趙子高，王林風(fēng)，閆德冉，楊付偉

（河南天冠企業(yè)集團有限公司，車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室，河南 南陽 473000）

太空誘變育種又稱空間誘變育種，利用強輻射、微重力、高真空、弱磁場等宇宙空間特殊環(huán)境誘變因子的作用，使生物基因發(fā)生變異，再返回地面進行選育，培育新品種[1-2]。近年來我國航天育種發(fā)展迅速，作微生態(tài)制劑的乳酸菌、產(chǎn)維生素C的生黑醋酸桿菌、產(chǎn)泰樂菌素的由弗氏鏈霉菌、產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶鏈霉菌、甘露聚糖酶產(chǎn)生菌、產(chǎn)超氧化物歧化酶的芽孢桿菌、產(chǎn)纖維素酶的里氏木霉菌等[3-8]經(jīng)空間誘變后均在一定程度上獲得了正突變株。研究將生產(chǎn)木聚糖酶的黑曲霉菌種搭載“神舟九號”宇宙飛船進行空間誘變育種，以期獲得產(chǎn)酶能力大幅提高、性能穩(wěn)定的突變株，應(yīng)用于木聚糖酶的生產(chǎn)，降低纖維類原料在酶解過程物料黏度的同時促進半纖維素分解生成木糖等酵母可利用單糖，提高原料利用率，降低纖維乙醇生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

黑曲霉菌株（Aspergillus niger）：由本研究室從生產(chǎn)中分離獲得，CGMCC保藏號TG-Y。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂1.8%。種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，麩皮1%。篩選培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%，木聚糖1.0%，（NH4）2SO40.2%，MgSO40.05%，KH2PO40.1%，瓊脂粉2.0%。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米芯4%，麩皮2%，（NH4）2SO40.5%，KH2PO40.3%，MgSO40.1%，聚乙二醇2000 0.05%，微量元素0.1%。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1200型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；HY-211C恒溫振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；TDM低速離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；FE20pH計：上海梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHA-C恒溫振蕩器：常州國華電氣有限公司；LGJ-10D多岐管冷凍干燥機：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；50L全自動發(fā)酵罐：上海國強生化裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 搭載材料準備[9]

根據(jù)“神舟九號”飛船的搭載條件和技術(shù)要求，按以下兩種方式搭載，孢子懸液組TG-Y黑曲霉菌株以斜面培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)72 h，用無菌水清洗過濾，離心洗滌后制成1×1010CFU/mL孢子懸液（SP1），搭載。對照組（CK）為上述孢子懸液，不搭載。孢子粉組（SP2）TG-Y黑曲霉菌株以斜面培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)72 h，用無菌水清洗過濾，離心洗滌后，以滅菌后20%脫脂牛奶制備懸液，凍干，搭載。對照組（CK）為上述凍干粉，不搭載。

1.3.2 搭載過程

搭載實驗菌株的神州九號宇宙飛船于2012年6月16日在酒泉衛(wèi)星發(fā)射場，通過長征二號F遙九火箭發(fā)射升空，2012年6月29日，神舟九號飛船返回艙成功降落在位于內(nèi)蒙古中部的主著陸場預(yù)定區(qū)域，2012年7月5日，樣品送回河南天冠企業(yè)集團。

1.3.3 誘變菌株培養(yǎng)

“神舟九號”飛船搭載菌種返回后，將各搭載組的試管中孢子用無菌生理鹽水洗出，離心洗滌3次，將所得孢子進行適當(dāng)稀釋后涂布于PDA培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)36～48 h，觀察生長菌落的形態(tài)狀況，并計算未搭載菌株與搭載菌株的存活率和形態(tài)突變率，存活率和形態(tài)突變率計算公式如下：

1.3.4 高產(chǎn)突變株篩選

采用透明圈法[10]初篩，初步淘汰低產(chǎn)酶菌株，并在PDA培養(yǎng)基上將初步篩選出的高產(chǎn)空間誘變株進行4、5代傳代培養(yǎng)。將初步篩選出的菌株轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)96 h后，制成2×107CFU/mL孢子懸液，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進行復(fù)篩，測定酶活力。搖瓶實驗將孢子懸液以10%接種量接種于50 mL/250 mL三角瓶中，30 ℃、210 r/min條件下培養(yǎng)96 h，測定木聚糖酶活力。

1.3.5 酶活力測定

參照楊付偉等[11-12]木聚糖酶活力測定方法，略有改動。

1.3.6 遺傳穩(wěn)定性實驗

在PDA培養(yǎng)基上將復(fù)篩所得到的產(chǎn)酶突變株每半月進行1次的傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳代7～8代，并搖瓶發(fā)酵測定酶活力。

1.3.7 放大實驗

通過50 L全自動發(fā)酵罐進行產(chǎn)酶放大實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 空間誘變對黑曲霉形態(tài)的影響

黑曲霉經(jīng)空間搭載后，形態(tài)及存活率均發(fā)生了一定的變化，結(jié)果見表1。

表1 搭載后黑曲霉菌株存活率及形態(tài)突變率Table 1 Survival rate and morphology mutation ratio of Aspergillus niger loaded in spacecraft

