(jìn)輝，胡 琪，袁海超，洪 茜，肖海斌，劉木華

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院/生物光電及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

金霉素是一種廣譜四環(huán)素類抗生素，分子式為C22H23ClN2O8。它常被用作魚、豬、鴨等動物治療和預(yù)防疾病的抗生素藥物，結(jié)果導(dǎo)致一部分藥物殘留在動物體內(nèi)，甚至對水體和生物環(huán)境也造成一定的污染，進(jìn)而影響到人們的身體健康。目前，常用的金霉素檢測方法有理化檢測方法、熒光分析法、微生物法、酶聯(lián)免疫分析法等［1－7］。表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface enhanced Raman spectrum，SERS)由于具有受水干擾小、檢測靈敏度高與快速方便等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)藥、化學(xué)、表面科學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用和探索，已成為一種現(xiàn)代快速檢測方法［8－9］。程劼等［10］利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對寵物飼料中三聚氰胺的快速測定研究。田中群［11］研究組提出殼層隔絕納米粒子增強(qiáng)拉曼光譜(SHINERS)方法并將其應(yīng)用到橘子皮中的農(nóng)藥殘留檢測中。李言等［12］針對赤蘚紅的理論計(jì)算拉曼、普通拉曼及表面增強(qiáng)拉曼光譜進(jìn)行了研究，為常規(guī)食品樣品中的赤蘚紅的拉曼檢測提供了基礎(chǔ)。針對表面增強(qiáng)拉曼光譜的技術(shù)優(yōu)勢，本研究將其應(yīng)用到金霉素水溶液的快速檢測中有作重要意義。本研究先對比分析了金霉素水溶液的普通拉曼(Raman)光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜，然后對表面增強(qiáng)拉曼光譜進(jìn)行了基于air－PLS的光譜預(yù)處理，最后對金霉素水溶液的表面增強(qiáng)拉曼進(jìn)行了半定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度約為98.0%，購于中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng));表面增強(qiáng)試劑OTR103、OTR202(歐普圖斯光學(xué)納米科技有限公司);超純水。

1.2 儀器設(shè)備

RamTracer?－200型便攜式拉曼光譜儀(歐普圖斯光學(xué)納米科技有限公司);實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(科爾頓水務(wù)有限公司);JK－50B型超聲波清洗器(合肥金尼克機(jī)械有限公司);FA1004B型電子天平(精度為0.1 mg，上海上平儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

稱取10.0 mg金霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用少量超純水溶于100mL棕色容量瓶中，超聲溶解后再定容至刻度，得到100 mg/L的金霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液備用，使用時(shí)再逐級稀釋至所需質(zhì)量濃度。

在2mL玻璃進(jìn)樣瓶中依次加入表面增強(qiáng)試劑OTR202500μL、待測液20μL和OTR103100μL，混合均勻后放入樣品池中進(jìn)行測量，共采集了 6 個(gè)濃度分別為 0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，15.0 mg/L 的金霉素水溶液的拉曼光譜，400～1800 cm－1波段范圍內(nèi)的原始表面增強(qiáng)拉曼光譜如圖1所示。拉曼光譜采集參數(shù)設(shè)置如下:光譜儀激光功率為200 mW，激光波長為785 nm，掃描光譜范圍為100～3300cm－1，選擇波段為400～1800 cm－1的光譜進(jìn)行研究，分辨率為6 cm－1，信號相對強(qiáng)度范圍為0～60000，積分時(shí)間為10 s，積分2次平均。