由表1可知，與未搭載對照菌株的白色、由同心環(huán)向邊緣呈輻射狀的外觀比較，經(jīng)搭載處理的菌株形態(tài)表現(xiàn)為四類：（1）菌落大，邊緣不整齊，孢子量大。（2）菌落極小，邊緣整齊，孢子淺灰色，孢子量少。（3）菌落清晰，邊緣整齊，孢子豐富，松散，黑色。（4）菌落淺褐色，邊緣不整齊，孢子極少。SP1組形態(tài)突變率達到14.6%；SP2組形態(tài)突變率為5.4%，存活率達75.80%，這與凍干孢子處于休眠狀態(tài)在空間環(huán)境下不易發(fā)生變異有關(guān)。

2.2 空間誘變后產(chǎn)酶黑曲霉菌株的篩選

2.2.1 菌株篩選

利用產(chǎn)酶菌株能在含有低聚木糖的平板上形成透明圈，且透明圈/菌落直徑比值大小大致反映菌株產(chǎn)酶能力的高低，采用木聚糖瓊脂培養(yǎng)基平板從分離得到的1 500株產(chǎn)酶菌種初篩到10株分解木聚糖菌株，從SP1組篩選到4株，SP2組篩選到6株。

對初篩到的編號為SP1-057、SP1-191、SP1-268、SP1-523、SP2-145、SP2-336、SP2-582、SP2-651、SP1-752、SP2-801 菌株進行復(fù)篩，連續(xù)進行3批次搖瓶發(fā)酵實驗，結(jié)果如圖1所示。

圖1 10菌株3批次發(fā)酵結(jié)果Fig.1 Fermentation results of 10 strains in shake flasks for 3 batches

依據(jù)圖1 發(fā)酵結(jié)果選擇產(chǎn)酶活力較高且3批次酶活力變化波動不大的SP1-523、SP2-145、SP2-582、SP1-752、SP2-801這5株菌進行多點發(fā)酵實驗以進一步確定優(yōu)良菌株。

2.2.2 多點發(fā)酵實驗結(jié)果

實驗進行3批次，每批次取樣時間點為48h、72 h、84 h、96 h各測定一次酶活力，結(jié)果如表2所示。

表2 5種菌株發(fā)酵結(jié)果Table 2 Fermentation results of 5 strains at different time

由表2可知，SP1-523、SP2-801菌株發(fā)酵過程酶活力增加平穩(wěn)，單位時間內(nèi)酶活力增加幅度較大，兩者均有明顯的發(fā)酵優(yōu)勢，對兩者進行多次傳代培養(yǎng)驗證其遺傳穩(wěn)定性。

2.2.3 遺傳穩(wěn)定性

生產(chǎn)菌株往往存在隨著傳代次數(shù)的增加，菌株發(fā)生退化，導(dǎo)致其發(fā)酵能力降低，對于誘變菌株更易出現(xiàn)回復(fù)突變使其誘變性狀發(fā)生改變，因此對復(fù)篩到的SP1-523、SP2-801菌株進行7次傳代培養(yǎng)，考察其遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果如表3所示。

表3 遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 3 Results of hereditary stability

由表3 可知，SP1-523、SP2-801菌株經(jīng)多次傳代后，發(fā)酵性能穩(wěn)定，酶活力維持在（2 000±50）IU/mL，可見經(jīng)空間誘變篩選到的SP1-523、SP2-801菌株，酶活力提高20%，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.2.4 放大實驗

對SP1-523、SP2-801菌株進行50 L罐放大實驗，各自進行五批次發(fā)酵實驗，發(fā)酵周期120 h，酶活力結(jié)果如表4所示。

表4 菌株五批次發(fā)酵放大實驗結(jié)果Table 4 Results of strains scale-up experiment for 5 batches

由表4可知，經(jīng)五批次發(fā)酵放大實驗，SP1-523、SP2-801兩菌株，發(fā)酵周期120 h，酶活力均達（2 500±50）IU/mL，與對照比酶活力提高達25%左右，可見兩菌株發(fā)酵性能穩(wěn)定，具有高酶活力特性，可用于生產(chǎn)中進行放大實驗。

3 結(jié)論

隨著我國航天工業(yè)的飛速發(fā)展，利用太空誘變獲得具有優(yōu)良性狀的微生物菌株亦成為微生物誘變育種主要手段之一[13-16]，實驗中經(jīng)空間誘變后的黑曲霉菌株其形態(tài)和產(chǎn)酶能力均發(fā)生了不同程度的變化，通過多輪初篩、復(fù)篩獲得的SP1-523、SP2-801菌株具有高產(chǎn)木聚糖酶的能力，與出發(fā)菌株比，酶活力提高20%以上，且遺傳性能穩(wěn)定，易于培養(yǎng)，經(jīng)50 L罐放大實驗驗證，發(fā)酵水平可提高25%，具備作為工業(yè)微生物的條件，可作為規(guī)模化生產(chǎn)木聚糖酶的生產(chǎn)菌株使用，經(jīng)60 m3發(fā)酵罐放大實驗，酶活力水平提高達30%；該菌株應(yīng)用于生產(chǎn)后，在不增加投資成本的情況下可大幅降低單位酶生產(chǎn)成本達25%，從而降低纖維乙醇生產(chǎn)中酶的應(yīng)用成本，在推動纖維乙醇產(chǎn)業(yè)化的同時，相關(guān)酶制劑產(chǎn)品亦可應(yīng)用于食品、飼料、飲料、造紙等多個領(lǐng)域，目前正通過基因工程技術(shù)手段對SP1-523、SP2-801菌株DNA序列多態(tài)性等進行研究。

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