圖1 金霉素水溶液的原始的表面增強(qiáng)拉曼光譜Fig.1 Original SERS spectra of aureomycin solution

2 結(jié)果與分析

2.1 金霉素水溶液的普通拉曼光譜與表面增強(qiáng)拉曼光譜

采集金霉素水溶液的普通拉曼光譜(沒有加表面增強(qiáng)試劑OTR202和OTR103)和表面增強(qiáng)拉曼光譜(加了表面增強(qiáng)試劑OTR202和OTR103，金霉素水溶液的濃度為15.0 mg/L)，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，金霉素水溶液的普通拉曼光譜的光譜信號較弱，存在一定強(qiáng)度的熒光背景，沒有明顯的金霉素的拉曼特征峰被獲取。而加入了表面增強(qiáng)劑OTR202和OTR103的金霉素水溶液的拉曼光譜信號強(qiáng)度大大的增強(qiáng)，且出現(xiàn)了明顯的特征峰，這說明表面增強(qiáng)劑OTR202和OTR103對金霉素水溶液的拉曼峰有較好的增強(qiáng)效果。

圖2 金霉素水溶液的普通拉曼光譜與表面增強(qiáng)拉曼光譜Fig.2 The normal Raman and SERS spectra of aureomycin solution

2.2 表面增強(qiáng)試劑對拉曼光譜的影響

從圖2可知，加入了表面增強(qiáng)試劑的金霉素水溶液的表面增強(qiáng)拉曼光譜信號得到了增強(qiáng)，但其是否受到表面增強(qiáng)劑本身信號的干擾值得進(jìn)一步探討。因此本研究對表面增強(qiáng)試劑OTR202、OTR103、OTR202與OTR103混合液、加入了表面增強(qiáng)劑OTR202與OTR103的金霉素水溶液的原始拉曼光譜進(jìn)行對比分析。圖3給出了利用拉曼光譜儀得到的表面增強(qiáng)試劑OTR202、OTR103、OTR202與 OTR103混合液、加入了表面增強(qiáng)劑OTR202與OTR103的金霉素水溶液的原始拉曼光譜。從圖3可知，表面增強(qiáng)試劑OTR202、OTR103、OTR202與OTR103混合液的拉曼光譜中存在一定的光譜背景信號，但其并沒有影響到金霉素拉曼光譜的拉曼特征峰的鑒別，其強(qiáng)度也相對較小。結(jié)合圖2和圖3可知，當(dāng)加入了表面增強(qiáng)試劑后，金霉素水溶液的拉曼特征峰得到了顯現(xiàn)和加強(qiáng)。因此，將OTR202和OTR103用于金霉素水溶液的拉曼測定的表面增強(qiáng)試劑是可行的。

圖3 表面增強(qiáng)試劑的原始拉曼光譜Fig.3 Original SERS spectra of surface strengthening agents

2.3 光譜預(yù)處理

從圖1可以看出，采集的原始拉曼光譜中包含樣本的熒光信號、拉曼信號以及各種背景噪聲等，特別是樣本自身的強(qiáng)熒光信號對拉曼信號的強(qiáng)度影響較大，因此有必要消除樣本熒光背景對拉曼信號強(qiáng)度的影響。目前，常用的熒光背景扣除方法有倒數(shù)法、小波分析法、自適應(yīng)迭代懲罰最小二乘法(adaptive iteratively reweighted penalized least squares，air－PLS)等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法［13］。本研究應(yīng)用 air－PLS 扣除噪聲和強(qiáng)熒光等背景信號，圖4給出了5.0 mg/L的金霉素水溶液的背景扣除光譜結(jié)果。從圖4可以看出，原始光譜中的背景信號得到了較好的消除，有利于后續(xù)數(shù)據(jù)分析和處理。

圖4 基于air－PLS的背景扣除的結(jié)果Fig.4 Result of background subtraction using air－PLS

2.4 金霉素水溶液的表面增強(qiáng)拉曼半定量分析

圖5 給出了扣除背景后的不同濃度(0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，15.0 mg/L)的金霉素水溶液的表面增強(qiáng)拉曼光譜。從圖5可以看出，隨著濃度的下降，各拉曼特征峰的強(qiáng)度呈下降趨勢。當(dāng)濃度下降到0.1 mg/L時(shí)，某些拉曼特征峰已經(jīng)不明顯甚至消失了，但在1578，1434，1116，996 cm－1等幾處的拉曼特征峰的位置較穩(wěn)定，且還能觀察到，可以作為定量或者半定量分析特征拉曼峰。某些拉曼峰(如1312 cm－1處)雖然還能夠觀察到，但其拉曼峰的位置已經(jīng)發(fā)生了較大變化，因此不適合作為定量或者半定量分析特征拉曼峰。綜上所述，采用本研究的表面增強(qiáng)拉曼方法檢測金霉素的濃度能夠達(dá)到0.1 mg/L。

圖5 不同濃度的金霉素水溶液的表面增強(qiáng)拉曼光譜Fig.5 SERS spectra of different concentrations of aureomycin solution

3 結(jié)論

本研究以金霉素水溶液為研究對象，將表面增強(qiáng)拉曼光譜應(yīng)用到金霉素水溶液的快速測定中。以O(shè)TR202和OTR103作為表面增強(qiáng)試劑，分析了波數(shù)范圍為400～1800 cm－1的金霉素水溶液的拉曼光譜，應(yīng)用air－PLS方法以消除原始的表面增強(qiáng)拉曼光譜中的熒光等背景信號，本文研究方法對金霉素水溶液的檢測濃度可達(dá)到0.1 mg/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)可用于金霉素水溶液的快速測定中。

［1］Pikkemaat M G.Microbial screening methods for detection of antibiotic residues in slaughter animals［J］.Anal Bioanal Chem，2009，395:893－905.

［2］Pikkemaat M G，Dijk S O，Schouten J，et al.A new microbial screening method for the detection of antimicrobial residues in slaughter animals:the nouws antibiotic test(NAT －screening)［J］.Food Control，2008，19:781－789.

［3］王蘇華，周楊.雞蛋中新霉素殘留的微生物學(xué)檢測方法［J］.中國獸醫(yī)雜志，2003，37(2):16－19.

［4］侯法菊，王玉寶，苗延虹，等.熒光光度法研究修飾β－環(huán)糊精與Eu(Ⅲ):金霉素體系的相互作用及其應(yīng)用［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27(2):231－234.

［5］趙進(jìn)輝，袁海超，劉木華，等.鴨肉中金霉素殘留量LSSVR 同步熒光法測定［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2012，43(12):136－140.

［6］Shen H Y，Jiang H L.Screening，determination and confirmation of chloramphenicol in seafood，meat and honey using ELISA，HPLC－LJVD，GC－ECD，GC－MS－EI－SIM and GCMS－NCI－SIM methods［J］.Analytica Chimica Acta，2005，535(1/2):33－41.

［7］Huet A C，Charlier C，Tittlemier S A，et al.Simultaneous determination of(Fluoro)quinolone antibiotics in kidney，marine products，eggs，and muscle by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54(8):2822－2827.

［8］鄭玲，趙燕平.不同發(fā)酵時(shí)間普洱茶的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別分析［J］.發(fā)光學(xué)報(bào)，2013，34(2):230－234.

［9］楊有銘，阮偉東，宋薇，等.表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測聯(lián)苯胺［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2012，33(10):2191－2194.

［10］程劼，蘇曉歐.納米銀粒子表面增強(qiáng)拉曼光譜在寵物飼料中三聚氰胺的速測研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2011，31(1):131－135.

［11］Li Jian－feng，Huang Yi－fan，Ding Yong，et al.Shell－isolated nanoparticle－enhanced Raman spectroscopy［J］.Nature，2010，464，392－395.

［12］李言，謝云飛，錢和，等.表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測赤蘚紅［J］.食品工業(yè)科技，2013，34(11):307－309，312.

［13］李響，呂勇.拉曼光譜檢測酒精濃度的背景扣除技術(shù)研究［J］.北京信息科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，28(2):27－30.